右美托咪定通過激活Nrf2/HO-1/GPX4 通路抑制腎小管上皮細(xì)胞的鐵死亡

摘要：目的 探討右美托咪定（DEX）對(duì)Erastin誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）鐵死亡的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 構(gòu)建Erastin誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞鐵死亡模型。將HK-2 細(xì)胞分為對(duì)照組、Erastin 模型組、Erastin+2.5 μmol/L DEX組、Erastin+5 μmol/L DEX組、Erastin+10 μmol/L DEX組，采用CCK-8法檢測細(xì)胞的存活率。將HK-2細(xì)胞分為對(duì)照組 、Erastin模型組、Erastin+10 μmol/LDEX組、Erastin+10 μmol/L DEX+ML385（Nrf2 抑制劑）組。采用CCK-8 法檢測細(xì)胞的存活率；使用細(xì)胞亞鐵比色法測試盒檢測細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平的變化；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的含量；使用丙二醛（MDA）和還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒檢測細(xì)胞中MDA及GSH含量；Western blotting 檢測細(xì)胞中核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）、血紅素加氧酶-1（HO-1）、谷胱甘肽過氧化物酶 4（GPX4）蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組相比，Erastin 組的細(xì)胞存活率顯著被抑制（Plt;0.001），同時(shí)細(xì)胞中GSH含量降低（Plt;0.001），F(xiàn)e2+、ROS以及MDA含量升高（Plt;0.001）；與Erastin組相比，Erastin+10 μmol/L DEX組的細(xì)胞存活率明顯升高（Plt;0.001），10 μmol/L DEX顯著升高細(xì)胞中GSH含量（Plt;0.001），顯著降低Fe2+、ROS以及MDA含量（Plt;0.001），并且顯著上調(diào)細(xì)胞中Nrf2、HO-1和GPX4蛋白的表達(dá)（Plt;0.001）。使用ML385后，Nrf2/HO-1/GPX4通路被抑制（Plt;0.001），細(xì)胞存活率降低（Plt;0.001），GSH含量降低（Plt;0.001），而Fe2+、ROS以及MDA含量升高（Plt;0.05）。結(jié)論 DEX對(duì)Erastin 誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞鐵死亡具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過激活Nrf2/HO-1/GPX4通路實(shí)現(xiàn)抗氧化應(yīng)激從而抑制鐵死亡。

關(guān)鍵詞：右美托咪定；Erastin；人腎小管上皮細(xì)胞；鐵死亡；Nrf2/HO-1/GPX4

腎小管上皮細(xì)胞鐵死亡發(fā)生于急性腎損傷、腎缺血/再灌注損傷、糖尿病腎病和腎臟纖維化等多種腎臟疾病的病程中［1-4］，因此靶向調(diào)控鐵死亡的策略將為防治上述腎臟疾病提供新的思路。鐵死亡是一種新型的細(xì)胞程序性死亡方式，是由于依賴鐵離子的脂質(zhì)過氧化物的過量產(chǎn)生而發(fā)生的［5， 6］，其主要特征為細(xì)胞內(nèi)鐵離子聚積、活性氧（ROS）增多和谷胱甘肽（GSH）耗竭［7，8］。核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）是細(xì)胞抗氧化的重要核轉(zhuǎn)錄因子，在氧化應(yīng)激條件下易位到細(xì)胞核，激活下游的血紅素加氧酶-1（HO-1）和谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4），通過影響脂質(zhì)過氧化的生成進(jìn)而調(diào)控鐵死亡［9-11］。

右美托咪定（DEX）是一種臨床麻醉輔助用藥，具有鎮(zhèn)靜、抗焦慮和鎮(zhèn)痛等作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，DEX可通過多種途徑發(fā)揮腎臟保護(hù)作用［12-14］。研究證實(shí)，DEX可通過抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡來減輕脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）損傷［15］。然而，對(duì)于DEX確切的腎臟保護(hù)作用機(jī)制還不夠清楚。DEX的腎臟保護(hù)作用與HK-2細(xì)胞鐵死亡之間是否存在關(guān)聯(lián)尚未有相關(guān)研究。因此，本研究將聚焦DEX對(duì)HK-2細(xì)胞鐵死亡的作用及其調(diào)控機(jī)制，通過構(gòu)建Erastin 誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞鐵死亡模型，觀察DEX對(duì)HK-2細(xì)胞鐵死亡的保護(hù)作用，并以Nrf2/HO-1/GPX4抗氧化途徑為切入點(diǎn)探討其作用機(jī)制，為臨床上腎臟疾病的治療提供新的思路和靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞HK-2（武漢賽維爾生物科技有限公司）。

1.1.2 主要試劑

鹽酸右美托咪定注射液（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；Erastin、ML385（MCE）；細(xì)胞亞鐵比色法測試盒（Elabscience）；活性氧檢測試劑盒（碧云天）；丙二醛檢測試劑盒（賽維爾）；還原型谷胱甘肽測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Nrf2、HO-1、β-actin 抗體（碧云天）；GPX4抗體（Proteintech）。

1.1.3 主要儀器

高速冷凍離心機(jī)（艾本德）；二氧化碳培養(yǎng)箱（PHCbi）；酶標(biāo)儀（Bio Tek）；流式細(xì)胞儀（BD）；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HK-2 細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS 的MEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 構(gòu)建HK-2 細(xì)胞鐵死亡模型

HK-2 細(xì)胞按6000/孔接種于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞完全貼壁后，向每孔加入鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin 終濃度為2.5、5、7.5、10 μmol/L的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。處理24 h 后，棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入含10% CCK-8的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h后使用酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm處吸光度，計(jì)算各組細(xì)胞存活率，以確定Erastin最佳的造模濃度。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組

將HK-2細(xì)胞分為5組：對(duì)照組、Erastin模型組、Erastin+2.5 μmol/L DEX組、Erastin+5 μmol/LDEX組、Erastin+10 μmol/L DEX組，DEX預(yù)處理2 h，再加入5 μmol/L Erastin 誘導(dǎo)24 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；再將HK-2細(xì)胞分為4組：對(duì)照組、Erastin模型組、Erastin+10 μmol/L DEX 組、Erastin+10 μmol/L DEX+ML385組，用2 μmol/L ML385 預(yù)處理1 h，10 μmol/L DEX預(yù)處理2 h，再加入5 μmol/L Erastin誘導(dǎo)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 CCK8 法檢測細(xì)胞存活率

HK-2 細(xì)胞接種于96孔板中，分組給藥處理后，每孔加入含10% CCK-8的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h后使用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度，計(jì)算各組細(xì)胞存活率。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)Fe2+的檢測

HK-2 細(xì)胞接種于6 孔板中，分組給藥處理后，消化并收集細(xì)胞，按照細(xì)胞亞鐵比色法測試盒說明書中的操作于593 nm處檢測吸光度，計(jì)算各組細(xì)胞內(nèi)Fe2+的含量。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測

HK-2細(xì)胞接種于6孔板中，分組給藥處理后，加入DCFH-DA熒光探針，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min后，棄舊培養(yǎng)液，消化并收集細(xì)胞，隨后用300 μL PBS重懸，最后將重懸液通過流式細(xì)胞儀檢測，并收集數(shù)據(jù)。

1.2.7 細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH的檢測

細(xì)胞接種于6 孔板中，分組給藥處理后，消化并收集細(xì)胞，按照MDA、GSH檢測試劑盒說明書中的操作于532 nm、405 nm處檢測吸光度，計(jì)算各組細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH的含量。

1.2.8 Western blotting 法檢測蛋白表達(dá)

細(xì)胞接種于6孔板中，分組給藥處理后，消化并收集細(xì)胞，使用裂解液提取細(xì)胞蛋白并定量，蛋白經(jīng)高溫變性后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、4 ℃孵育一抗過夜（Nrf2、HO-1、GPX4、β-actin抗體稀釋比例均為1∶2000），洗膜后室溫孵育二抗2 h，再次洗膜，隨后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，并采用ImageJ軟件分析各組蛋白的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEX對(duì)Erastin處理后HK-2細(xì)胞存活率的影響

隨著Erastin 濃度梯度升高，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)梯度降低（Plt;0.001），當(dāng)Erastin 濃度為5 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率降至50%左右（圖1A），因此選取Erastin最佳造模濃度為5 μmol/L。為探究DEX對(duì)Erastin誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞鐵死亡的抑制作用，不同濃度DEX（2.5、5、10 μmol/L）預(yù)處理2 h后加入5 μmol/L Erastin，數(shù)據(jù)表明，低、中、高濃度的DEX處理后HK-2細(xì)胞存活率相較于Erastin組均有不同程度的升高，且10 μmol/L DEX組的HK-2細(xì)胞存活率升高最為明顯（Plt;0.001），所以選擇10 μmol/L的DEX用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖1B）。在10 μmol/L DEX的基礎(chǔ)上使用Nrf2 抑制劑ML385，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ML385 使HK-2 細(xì)胞存活率較10 μmol/L DEX組降低（Plt;0.001，圖1C），逆轉(zhuǎn)了DEX對(duì)HK-2細(xì)胞的保護(hù)作用。

2.2 DEX對(duì)Erastin處理后HK-2細(xì)胞中Fe2+的影響

與對(duì)照組相較，Erastin 組細(xì)胞內(nèi)Fe2+含量增加（Plt;0.001）；與Erastin組相較，10 μmol/L DEX使細(xì)胞內(nèi)Fe2+含量明顯降低（Plt;0.001）；在10 μmol/L DEX的基礎(chǔ)上增加Nrf2 抑制劑ML385，數(shù)據(jù)表明，ML385 使細(xì)胞內(nèi)Fe2+含量較10 μmol/L DEX組升高（Plt;0.05，圖2）。

2.3 DEX對(duì)Erastin 處理后HK-2 細(xì)胞中Nrf2、HO-1 和GPX4蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相較，Erastin組HK-2細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1和GPX4 蛋白的表達(dá)降低（Plt;0.01）；而與Erastin 組相比，10 μmol/L DEX處理組Nrf2、HO-1和GPX4蛋白的表達(dá)顯著升高（Plt;0.001）；而使用Nrf2 抑制劑ML385后，Nrf2/HO-1/GPX4通路被抑制，Nrf2、HO-1和GPX4蛋白的表達(dá)降低（Plt;0.001，圖3）。

2.4 DEX對(duì)Erastin處理后HK-2細(xì)胞中ROS的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS 含量，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相較，Erastin 組細(xì)胞內(nèi)ROS 的含量升高（Plt;0.001）；DEX 可以減弱Erastin 損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS 生成（Plt;0.001）；而在使用Nrf2 抑制劑ML385后，細(xì)胞內(nèi)ROS 的含量升高（Plt;0.001，圖4）。

2.5 DEX對(duì)Erastin 處理后HK-2 細(xì)胞中MDA和GSH的影響

與對(duì)照組相較，Erastin組細(xì)胞內(nèi)MDA的含量升高（Plt;0.001，圖5A），GSH的含量則降低（Plt;0.001，圖5B）；與Erastin 組相比，DEX使細(xì)胞內(nèi)MDA的含量明顯降低（Plt;0.001，圖5A），GSH的含量明顯升高（Plt;0.001，圖5B）；而在DEX 的基礎(chǔ)上加用Nrf2 抑制劑ML385后，細(xì)胞內(nèi)MDA的含量升高（Plt;0.05，圖5A），GSH的含量則降低（Plt;0.001，圖5B）。

3 討論

近期研究表明，鐵死亡與多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［16-18］，因此，早期干預(yù)鐵死亡的發(fā)生，對(duì)腎臟病程的截?cái)嗑哂兄匾囊饬x。DEX可通過抗氧化應(yīng)激、抗炎和抑制細(xì)胞凋亡等多種途徑發(fā)揮腎臟保護(hù)作用［19， 20］。有文獻(xiàn)報(bào)道，DEX對(duì)腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與其抑制鐵死亡有關(guān)［21］。目前關(guān)于DEX對(duì)腎臟疾病的保護(hù)作用的研究愈發(fā)深入，但DEX對(duì)Erastin誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞鐵死亡是否具有保護(hù)作用尚不清楚。為了探究DEX對(duì)HK-2 細(xì)胞鐵死亡的保護(hù)作用，我們采用CCK-8法檢測不同濃度的DEX對(duì)Erastin處理后HK-2細(xì)胞存活率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的DEX均能增加Erastin處理后的HK-2細(xì)胞存活率，說明DEX能夠減輕HK-2細(xì)胞鐵死亡。加用ML385后，細(xì)胞存活率降低，這表明DEX抗HK-2細(xì)胞鐵死亡的作用可能與其激活Nrf2有關(guān)。

當(dāng)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡時(shí)，鐵穩(wěn)態(tài)的失衡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的增加［22］。細(xì)胞內(nèi)過量的鐵通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生大量ROS，致使細(xì)胞膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生大量脂質(zhì)過氧化物。其次，鐵參與脂氧合酶（LOX）的激活，LOX是含鐵酶，可促進(jìn)脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生［23， 24］。細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致細(xì)胞和線粒體膜損傷和破裂，最終導(dǎo)致鐵死亡［25］。另一方面，GSH是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化劑。GPX4是使用GSH作為還原底物的脂質(zhì)過氧化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，GPX4可以將脂質(zhì)過氧化物還原為脂質(zhì)醇，從而減輕鐵死亡［23， 24］。Erastin誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞發(fā)生鐵死亡后，細(xì)胞內(nèi)鐵累積、GSH耗竭以及GPX4活性下降，細(xì)胞抗氧化能力降低，致使脂質(zhì)過氧化與代謝功能障礙，ROS和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）大量累積。有文獻(xiàn)指出，DEX對(duì)腎臟的保護(hù)作用與其抗氧化的能力有關(guān)［26］。本研究發(fā)現(xiàn)，DEX可以降低Erastin處理后HK-2細(xì)胞內(nèi)Fe2+的含量，提高細(xì)胞內(nèi)GSH的含量以及GPX4蛋白的表達(dá)，使用DEX增強(qiáng)了細(xì)胞的抗氧化能力，致使脂質(zhì)過氧化物的分解增加，細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA的含量均下降。

Nrf2的激活在抑制鐵死亡的過程中發(fā)揮著重要作用，Nrf2是細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄調(diào)控與鐵死亡相關(guān)的下游基因HO-1、GPX4 等的表達(dá)［27， 28］。有文獻(xiàn)報(bào)道，通過激活Nrf2 抑制鐵死亡不僅可以延緩糖尿病腎病的進(jìn)展，還能夠減輕葉酸或順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷［29-31］。本研究發(fā)現(xiàn)，DEX可以提高Erastin處理后HK-2細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)，而Nrf2進(jìn)一步激活鐵死亡相關(guān)蛋白HO-1、GPX4 的表達(dá)，從而抑制Erastin 誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。為了進(jìn)一步探究Nrf2/HO-1/GPX4 通路是否參與了DEX對(duì)HK-2 細(xì)胞鐵死亡的保護(hù)作用，我們加用了Nrf2抑制劑ML385。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Nrf2/HO-1/GPX4 通路的激活被抑制，細(xì)胞抗氧化能力降低，細(xì)胞內(nèi)Fe2+和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的含量增加，表明Nrf2/HO-1/GPX4通路的抑制降低了DEX對(duì)HK-2細(xì)胞鐵死亡的保護(hù)作用。

綜上所述，DEX對(duì)Erastin 誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞鐵死亡具有抑制作用，其機(jī)制可能是通過激活Nrf2/HO-1/GPX4通路抑制HK-2細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。本研究為DEX減輕HK-2細(xì)胞鐵死亡的作用提供了一定的實(shí)驗(yàn)支撐，為臨床上合理使用 DEX 提供了新的理論依據(jù)。后續(xù)研究將通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證DEX通過調(diào)控鐵死亡治療腎臟疾病的藥效與機(jī)制。

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（編輯：經(jīng) 媛）

基金項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目基金（KJ2021A0785）；蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目基金支持（Byycx22100）