川芎增強替莫唑胺對小鼠腦轉(zhuǎn)移黑色素瘤腦的抑制作用

摘要：目的 探討引經(jīng)藥川芎對黑色素瘤B16F10 腦轉(zhuǎn)移的影響。方法 超聲下左心室內(nèi)注射黑色素瘤B16F10 建立C57BL/6J鼠腦轉(zhuǎn)移瘤動物模型，通過小動物活體成像系統(tǒng)監(jiān)測顱內(nèi)熒光信號大小，當(dāng)熒光信號強于5×106 光子/s時，將小鼠按照體質(zhì)量隨機分為2組。對照組：每日灌胃生理鹽水；川芎組：每日灌胃給藥，川芎飲片水提物以生理鹽水溶解，濃度為1 mg/g。與對照組（生理鹽水組）相比，考察川芎（1 mg/g）對黑色素瘤B16F10腦轉(zhuǎn)移的影響。通過動物行為學(xué)立柱和粘簽實驗觀察川芎對荷瘤小鼠的神經(jīng)保護作用，以免疫熒光法觀察川芎對血腦屏障完整性相關(guān)蛋白（ZO-1、Claudin-5、Occludin、P-gp、 TNF-α、AQP4 和PDGFRβ）、對神經(jīng)元細胞增殖和凋亡的作用以及對小膠質(zhì)細胞凋亡和活化的作用。通過小動物活體成像監(jiān)測小鼠腦部熒光信號強度，考察川芎聯(lián)合化療藥替莫唑胺對B16F10腦轉(zhuǎn)移瘤的療效。結(jié)果 與對照組比較，川芎組小鼠腦轉(zhuǎn)移瘤無明顯進展，體質(zhì)量下降減慢，血腦屏障相關(guān)指標(biāo)ZO-1、Claudin-5、Occludin、P-gp、TNF-α、AQP4 和PDGFRβ 受體蛋白水平下降（Plt;0.05）。動物行為學(xué)實驗表明，川芎組小鼠木棍停留時間更長（Plt;0.05），取下粘簽時間更短（Plt;0.05），免疫熒光結(jié)果顯示腦部神經(jīng)元細胞增殖增多（Plt;0.05），凋亡減少（Plt;0.05），小膠質(zhì)細胞凋亡減少（Plt;0.05）。與對照組相比，川芎組小鼠腦轉(zhuǎn)移瘤微環(huán)境中CD86、CD206、IL-4、IL-10水平升高（Plt;0.05），CD163、IL-1β水平降低（Plt;0.05）。川芎（1 mg/g）聯(lián)合替莫唑胺（25 mg/kg）組腦部熒光信號顯著低于替莫唑胺單藥組。結(jié)論 川芎作為引經(jīng)藥在開放血腦屏障的同時并未促進黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移，且與替莫唑胺聯(lián)用能增強替莫唑胺對腦轉(zhuǎn)移黑色素瘤B16F10的治療效果。

關(guān)鍵詞：川芎；替莫唑胺；黑色素瘤；血腦屏障；腦轉(zhuǎn)移

據(jù)國家癌癥中心最新報告，僅2016 年，我國有近400萬新發(fā)癌癥病例，約240萬患者死亡［1］，轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要原因［2］。隨著醫(yī)療水平的提升，癌癥患者帶瘤生存時間延長，越來越多的癌癥患者最終會發(fā)生腦轉(zhuǎn)移。血腦屏障可限制中樞與外周間物質(zhì)交換［3， 4］，加之腦組織功能的特殊性，以目前的治療手段難以有效抑制顱內(nèi)腫瘤進展［5］。

顱內(nèi)腫瘤為髓海之病，邪惡凝聚于腦。中醫(yī)認為，腦病位于華蓋之上，以引經(jīng)藥為向?qū)В?使藥力直達病所為治療的關(guān)鍵［6， 7］，中醫(yī)引經(jīng)藥能引導(dǎo)其他藥物直達病所，提高藥物靶向性［8］，在臨床應(yīng)用中，曹正柳教授根據(jù)不同部位腫瘤選用不同引經(jīng)藥，如肺腫瘤用桔梗、鼻咽癌用辛夷、山豆根，胃腸腫瘤用敗醬草等［9］，以增強化療藥治療效果。川芎“引藥上行”的功效能增加配伍藥物在腦中的分布［10， 11］，使其成為腦部疾病常用引經(jīng)藥［12， 13］。與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究川芎能通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白開放血腦屏障而增加腦中藥物濃度結(jié)果一致［14］。由于血腦屏障限制抗腫瘤藥物進入腦組織而發(fā)揮治療效果，故臨床上常配伍川芎用于腦轉(zhuǎn)移瘤的治療［15-21］。然而，當(dāng)川芎用于腦轉(zhuǎn)移瘤患者時，其打開血腦屏障的同時是否會促進顱內(nèi)進展尚缺乏相關(guān)研究。

本研究以B16F10 黑色素瘤建立腦轉(zhuǎn)移動物模型，探索川芎對黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移的影響，及腫瘤存在時對血腦屏障的作用，聯(lián)合化療藥考察川芎用于治療腦轉(zhuǎn)移瘤的安全性，為臨床上運用川芎作為引經(jīng)藥輔助治療腦轉(zhuǎn)移瘤患者提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

鼠源皮膚黑色素瘤細胞株B16-F10-LUC（中橋新舟）培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基（中橋新舟），置于37 ℃、5 %CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。

1.1.2 動物

SPF級C57BL/6J小鼠，雄性，18～22 g，5周齡，由杭州子源實驗動物科技有限公司提供，合格證號：20221128Abzz0105000848，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝取食物與水源，在溫度為20～25 ℃下維持光照和黑暗各12 h，相對濕度為（50±5） %。本研究經(jīng)蚌埠醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心和倫理委員會批準(zhǔn)（審批號：倫動科批字［2022］第177號）。

1.1.3 主要試劑和儀器

主要試劑：川芎飲片（安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司，產(chǎn)地：四川彭州），經(jīng)蚌埠醫(yī)科大學(xué)李紅梅副教授鑒定為傘形科藁本屬植物川芎的干燥根莖。川芎水提物：稱取川芎飲片60 g，加300 g的水，浸泡30 min 后，冷凝回流提取2 次，第1 次35 min，第2次30 min。合并2次提取液，過濾。冷凍干燥后將藥液濃縮至含生藥0.2 g/mL，4 ℃冰箱內(nèi)存放備用。；胰酶消化液（Biosharp）、青霉素-鏈霉素（Biosharp）、RIPA裂解液（Biosharp）、DAPI染色試劑（即用型）（Biosharp）、4%多聚甲醛組織固定液（Biosharp）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（Beyotime） ； CCK-8 （APEBIO） ； ZO-1（Proteintech） 、TNF-alpha （Proteintech） 、PDGFReceptor β 抗體（Proteintech）、P-gp（Proteintech）、Claudin-5 （Proteintech） 、Occludin （Proteintech） 、Aquaporin 4（Proteintech）、CD163（Proteintech）、CD68（Proteintech）、CD86（Proteintech）、Mannose Receptor/CD206（Proteintech）、IL-1 beta（Proteintech）、IL-4（Proteintech）、IL-6（Proteintech）、IL-10（Proteintech）；Cleaved- Caspase-3 （Cell Signaling Technology） 、NeuroN（Cell Signaling Technology）、TMEM119（CellSignaling Technology，）；山羊抗兔IgG（Abcam）。主要儀器：恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Fisher）；Vevo2100小動物高分辨率超聲成像系統(tǒng)（VisualSonics）；FX-PRO小動物活體熒光成像系統(tǒng)（Zeiss）；AF100 制冰機（SCOTSMAN）；IX71倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

在培養(yǎng)瓶中加入3 mL新鮮DMEM完全培養(yǎng)液，打開恒溫水浴鍋并預(yù)熱至37 ℃。將從-80 ℃冰箱取出的細胞在水浴鍋中解凍后吸至5 mL離心管并離心（900 r/min，4 min），吸棄上清，以新鮮DMEM完全培養(yǎng)液吹打混勻，將含細胞的培養(yǎng)液加至預(yù)先加入3 mL新鮮DMEM完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，混勻并放置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 小鼠造模及分組給藥

取Luc標(biāo)記的處于對數(shù)生長期的黑色素瘤細胞B16F10，離心、計數(shù)，用PBS調(diào)整細胞密度為1×107/mL，用1 mL注射器吸取0.1 mL細胞懸液置于冰上備用。用異氟烷麻醉已提前備皮的小鼠并采取仰臥位固定，在超聲下依據(jù)心臟長軸找到左心室，用酒精擦拭小鼠脫毛部位消毒，在胸骨左側(cè)3 mm處第3肋間，與體表呈45 °進針，針尖沒入小鼠體內(nèi)3～5 mm，以能在小動物高分辨率超聲成像系統(tǒng)上看到一個明顯亮點，同時針尖處有紅色血柱涌入針管為順利進針左心室，緩慢勻速將B16F10細胞接種到左心室內(nèi)，短暫停留后慢慢拔出注射器，以棉簽按壓止血。種瘤7 d后根據(jù)熒光信號將小鼠隨機分組（20 只/組）并給藥，將川芎以生理鹽水溶解，制成濃度為1 mg/g的混懸液，灌胃給藥5 d，每只0.2 mL/d，空白對照 組小鼠灌胃等體積生理鹽水溶液。觀察川芎聯(lián)合替莫唑胺（25 mg/kg）治療效果時，對照組為溶劑，。

1.2.3 小動物活體成像系統(tǒng)評價黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移

將生理鹽水配制的D-熒光素鉀鹽溶液（15 mg/mL）以0.2 μm濾膜過濾除菌，置于冰上，避光保存?zhèn)溆?。小鼠按照體質(zhì)量計算，以10 μL/g的劑量對小鼠腹腔注射熒光素鉀鹽溶液，注射后讓小鼠自由活動15 min，然后以異氟烷氣體誘導(dǎo)麻醉，麻醉后迅速將小鼠置于活體成像系統(tǒng)內(nèi)曝光成像，通過生物發(fā)光的光子信號強度評價腦轉(zhuǎn)移瘤的生長狀況。

1.2.4 動物行為學(xué)實驗觀察川芎對荷瘤小鼠神經(jīng)損傷的保護作用

動物行為學(xué)包括粘簽實驗和立柱實驗。粘簽實驗又稱感覺不對稱試驗，用于評價小鼠皮膚敏感性和感覺功能。將富有粘性的方形膠布（0.3 cm×0.3 cm）貼于小鼠前爪無毛處，記錄小鼠撕下膠布的時間，以120 s為時間上限，超過120 s未撕下記錄為120 s。立柱實驗用于評估小鼠前肢抓握能力和運動協(xié)調(diào)能力。將一根長90 cm的木棍豎直固定在距離地面約40 cm的位置，木棍下方鼠籠裝有墊料，實驗時將小鼠頭部朝向同一個方向放置于木棍中央，分別記錄每只小鼠抓握和爬行所需時間，以60 s為時間上限，超過60 s未跌落記為60 s。動物行為學(xué)實驗均重復(fù)3 次，每次間隔1 h，結(jié)果取3次平均值。

1.2.5 免疫熒光染色

對照組與川芎組灌胃給藥后30 min，取腦組織在OCT包埋液中進行速凍，切片后置于37 ℃烘箱烘烤10～20 min，固定30 min后，用PBS洗滌3 次， 5 min/次。用組化筆畫圈，BSA封閉30 min。4 ℃下孵育一抗過夜，PBS洗滌3次，加對應(yīng)二抗，室溫下避光孵育50 min，PBS洗滌3 次，加DAPI 染液，室溫下避光孵育10 min，PBS洗滌3次，加自發(fā)熒光淬滅劑B液5 min，流水沖洗10 min，加入抗熒光淬滅封片劑封片。切片置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。各抗體稀釋比例：ZO-1（1∶1000）、TNF-α（1∶100）、PDGFRβ（1∶3000）、P-gp（1∶200）、Claudin-5（1∶300）、Occludin（1∶1000）、AQP4（1∶100）、TMEM119（1∶300）、NeuroN（1∶100）、Cleaved- Caspase-3（1∶400）、二抗（1∶1000）。

1.2.6 TUNEL染色

冷凍切片于37 ℃烘烤10～20 min，多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌3次，滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織，37 ℃孵育22 min后，PBS洗滌3次。滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20 min，PBS 洗滌3次。滴加buffer覆蓋組織，常溫孵育10 min。滴加tunel試劑覆蓋組織，放于濕盒內(nèi)，37 ℃孵育2 h，PBS 洗滌3次，滴加DAPI 染液，避光室溫孵育10 min，PBS洗滌3次，加入抗熒光淬滅封片劑封片。切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.7 免疫組化

冷凍切片于37 ℃烘烤10～20 min，甲醇固定20 min，PBS洗滌3次后置于3 %雙氧水溶液中室溫避光孵育25 min，PBS洗滌3次，3 %BSA室溫封閉30 min，PBS洗滌3次后加入一抗，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，滴加二抗，室溫孵育50 min，PBS洗滌3次，滴加新鮮配制的DAB顯色液，自來水沖洗切片終止顯色。蘇木素復(fù)染3 min，自來水洗，蘇木素分化液分化數(shù)秒，自來水沖洗，蘇木素返藍液返藍，流水沖洗。將切片依次放入75 %酒精、85 %酒精、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、正丁醇和二甲苯中各5 min 脫水，封片膠封片后于白光顯微鏡下觀察并采集圖像。各抗體稀釋比例：CD163（1∶2000）、CD68（1∶100）、CD86（1∶200）、CD206（1∶20000）、IL-1β（1∶100）、IL-4（1∶100）、IL-6（1∶100）、IL-10（1∶200）、二抗（1∶1000）。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

每組免疫組化結(jié)果選取6個低倍視野（×200），采用 ImageJ 軟件進行平均光密度值（OD值）分析，采用 Graphpad Prism 8.0.2 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間采用LSD-t檢驗，多組間采用單因素方差分析，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 川芎對B16F10黑色素瘤細胞腦轉(zhuǎn)移無影響

造模6 d后，小動物活體成像結(jié)果顯示小鼠腦部出現(xiàn)強生物發(fā)光信號，表明成功建立B16F10細胞心內(nèi)注射腦轉(zhuǎn)移瘤動物模型（圖1A）；造模6 d后各組小鼠均出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移（圖1B）；第6天開始給藥，小動物活體成像結(jié)果顯示，與對照組相比，川芎組小鼠顱內(nèi)腫瘤生長受抑制（圖1C、D），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1E），生存時間無明顯變化（圖1F），小鼠體質(zhì)量緩慢下降（圖1G）。

2.2 川芎調(diào)節(jié)血腦屏障通透性

免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組相比，川芎組小鼠閉鎖連接蛋白-1（ZO-1）、密封蛋白-5（Claudin-5）、閉合蛋白（Occludin）、P- 糖蛋白（P-gp）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）受體蛋白、水通道蛋白4（AQP4）與血小板衍生生長因子受體β（PDGFRβ）表達顯著下調(diào)（圖2A～G，Plt;0.05）。

2.3 川芎減輕B16F10腦轉(zhuǎn)移小鼠的神經(jīng)損傷

與正常組小鼠相比，對照組小鼠撕下粘簽時間顯著延長，立柱停留時間顯著縮短；與對照組相比，川芎組小鼠撕下粘簽時間顯著縮短，立柱停留時間顯著延長（圖3A、B，Plt;0.01），免疫熒光染色顯示，與對照組相比，川芎組小鼠腦部神經(jīng)元細胞增殖顯著性增多（圖3C，Plt;0.05），神經(jīng)元細胞凋亡減輕（圖3D）；膠質(zhì)細胞凋亡顯著減少（圖3E，Plt;0.05）。免疫組化染色顯示，與對照組相比，川芎組小膠質(zhì)細胞CD68表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4A），CD86表達顯著升高（圖4B，Plt;0.01），CD163表達顯著下降（圖4C，Plt;0.05）、CD206顯著上調(diào)（圖4D，Plt;0.01），炎癥細胞因子IL-1β水平顯著下調(diào)（圖4E，Plt;0.05），IL-6（圖4F，Plt;0.01）和IL-4（圖4G，Plt;0.05）水平顯著升高，IL-10水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4H，Pgt;0.05）。

2.4 川芎增強替莫唑胺抑制腦轉(zhuǎn)移黑色素瘤B16F10生長的作用

與替莫唑胺單藥組相比，川芎聯(lián)合替莫唑胺組顱內(nèi)腫瘤生長受到抑制顯著（圖5A、B，Plt;0.05），小鼠生存周期和體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖5C、D），粘簽實驗與立柱實驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖5E、F）。

3 討論

高分辨率超聲可以清晰觀察到B16F10 細胞被精準(zhǔn)注入小鼠左心室內(nèi)，待腦轉(zhuǎn)移瘤形成后，通過小動物活體成像儀體外監(jiān)測腫瘤進展［22］。與對照組相比，川芎組小鼠腦部熒光信號增長緩慢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。兩組小鼠生存曲線差異無統(tǒng)計學(xué)意義。川芎組小鼠平均體質(zhì)量大于對照組，TUNEL染色顯示川芎組小鼠腦組織損傷更輕。以上結(jié)果提示，川芎并未促進B16F10黑色素瘤顱內(nèi)進展。

川芎善“上行頭目”， 能引諸藥直達頭部，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)節(jié)血腦屏障的作用。血腦屏障由血管內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞足突以及周細胞構(gòu)成，可以防止血漿中毒性物質(zhì)和病原體等進入大腦［23］，也會使臨床藥物難以進入腦組織發(fā)揮治療效果。ZO-1、Claudin 5、Occludin蛋白在調(diào)控血管內(nèi)皮細胞與腦實質(zhì)間物質(zhì)交換上發(fā)揮作用，其功能包括調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞間緊密連接和細胞間隙［24］。通過免疫熒光觀察ZO-1、Claudin 5、Occludin蛋白表達變化可以反映出血管內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)運功能的變化，結(jié)果顯示，與對照組相比，川芎組小鼠腦組織ZO-1、Claudin 5、Occludin蛋白表達顯著下降。表明川芎可以打開內(nèi)皮細胞緊密連接，增加血腦屏障的通透性。P-gp蛋白位于血管內(nèi)皮細胞上，多種化療藥物是其底物，能被主動轉(zhuǎn)運而降低腦中藥物濃度，是影響化療藥療效的重要原因［25， 26］，通過免疫熒光觀察P-gp蛋白的變化，可以考察川芎是否具有通過抑制P-gp 蛋白而提高化療藥濃度的潛力，結(jié)果顯示，與對照組相比，川芎組小鼠腦組織P-gp蛋白表達顯著下降。當(dāng)腦轉(zhuǎn)移瘤存在時，內(nèi)皮細胞TNF-α水平升高，損害血腦屏障的完整性［27］。觀察給予川芎后小鼠腦組織TNF-α水平變化，可以考察川芎對腦轉(zhuǎn)移瘤存在時血腦屏障完整性的作用。結(jié)果顯示，與對照組相比，川芎組小鼠腦組織TNF-α表達顯著下降，表明川芎能減輕TNA-α引起的血腦屏障損傷。顱內(nèi)水腫是腦轉(zhuǎn)移瘤患者常見的臨床表現(xiàn)，AQP4是存在于星形膠質(zhì)細胞足突的水通道轉(zhuǎn)運蛋白4，調(diào)控血腦屏障中水運輸［28］，PDGFRβ為周細胞標(biāo)志物，周細胞的血管覆蓋率影響內(nèi)皮細胞通透性，與腦部水腫密切相關(guān)［29， 30］。通過檢測AQP4 與PDGFRβ蛋白表達變化，可以觀察川芎對血腦屏障水運輸?shù)淖饔?。結(jié)果顯示，與對照組相比，川芎組小鼠腦組織AQP4 與PDGFRβ蛋白表達顯著下降。與既往研究結(jié)果一致，川芎可以通過AQP4與PDGFRβ蛋白調(diào)節(jié)血腦屏障水轉(zhuǎn)運，有利于減輕腦部水腫［31］。以上結(jié)果表明，在腦轉(zhuǎn)移瘤存在時，川芎通過作用于血管內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白、P-gp蛋白、TNF-α含量而開放血腦屏障通透性，通過作用于星形膠質(zhì)細胞足突上AQP4蛋白與周細胞調(diào)節(jié)血腦屏障功能，且川芎對血腦屏障的開放作用不會增強黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移。

腦轉(zhuǎn)移瘤的存在會引起大腦功能受損，導(dǎo)致認知功能障礙［32］，通過粘簽實驗與立柱實驗發(fā)現(xiàn)，造模后小鼠感覺能力與抓握能力明顯降低，表明心內(nèi)注射形成的黑色素腦轉(zhuǎn)移瘤對小鼠神經(jīng)造成損傷。由于川芎具有神經(jīng)保護作用［33］，我們通過動物行為學(xué)和免疫熒光實驗探索給予川芎后對腦轉(zhuǎn)移小鼠神經(jīng)元細胞損傷的影響。與湯錫鋒等人報道的川芎嗪減輕肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤帶來的腦部負擔(dān)一致［34］，本研究中立柱和粘簽實驗顯示，川芎組小鼠行為學(xué)表現(xiàn)更好，腦組織切片染色顯示川芎組小鼠神經(jīng)元細胞增殖增加，凋亡減少。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組織駐留巨噬細胞樣先天性免疫細胞［35］，TMEM119 為小膠質(zhì)細胞標(biāo)志物［36］，免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組相比，川芎組小鼠小膠質(zhì)細胞凋亡顯著減少。小膠質(zhì)細胞在應(yīng)激狀態(tài)下能極化形成M1和M2表型［37］，M1 小膠質(zhì)細胞釋放促炎因子，表面標(biāo)志物包括CD68 和CD86 蛋白，M2 小膠質(zhì)細胞釋放抗炎因子，表面標(biāo)志物包括CD206和CD163［38-40］。本研究結(jié)果表明，黑色素腦轉(zhuǎn)移瘤B16F10存在時給予川芎，M1和M2小膠質(zhì)細胞受到不同程度極化，促炎因子IL-1β水平降低，IL-6水平升高，抗炎因子IL-4水平升高，IL-10含量無明顯變化，從整體結(jié)果觀察，提示川芎發(fā)揮抗炎抗腫瘤作用。

替莫唑胺（TMZ）為二代咪唑四嗪類烷基化劑，其作用機制為DNA甲基化和錯配修復(fù)失敗，為臨床常用的腦部腫瘤化療藥［41］。本實驗中，小動物活體成像儀監(jiān)測到，與替莫唑胺單藥組相比，川芎聯(lián)合替莫唑胺能顯著抑制B16F10 黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移。本研究表明，在B16F10黑色素腦轉(zhuǎn)移瘤存在時，川芎能抑制神經(jīng)元細胞和小膠質(zhì)細胞凋亡，促進小膠質(zhì)細胞活化，與抗腫瘤藥物替莫唑胺聯(lián)合能發(fā)揮更好的治療效果。

綜上所述，川芎在開放血腦屏障的同時并未促進B16F10黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移，可協(xié)助其他藥物跨過血腦屏障用于腦轉(zhuǎn)移瘤的治療；川芎能通過神經(jīng)元細胞和小膠質(zhì)細胞調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能，介導(dǎo)小膠質(zhì)細胞對腫瘤細胞的免疫應(yīng)答；川芎能增強化療藥替莫唑胺對B16F10黑色素腦轉(zhuǎn)移瘤的治療效果。本課題組將在后期研究中通過微透析法、液質(zhì)聯(lián)用法、細胞膜色譜法等深入探索川芎開放血腦屏障和保護腦組織的作用機制，為臨床上是否可以將川芎類引經(jīng)藥用于腦部腫瘤的治療提供實驗依據(jù)。

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（編輯：余詩詩）

基金項目：安徽省科技重大專項（201903a07020029）；蚌埠醫(yī)科大學(xué)橫向課題（2019-BYHX-03）；安徽省教育廳高?？蒲许椖浚↘J2021a0702）；安徽省自然科學(xué)基金（1908085QH373）；安徽省教育廳自然科學(xué)研究項目（KJ2020a0565）；安徽省重點研究與開發(fā)計劃資助項目（202104g01020017）；蚌埠醫(yī)科大學(xué)研究生科研創(chuàng)新計劃項目（Byycx22059）