澳洲茄堿通過調控Bcl-2/Bax/caspase-3 信號通路促進非小細胞肺癌發(fā)生凋亡

摘要：目的 探討龍葵活性成分澳洲茄堿對非小細胞肺癌細胞PC9 增殖、凋亡的影響。方法 體外培養(yǎng)PC9 細胞，設對照組（0 μmol/L）及澳洲茄堿不同劑量組（0、2、5、10、15、20、25 μmol/L），CCK-8 試劑盒檢測澳洲茄堿對PC9 細胞的增殖抑制作用；TMRE 檢測線粒膜電位；caspase3/7 活性試劑盒聯合GreenNuc ? Caspase-3/Annexin V-mCherry 染色檢測caspase-3 活性；Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測細胞凋亡率；給藥處理或者使用PTEN抑制劑后，Western blot 檢測細胞中相關蛋白的表達量。結果 與對照組相比，經澳洲茄堿干預24、48、72 h后，PC9細胞的活力均明顯降低（Plt;0.05）；經澳洲茄堿干預24 h后，細胞線粒體膜電位明顯降低，而細胞凋亡比例明顯升高（Plt;0.05）；caspase-3/7活力、活細胞Caspase-3活性及cleaved caspase-3蛋白表達均顯著升高（Plt;0.01）；PI3K和Akt磷酸化水平降低（Plt;0.05）；而PTEN、Bax蛋白表達上調（Plt;0.05）；抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達下調（Plt;0.05）。結論 澳洲茄堿可通過調控Bcl-2/Bax/caspase-3通路及其上游蛋白活性而抑制PC9細胞增殖，促進其凋亡。

關鍵詞：澳洲茄堿；肺癌；Bcl-2/Bax/caspase-3 通路；同源性磷酸酶-張力蛋白；細胞凋亡

全球肺癌的新發(fā)病率及死亡率高居惡性腫瘤榜首［1， 2］。多數肺癌患者確診時已屬中晚期，癌細胞已經發(fā)生侵襲轉移，失去手術根除治療的機會，而非手術治療（放療、化療、靶向治療、免疫治療）普遍存在其病理類型的局限性，如放療/化療抵抗、耐藥、毒副作用明顯等。因此，我們需要探索促進肺癌發(fā)生、侵襲轉移的非特異性分子機制，確定新的臨床治療靶點，提高治療中晚期肺癌患者的治療效率。

龍葵是重要的抗癌藥物，別名苦葵、山辣椒、天茄子等，在我國各地均有分布。文獻報道表明，龍葵具有較廣泛、效果較明顯的抑制腫瘤生長的作用，龍葵主要抑瘤活性成分有生物堿、多糖、糖蛋白等，龍葵所含的這三類物質在抗腫瘤方面都有較多的研究，其中較有前景的是其生物堿。澳洲茄堿（SS，C45H73O16N）是龍葵的主要活性成分之一，屬于甾體生物堿中的膽甾烷衍生物［3， 4］，其水解后分解出苷元澳洲茄胺，進而發(fā)揮化學活性，具有明確的抗腫瘤作用［5， 6］。既往研究表明［7-14］，澳洲茄堿對不同腫瘤細胞系，如小鼠黑色素瘤（B16F10），人結腸癌（HT29），人乳腺癌（MCF-7），人宮頸腺癌（HeLa），人肝細胞肝癌（HepG2）和人膠質母細胞瘤（MO59J，U343和U251）、人非小細胞肺癌（A549、Calu-1）具有明顯的抗增殖作用。然而，澳洲茄堿在肺癌治療中的效果及其分子機制研究仍有欠缺。

PI3K/Akt 通路的持續(xù)活化，在肺癌及其他腫瘤細胞的增殖和凋亡中，起到了至關重要的作用［15］。PTEN是一種抑癌基因，負反饋調節(jié)PI3K/Akt通路活性［16， 17］。caspase-3 是細胞凋亡途徑的關鍵執(zhí)行者，cleavedcaspase-3 是其活化狀態(tài)，介導細胞凋亡。Bcl-2 和Bax是Bcl-2蛋白家族的兩個重要成員，在細胞凋亡中起關鍵作用。Bcl-2 是一種抗凋亡蛋白，抑制caspase-3 活化；而Bax是一種促凋亡蛋白，促進caspase-3活化［18， 19］。最近研究發(fā)現［13］，澳洲茄堿可能通過抑制caspase-3 通路，進而誘導A549細胞凋亡，但具體分子機制尚未做深入研究。由此，本實驗擬從PI3K/Akt信號通路及其上下游因子出發(fā)，探討澳洲茄堿對肺癌PC9細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞

人肺腺癌細胞PC9由廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院李龍妹博士贈送。PC9，貼壁細胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗（100 μg/mL 鏈霉素、100 U/L青霉素）的DMEM基礎培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2。當細胞匯合度為80%～90%時進行傳代或鋪板。

1.1.2 藥物

澳洲茄堿（純度≥98.98%，上海陶素生化科技，分子式為C45H73NO16，相對分子質量為884.07），凍干粉狀態(tài)下-20 ℃冰箱保存。藥物儲存液制備：采用細胞級DMSO 將澳洲茄堿粉末10 mg 溶解，制備成50 mmol/L儲存液，分裝后-20℃保存?zhèn)溆茫瑢嶒灂r采用完全培養(yǎng)基將其稀釋為實驗所需的藥物濃度。

1.1.3 主要試劑

DMEM基礎培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶（Gibco）；磷酸鹽緩沖液（PBS，HyClone）；預染蛋白Marker、BCA蛋白檢測試劑盒（Thermo）；線粒體膜電位檢測試劑盒（TMRE）、GreenNuc?活細胞caspase-3活性檢測試劑盒（碧云天）；caspase-3/7 活力檢測試劑盒（Promega）；CCK8 試劑盒（翌圣）；Annexin V-FITC/PI（聯科生物）；cleaved caspase-3、PTEN、PI3Kp85、p-PI3Kp85、Akt、p-Akt、Bcl2、Bax、GAPDH抗體、蛋白上樣緩沖液、總蛋白裂解液（CST）；發(fā)光液、PVDF 膜（Millipore）；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑（Roche）。

1.1.4 主要儀器

生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Sanyo）；全自動細胞計數儀（Inno-Aliance）；常溫離心機（京立離心機）；多功能酶標儀（BioTek）；冷凍離心機（Eppendorf）；流式細胞儀（BD）；高靈敏化學發(fā)光成像儀、垂直電泳系統、半干轉印槽轉膜儀（Bio-Rad）；全自動倒置熒光顯微分析系統（Nikon）。

1.2 實驗方法

1.2.1 CCK8 法檢測澳洲茄堿對PC9 細胞活力的影響

收集處于對數生長期的PC9細胞，按5×103/孔的標準接種于96孔細胞板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，分組進行給藥處理，SS濃度為：0、2、5、10、15、20、25 μmol/L，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24、48 和72 h。藥物作用后，吸去舊培養(yǎng)液，加入含10%（體積分數）CCK8溶液的新培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)箱避光孵育2 h，用酶標儀在450 nm波長下檢測各孔吸光值（A），取各復孔平均值，按照以下公式計算細胞活力，繪制PC9細胞在不同濃度SS作用24、48、72 h后的生長曲線并計算出IC50。

細胞活率=（A加藥組- A空白組／A對照組- A空白組）× 100%

1.2.2 線粒體膜電位檢測

取適量TMRE （×1000），按照每1 μL TMRE（×1000）加入1 mL 檢測緩沖液的比例稀釋TMRE，混勻后即為TMRE染色工作液。分別收集對照組和經15 μmol/L 澳洲茄堿作用24 h的細胞，1000 r/min離心3 min，PBS洗滌1次后加入1 mL TMRE染色工作液，混勻后于細胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，棄上清，用預熱的細胞培養(yǎng)液洗滌2次，加入1 mL預熱的細胞培養(yǎng)液，置于熒光顯微鏡下觀察橘紅色熒光強度，并拍照保存。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

收集對數生長期細胞，按細胞濃度2×105/孔接種于6孔板，待細胞貼壁，分為對照組（不加澳洲茄堿）和給藥組（澳洲茄堿濃度為15 μmol/L），繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h。藥物處理完畢后，收集細胞并根據細胞凋亡試劑盒（聯科生物）說明書對各組細胞進行PI染色，繼而使用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.4 Caspase-3/7活力檢測

按細胞濃度2×104/0.1 mL/孔接種于96孔板中，細胞貼壁后，分為對照組（澳洲茄堿濃度為0 μmol/L ）和給藥組（澳洲茄堿濃度為10、15、20 μmol/L組），常規(guī)培養(yǎng)24 h，加入Apo-ONE caspase-3/7混合液100 μL，常溫避光孵育1 h，采用多功能酶標儀檢測，記錄并計算活力。

1.2.5 活細胞caspase-3 活性的原位熒光顯微鏡檢測

按細胞濃度1×105/孔接種于12 孔板，貼壁后，對照組和經15 μmol/L 澳洲茄堿作用24 h 的細胞，每孔先加入194 μL Annexin V-mCherry Binding Buffer，再加入5 μL Annexin V-mCherry和1 μL GreenNuc?Caspase-3Substrate（ 1 mmol/L），輕輕混勻，室溫避光孵育30 min，隨即在熒光顯微鏡下觀察，拍照并處理圖像。

1.2.6 Western blotting法檢測澳洲茄堿對PC9細胞蛋白表達的影響

取對數生長期的PC9 細胞以2×105/孔接種于6孔板，待細胞貼壁后，分組給藥，藥物處理24 h后收集細胞，冰上操作，加入含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的裂解液提取總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液并混勻，加熱變性，-80 ℃保存。每組樣品取25 μg總蛋白上樣，80 V電泳20 min后110 V電泳50 min，20 V半干轉45 min，用5%脫脂牛奶封閉1 h，洗去封閉液，加入對應蛋白一抗，4 ℃孵育過夜，第2天以TBST洗滌3次后，加入二抗室溫孵育1 h，顯影成像。

1.2.6 統計學方法

所有實驗均至少重復3 次，采用SPSS 23.0進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，當滿足正態(tài)性及方差齊性時，采用單因素方差分析；若不滿足正態(tài)性或方差齊性時，采用非參數檢驗。當Plt;0.05 時認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 澳洲茄堿對PC9細胞增殖的抑制作用

CCK8 實驗結果顯示，與對照組相比，澳洲茄堿組PC9細胞活力明顯下降并呈劑量和時間依賴性：澳洲茄堿作用于細胞24 h后，從給藥濃度10 μmol/L起，細胞活力的差異具有統計學意義（Plt;0.05），且隨濃度的增大而逐漸降低；而澳洲茄堿干預細胞48 h 及72 h 后，從給藥濃度為2 μmol/L起，細胞活力的差異具有統計學意義（Plt;0.05），且隨濃度的增大而逐漸降低（圖1）。經計算，澳洲茄堿對PC9 細胞24、48、72 h 的IC50 分別為21.72、14.60、11.90 μmol/L。

2.2 澳洲茄堿對PC9細胞線粒體膜電位的影響

熒光顯微鏡下，與對照組相比，經澳洲茄堿（15 μmol/L）作用24 h后，澳洲茄堿組細胞橘紅色熒光強度明顯減弱，幾乎完全消失（圖2）。

2.3 澳洲茄堿對PC9細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI 流式細胞術檢測結果顯示，與對照組相比，澳洲茄堿各組（10、15、20 μmol/L）細胞早期凋亡比率均增加，且隨著藥物濃度增加而升高，差異均有統計學意義（Plt;0.05，圖3）。

2.4 澳洲茄堿對PC9 細胞cleaved caspase-3 蛋白、caspase-3/7活力和caspase-3活性的影響

Western blotting實驗結果顯示，與對照組相比，澳洲茄堿各組（5、10、15、20 和25 μmol/L）中PC9 細胞的cleaved caspase-3蛋白表達明顯上調，差異均有統計學意義（Plt;0.05），且隨著給藥濃度的增大，cleaved caspase-3蛋白表達量呈明顯上調趨勢（圖4A、B）。caspase-3/7活性試劑盒檢測結果顯示，與對照組相比，澳洲茄堿各組（10、15、20 μmol/L）中PC9細胞的caspase-3/7活力明顯升高，差異均有統計學意義（Plt;0.05），且隨著藥物濃度增大而逐漸降低（圖4C）。同時GreenNuc ? caspase-3/Annexin V-mCherry雙染結果顯示，對照組細胞不會被GreenNuc?和Annexin V-mCherry所染色。澳洲茄堿處理24 h后，PC9細胞內caspase-3活性高的凋亡細胞核呈明亮的綠色熒光，凋亡細胞的細胞膜顯示紅色熒光（圖5）。

2.5 澳洲茄堿對PC9細胞中Bcl-2、Bax蛋白表達水平的影響

Western blotting結果顯示，與對照組相比，澳洲茄堿15、20和25 μmol/L組中PC9細胞的Bcl-2蛋白表達明顯下調，而澳洲茄堿20和25 μmol/L組細胞Bax蛋白表達明顯上調，差異均有統計學意義（Plt;0.05）；且隨著給藥濃度的增大，Bcl-2 蛋白表達量呈明顯下降趨勢，Bax蛋白表達量呈明顯上升趨勢（圖6）。

2.6 澳洲茄堿對PC9細胞中PI3K、Akt蛋白磷酸化水平的影響

澳洲茄堿作用4 h 可抑制PI3K 和Akt 的磷酸化（p-PI3K、p-Akt蛋白表達減低），且隨著時間的推移抑制作用越明顯；與空白對照組相比，澳洲茄堿作用細胞12、24 h后，細胞中p-PI3K、p-Akt 的表達量差異具有統計學意義（Plt;0.05，圖7）。

2.7 澳洲茄堿對PC9 細胞中PTEN 蛋白表達水平的影響

藥物作用24 h后，澳洲茄堿15、20和25 μmol/L組中PC9細胞的PTEN蛋白表達明顯上調，差異有統計學意義（Plt;0.05），且隨給藥液濃度的增大，PTEN蛋白表達逐漸升高；這種上調趨勢可被PTEN 蛋白抑制劑SF1670逆轉（圖8）。

3 討論

肺癌仍是我國乃至世界范圍內癌癥相關性死亡的首要原因［1，2］，尋找行之有效的治療手段及治療靶點是非常必要的。澳洲茄堿已被證實可以通過線粒體介導的凋亡等不同方式對不同腫瘤類型具有抑制增殖、促進凋亡的作用［4-14，19-21］。在本研究中，以人肺腺癌細胞系PC9作為研究對象，澳洲茄堿作為作為治療藥物，探索了澳洲茄堿在肺癌治療中的潛力及相關機制。本研究結果顯示，澳洲茄堿顯著抑制PC9細胞的增殖，且呈劑量依賴性及時間依賴性，對PC9細胞24、48、72 h的IC50分別為21.72、14.60、11.90 μmol/L；且與對照組相比，澳洲茄堿組細胞線粒體膜電位水平顯著降低，細胞凋亡比例顯著升高。以上結果與既往研究結果一致［13， 14， 22］，進一步驗證了澳洲茄堿可以通過線粒體介導的凋亡促進癌細胞凋亡，抑制其增殖的結論。

Bcl-2/Bax/caspase-3 信號通路與細胞的凋亡過程密切相關［23， 24］在癌細胞中，高表達的Bcl-2 與Bax 形成異源二聚體，抑制下游caspase-3的激活，抵抗細胞凋亡的發(fā)生［25］。李龍妹等［13］研究顯示，澳洲茄堿可明顯抑制肺腺癌細胞A549 中p65、Bcl-2 蛋白表達，并增強Bik、Bak 蛋白表達，降低pro caspase-3 水平，從而推測澳洲茄堿通過激活caspase-3 通路誘導A549 細胞凋亡。此外，Zeng等［14］研究顯示，澳洲茄堿引起肺腺癌細胞A549和Calu-1 中鐵死亡和線粒體氧化應激誘導細胞凋亡。本研究結果顯示，澳洲茄堿作用于PC9 細胞后，Bax 和cleaved caspase-3蛋白表達顯著上調，且caspase-3/7活力及caspase-3活性同樣明顯升高，而Bcl-2蛋白表達顯著下調，且呈現濃度依賴性，對李龍妹等和Zeng等關于澳洲茄堿通過激活caspase-3通路或線粒體相關途徑誘導肺癌細胞凋亡的結論進行了細胞類型上的驗證和補充，增加了澳洲茄堿抑制肺癌的普遍性。因此我們推測澳洲茄堿對PC9細胞的增殖抑制、凋亡誘導可能通過調控Bcl-2/Bax/caspase-3通路發(fā)揮抑癌作用。

多項研究表明PI3K/Akt/Bax信號通路的調控是多種藥物抑制肺癌細胞增殖生長的關鍵［26-29］。Akt 易被PI3K的活化產物PIP3 激活，在蘇氨酸308 位點或絲氨酸473 位點發(fā)生磷酸化，直接抑制促凋亡蛋白Bax 表達，抵抗細胞凋亡進程［15］。我們推測，澳洲茄堿對PC9細胞中Bax 的上調與PI3K/Akt 通路活性有關。Western blot實驗結果顯示，澳洲茄堿可以顯著抑制p-PI3K、p-Akt蛋白磷酸化，呈時間依賴性，與我們的預期相符。PTEN是PI3K/Akt通路中重要的負調控因子，可下調PI3K/Akt通路活性而抑制腫瘤細胞生長，促進腫瘤細胞凋亡［16］。本研究結果顯示，澳洲茄堿劑量依賴性激活PTEN蛋白表達，但這種作用可以被PTEN抑制劑SF1670抵消。綜上，澳洲茄堿可能通過上調抑癌基因PTEN的蛋白表達，從而負調節(jié)PI3K/Akt通路活性，誘導細胞凋亡。

綜上所述，澳洲茄堿確切可以抑制肺腺癌細胞增殖、誘導凋亡。具體可能通過上調PTEN蛋白表達，抑制PI3K/Akt 信號通路的活化，解除Bcl-2 與Bax 的結合，激活caspase-3，進而誘導PC9細胞凋亡，為中草藥龍葵治療肺癌的機制研究中提供了新的思路。本研究尚存在著一定不足：本實驗僅進行了細胞層面的實驗，未進行動物層面的研究，下一步將構建實驗動物模型，進一步確認澳洲茄堿對肺癌的生長抑制作用。此外，在文獻中已明確澳洲茄堿可通過不同途徑抑制肺癌細胞A549和Calu-1（含H-ras癌基因），而本研究證實澳洲茄堿也可抑制肺癌細胞PC9（EGFR突變型），可見澳洲茄堿針對肺癌的抑制效應具有普遍性。接下來我們將研究澳洲茄堿對肺癌細胞EGFR-TKI藥物的原發(fā)性及獲得性耐藥是否具有增效減毒作用。

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（編輯：經 媛）

基金項目：國家自然科學基金青年項目（82104456）；中國博士后基金資助項目（2020M672745）；廣州市科技計劃項目（202102020205）；廣東省中醫(yī)藥局中醫(yī)藥科研項目（20244026）