5-羥基-6，7-二甲氧基黃酮抑制流感病毒誘導(dǎo)A549 細(xì)胞炎癥反應(yīng)和鐵死亡的作用及機(jī)制

摘要：目的 研究四方蒿中提取出的5-羥基-6，7-二甲氧基黃酮（5-HDF）對(duì)H1N1 流感病毒引起的肺損傷的保護(hù)作用及潛在機(jī)制。方法 使用H1N1流感病毒感染A549細(xì)胞制作流感病毒感染模型，檢測(cè)5-HDF的細(xì)胞毒性及其對(duì)感染病毒后的炎癥和鐵死亡相關(guān)指標(biāo)及相關(guān)信號(hào)通路蛋白的影響。采用乙醇回流提取和硅膠色譜法從四方蒿中提取分離獲得5-HDF，并采用NMR和MS鑒定其結(jié)構(gòu)。采用MTT法檢測(cè)不同濃度的5-HDF對(duì)A549 細(xì)胞的毒性；H1N1 流感病毒以0.1 的感染復(fù)數(shù)感染A549 細(xì)胞；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)5-HDF 對(duì)感染H1N1 流感病毒后A549 細(xì)胞中TRAIL和IL-8 表達(dá)水平的影響；Western blotting 檢測(cè)phospho-p38 MAPK（Thr180/Tyr182）、phospho-NF-κB p65（Ser536）、cleaved caspase3、cleaved PARP、SLC7A11、GPX4 等炎癥、細(xì)胞凋亡和鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的水平。通過(guò)鼻腔接種50 μL半數(shù)致死量（LD50）的H1N1流感病毒液復(fù)制小鼠H1N1流感病毒感染模型，以體質(zhì)量變化率、肺解剖結(jié)果、肺組織病理形態(tài)變化為指標(biāo)，考察5-HDF（30 mg/kg、60 mg/kg）體內(nèi)抗H1N1流感病毒的作用。結(jié)果 MTT 結(jié)果顯示5-HDF 在0～200 μg/mL 對(duì)A549 細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒性（Pgt;0.05）。流式細(xì)胞術(shù)和Westernblotting結(jié)果顯示，5-HDF能抑制H1N1流感病毒感染的A549細(xì)胞中phospho-NF-κB p65和phospho-p38 MAPK的活化，降低促炎因子IL-8的表達(dá)，且5-HDF能上調(diào)SLC7A11和GPX4等抗鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的水平，并抑制凋亡標(biāo)志物cleaved caspase3和cleaved PARP及凋亡因子TRAIL的表達(dá)（Plt;0.05）。5-HDF灌胃給藥7 d，可提高H1N1 流感病毒感染導(dǎo)致的小鼠體質(zhì)量降低，降低因感染H1N1流感病毒而異常升高的肺指數(shù)，并減輕其肺組織病變程度（Plt;0.05）。結(jié)論 本研究推測(cè)5-HDF具有一定的抗小鼠H1N1流感病毒感染作用，可能通過(guò)增加SLC7A11和GPX4的表達(dá)并抑制phospho-NF-κB p65和phospho-p38 MAPK的活化，降低cleaved caspase3 和cleaved PARP 的表達(dá)，來(lái)減弱流感病毒H1N1 感染A549 細(xì)胞所引起的鐵死亡、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞：四方蒿；5-羥基-6，7-二甲氧基黃酮；鐵死亡；抗炎；流感病毒

流感病毒感染是一種對(duì)生命威脅性極大的疾病，兼具高傳染率和高死亡率［1］。流感病毒感染肺部會(huì)導(dǎo)致急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征，其病理特征主要包括彌漫性肺水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡上皮細(xì)胞損傷、細(xì)胞凋亡等［2］。在流感病毒感染過(guò)程中，宿主會(huì)啟動(dòng)自身免疫應(yīng)答抵抗病毒感染，免疫細(xì)胞會(huì)釋放大量促炎介質(zhì)，包括白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10（IP-10）、腫瘤壞死因子-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1等，即“炎癥因子風(fēng)暴”［3］。研究表明NF-κB信號(hào)通路和p38 MAPK信號(hào)通路的異?；罨c炎癥風(fēng)暴密切相關(guān)［4］。同時(shí)，NF-κB、p38 MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)表達(dá)凋亡因子FasL、TRAIL，促使流感病毒感染的肺泡上皮細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序使細(xì)胞死亡［5-9］。目前臨床上仍未有能夠有效治療流感病毒感染導(dǎo)致肺損傷的藥物，因此急需探索一種新的藥物來(lái)治療該疾病。

四方蒿是唇形科香薷屬植物，以葉、花或全草入藥，分布在廣西、貴州、云南等省份，四季可采，鮮用或切碎曬干或研細(xì)備用，收載于《全國(guó)中草藥匯編》、《中華本草》等書籍中。四方蒿具有發(fā)汗解表，利濕止痛之效，用于治療感冒、腸炎、痢疾、腎炎等疾病；現(xiàn)代研究表明，四方蒿中主要含有黃酮和揮發(fā)油類化學(xué)成分。黃酮類化合物具有抗氧化［10］、抗流感病毒作用［11］，通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2來(lái)抑制心肌細(xì)胞凋亡［12］。5-羥基-6，7-二甲氧基黃酮（5-HDF）分布在香薷屬和石薺苧屬植物中，主要集中在香薷、海州香薷、四方蒿、石香薷、蘇州薺苧和石薺苧中［13］。既往研究采用LPS 誘導(dǎo)RAW 264.7 細(xì)胞產(chǎn)生病變，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明5-HDF具有體外和體內(nèi)抗炎活性［14， 15］，但其對(duì)A549細(xì)胞感染H1N1流感病毒后產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)及凋亡發(fā)生的作用目前尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬通過(guò)從四方蒿中提取分離純化，獲得5-HDF，并采用體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究5-HDF對(duì)A549細(xì)胞感染H1N1流感病毒后產(chǎn)生的鐵死亡、炎癥和細(xì)胞凋亡的抑制作用，旨在揭示5-HDF抗流感病毒的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑

四方蒿干燥植物材料，2021年11月采自云南元陽(yáng)縣，經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)潘錫平教授鑒定為唇形科香薷屬植物四方蒿。

DMEM/F 12 培養(yǎng)基和PBS 購(gòu)于武漢賽維爾生物科技有限公司；EDTA 胰酶細(xì)胞消化液（Biosharp）；RIPA 裂解液（Beyotime）；山羊抗兔二抗（MULTISCIENCES聯(lián)科生物）；BCA試劑（Thermo scientific）；流式抗體IP-10、IL-6 和IL-8（BioLegend）；一抗p38MAPK、Phospho-p38 MAPK（Thr180/Tyr182）、NF-κBp65、Phospho-NF-κB p65（Ser536）、SLC7A11、GPX4、cleaved caspase3、PARP（Cell Signaling）；GAPDH（武漢Affinity Biosciences）?；瘜W(xué)試劑甲醇、二甲基亞砜、MTT（Sigma-Aldrich）。

1.2 細(xì)胞株和病毒

人肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549（美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心）。流感病毒株A/PR/8/34（H1N1）由廣州呼吸健康研究所和廣州醫(yī)科大學(xué)的李菁博士提供。使用10 d齡雞胚進(jìn)行病毒擴(kuò)增，分裝，置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫贛adin-Darby Canine Kidney狗腎細(xì)胞（MDCK）中使用標(biāo)準(zhǔn)噬菌斑測(cè)定法測(cè)定病毒滴度。

1.3 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)和MK3 酶標(biāo)儀（Thermo）；AXIO OBSERVER A1 熒光倒置顯微鏡（Carl Zeiss）；電泳儀（Bio-RAD）；流式細(xì)胞儀（Beckman）。

1.4 提取與分離

取四方蒿干燥全草10 kg，切碎，加入80%乙醇回流提取3次，合并提取液，減壓濃縮，得浸膏1.6 kg，取浸膏500 g，加水1 L攪拌至溶解，濾集不溶物，水洗，干燥，再用氯仿回流提取3次，濃縮后得膏狀物27 g。將氯仿提取所得膏狀物與60 g硅膠混合，拌勻，晾干，研細(xì)，過(guò)篩，裝入300 g硅膠柱，先后以石油醚-乙酸乙酯（10∶1、5∶1、3∶1）洗脫，在TLC指導(dǎo)下合并。石油醚-乙酸乙酯（10∶1）洗脫部分再經(jīng)過(guò)硅膠柱層析和結(jié)晶純化，得到黃色針狀結(jié)晶（288 mg）。

1.5 5-HDF純度檢測(cè)

使用液相色譜法檢測(cè)5-HDF純度。色譜儀：島津LC-10a；檢測(cè)器：島津二極管陣列檢測(cè)器SPD-M10Avp；色譜柱：島津ODS 4.6×150 mm，5 μm；流動(dòng)相：甲醇-0.1%甲酸（80∶20）；檢測(cè)波長(zhǎng)：316 nm；保留時(shí)間：5.1 min。

1.6 A549細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)

液氮中凍存的A549 細(xì)胞37℃水浴解凍。使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將其接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%后進(jìn)行傳代。

1.7 MTT法

A549細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，分8組接種于96孔板，分別為對(duì)照組、5-HDF（25 mg/mL）組、5-HDF（50 mg/mL）組、5-HDF（75 mg/mL）組、5-HDF（100 mg/mL）組、5-HDF（200 mg/mL）組、5-HDF（300 mg/mL）組、5-HDF（400 mg/mL）組。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，每孔加入100 μL對(duì)應(yīng)濃度的含5-HDF的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱37℃，5% CO2培養(yǎng)24 h 取出。每孔中加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），再放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，吸棄上清，加入二甲基亞砜，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)A 值。細(xì)胞存活率（%）=（給藥組均值/對(duì)照組均值）×100%。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染H1N1 流感病毒后5-HDF對(duì)A549 細(xì)胞炎癥因子和凋亡因子的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106 /孔，接種于6 孔板中，37℃、5% CO2孵育24 h，以0.1 的感染復(fù)數(shù)（MOI）感染H1N1流感病毒24 h，然后加入濃度為0、25、50、75 mg/mL 的含5-HDF 無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基處理24 h，用胰酶消化收集細(xì)胞。加入1 mL的1×IntracellularStaining Perm Wash Buffer 重懸細(xì)胞，1800 r/min 離心5 min；吸棄上清液，每管留下100 μL，分別加入1 μL IL-8、1 μL TRAIL，室溫下避光孵育15～30 min；每管加入500 μL含2% BSA的DMEMF-12 培養(yǎng)基，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，F(xiàn)lowJo軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.9 Western blotting

采用Western blotting 檢測(cè)5-HDF 對(duì)A549 細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)影響，設(shè)置6 個(gè)實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組、H1N1模型組、H1N1+5-HDF（25 mg/mL）組、H1N1+5-HDF（50 mg/mL）組、H1N1+5-HDF（75 mg/mL）組、5-HDF（50 mg/mL）組。實(shí)驗(yàn)步驟如下：A549細(xì)胞用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，對(duì)照組和5-HDF（50 mg/mL）組分別加入1 mL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，H1N1 模型組、H1N1+5-HDF（25 mg/mL）組、H1N1+5-HDF（50 mg/mL）組、H1N1+5-HDF（75 mg/mL）組分別加入1 mL 含H1N1 病毒的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基（MOI=0.1）培養(yǎng)24 h。PBS 清洗2 次，對(duì)照組和H1N1模型組加入1 mL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基；H1N1+5-HDF（25 mg/mL）組、H1N1+5-HDF（50 mg/mL）組、H1N1+5-HDF（75 mg/mL）組和5-HDF（50 mg/mL）組分別加入1 mL 不同濃度的含藥無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基（25、50、75 mg/mL），培養(yǎng)24 h。

用RIPA裂解液在冰上研磨提取蛋白，并用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，通過(guò)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后將其轉(zhuǎn)至PVDF膜；5%奶粉室溫封閉1 h，將膜分別置于一抗P-p38 MAPK（Thr180/Tyr182）（1∶1000）、p38MAPK（1∶1000）、P-NF-κB-p65（Ser536）（1∶1000）、NF-κB-p65（1∶1000）、cleaved caspase3（1∶1000）、PARP（1∶1000）、SLC7A11（1∶1000）、GPX4（1∶1000）、GAPDH（1∶3000）稀釋液中4℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次，加入二抗（1∶5000）溶液室溫孵育2 h。TBST洗滌3次，避光條件下使用化學(xué)成光成相系統(tǒng)進(jìn)行掃描，使用Image J 和Adobe Phstoshop 圖像處理軟件對(duì)各蛋白條帶進(jìn)行灰度值量化分析與整理。

1.10 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

雌性C57BL/6小鼠（廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），6周齡，16只，20±2 g。小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，恒溫恒濕，自由飲水和進(jìn)食，12 h晝夜交替。實(shí)驗(yàn)鼠飼料購(gòu)買于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：20240328）。

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為對(duì)照組、H1N1模型組、H1N1+5-HDF（30 mg/kg）組、H1N1+5-HDF（60 mg/kg）組，4只/組。除對(duì)照組外，其余3組小鼠均使用乙醚輕度麻醉，在生物安全柜內(nèi)經(jīng)鼻腔接種LD50H1N1流感病毒液，50 μL/只，制作H1N1感染模型。對(duì)照組小鼠按照同樣方法，鼻腔接種生理鹽水，50 μL/只。造模結(jié)束后，所有小鼠按照分組隔離，并飼養(yǎng)在相同的環(huán)境下。

造模12 h后，以0.1 mL/10 g為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照組、H1N1模型組灌胃生理鹽水；其余各組分別灌胃對(duì)應(yīng)濃度的5-HDF生理鹽水溶液，1次/d，連續(xù)7 d。每天記錄小鼠體質(zhì)量變化并計(jì)算體質(zhì)量變化率［體質(zhì)量變化率（%）=每日體質(zhì)量/初始體質(zhì)量×100%］。末次灌胃24 h 后，各組小鼠摘眼球取血，頸椎脫臼處死，取肺組織。全血保存于冰盒中，133 000 r/min離心10 min，取上清，置于-80 ℃冰箱保存，備用。稱定小鼠肺組織質(zhì)量，并計(jì)算肺指數(shù)［肺指數(shù)（%）=肺組織質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%］。取左側(cè)肺葉固定于4%多聚甲醛溶液48 h，常規(guī)脫水石蠟包埋，切片進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。另一部分肺組織置于-80 ℃冰箱保存，備用。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism9.5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異的比較采用單因素方差分析法。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5-HDF結(jié)構(gòu)鑒定

5-HDF 黃色針狀結(jié)晶，mp 162～163 ℃，易溶于氯仿、醋酸乙酯、乙醇、甲醇，不溶于水。UV λmax：215、272、316 nm（圖1A）。IRν cm-1：2950、1662（酮羰基）、1625、1589（苯環(huán)）、1498、1458、1431、1357、1301、1245、1199、1174、1099、1028、1001、972、912、852。ESI-MS m/z：321｛M+Na］x+，示相對(duì)分子質(zhì)量298（圖1B）。1HNMR（δ， 400MHz， CDCl3）：12.68（1H， s， OH-5），3.93（3H， s，OCH3-6），3.97（3H， s， OCH3-7），6.67（1H， s， H-3），6.57（1H， s， H-8），7.88（ 2H， m， H-2'， 6）' ，7.53（ 2H， m， H-3'，5'），7.53 （1H， m， H-4'））。13CNMR（δ， 100MHz， CDCl3）：159.34（C-2），106.03（C-3），183.12（C-4），153.48（C-5），133.20（C-6），164.37（C-7），91.08（C-8），153.74（C-9），106.73（C-10），131.76（C-1'），126.65（C-2'，6'），129.49（C-3'，5）' ，132.22（C-4）' ，56.73（OCH3-6），61.23（OCH3-7）。檢測(cè)圖譜（圖1C、D）。本品化學(xué)結(jié)構(gòu)式（圖1E）。純度檢測(cè)結(jié)果為98.6%（峰面積歸一化法，圖1F）。

2.2 MTT法檢測(cè)5-HDF對(duì)A549細(xì)胞的毒性

A549 細(xì)胞在5-HDF 處理24 h 后，對(duì)照組細(xì)胞存活率為（100.0±1.3）%，當(dāng)給藥濃度在25、50、75、100、200 μg/mL 時(shí)細(xì)胞存活率分別為（96.1±3.1）%、（98.0±2.9）%、（96.7±2.0）%、（100.0±4.6）%、（89.8±5.6）%，與對(duì)照組的細(xì)胞存活率相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；當(dāng)給藥濃度為300 μg/mL和400 μg/mL時(shí)細(xì)胞存活率分別為（32.5±9.3）%、（13.2±0.5）%，與對(duì)照組的細(xì)胞存活率相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.001，圖2A）。5-HDF的半數(shù)抑制濃度為272.4 μg/mL（圖2B）。

2.3 5-HDF抗小鼠H1N1流感病毒作用

2.3.1 小鼠體質(zhì)量變化率及肺指數(shù)

造模后第3天起，除對(duì)照組外的其余3 組小鼠的體質(zhì)量均下降。造模第7天，與空白組相比，H1N1 模型組小鼠的體質(zhì)量降低（Plt;0.001），肺指數(shù)顯著升高（Plt;0.001）；與H1N1 模型組相比，H1N1+5-HDF（30 mg/kg）、H1N1+5-HDF（60 mg/kg）組的小鼠體質(zhì)量升高（Plt;0.05），肺指數(shù)降低（Plt;0.01，圖3A、B）。

2.3.2 小鼠肺部形態(tài)及肺組織病理形態(tài)觀察結(jié)果

對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡大小均勻，氣道粘膜上皮結(jié)構(gòu)完整。H1N1模型組小鼠肺組織間肺間隔增厚，支氣管部分上皮細(xì)胞脫落，有肺泡炎癥、肺血管炎癥和氣管外周炎癥等。H1N1+5-HDF（30 mg/kg）、H1N1+5-HDF（60 mg/kg）和H1N1模型組相比，上述病理狀態(tài)均有減輕（圖3C～E）。

2.4 5-HDF 抑制H1N1 流感病毒感染A549 細(xì)胞活化P-NF-κB-p65和p38 MAPK信號(hào)的通路

與對(duì)照組相比，H1N1 組的P-p38 MAPK 以及P-NF-κB-p65 蛋白的表達(dá)水平上升（Plt;0.01），與H1N1組相比，H1N1+5HDF（25、50、75 μg/mL）組中兩種蛋白的表達(dá)水平降低（Plt;0.05，圖4A、B）。5-HDF處理抑制了H1N1流感病毒感染A549細(xì)胞后上調(diào)表達(dá)的促炎介質(zhì)IL-8（Plt;0.001，圖4C～E）。

2.5 5-HDF 能抑制H1N1 感染引起的細(xì)胞凋亡和鐵死亡

與對(duì)照組相比，H1N1 組中凋亡標(biāo)志物cleavedcaspase3和cleaved PARP的蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0.001），鐵死亡標(biāo)志物GPX4和SLC7A11的蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0.05）；而與H1N1 組相比，H1N1+ 5HDF（25、50、75 μg/mL）中cleaved caspase3 和cleaved PARP 的蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0.05，圖5A、B），GPX4和SLC7A11的蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0.05，圖5C、D）。與對(duì)照組相比，H1N1 組中細(xì)胞凋亡因子TRAIL的表達(dá)水平升高（Plt;0.001）；與H1N1 組相比，H1N1+5-HDF（25、50、75 μg/mL）組中TRAIL表達(dá)水平降低（Plt;0.05，圖5E、F）。

3 討論

甲型流感病毒感染可以激活肺上皮細(xì)胞的細(xì)胞死亡程序，包括細(xì)胞凋亡和非細(xì)胞凋亡。而非細(xì)胞凋亡包括鐵死亡、壞死性凋亡等［16］?，F(xiàn)代研究表明，四方蒿黃酮類化合物具有抗氧化、抗流感病毒和抗炎作用，但其作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不明確。本研究對(duì)四方蒿抗流感藥效物質(zhì)進(jìn)行了研究，首次發(fā)現(xiàn)5-HDF是其有效成分之一，其波譜檢測(cè)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的5-羥基-6，7-二甲氧基黃酮吻合［17］，初步驗(yàn)證了5-HDF抗流感病毒、抗炎的作用機(jī)制。

研究表明，病原體引起細(xì)胞的炎癥反應(yīng)與鐵死亡有關(guān)系［18， 19］。鐵死亡是一種新型的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡程序之一［20］，其主要特征是細(xì)胞內(nèi)鐵的過(guò)度累積和脂質(zhì)過(guò)氧化。研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡參與了流感病毒引起的肺損傷［21-25］。System Xc- （SLC7A11 和SLC3A2）和GPX4 是抵抗鐵死亡脂質(zhì)過(guò)氧化的重要調(diào)節(jié)機(jī)制之一［26， 27］。本研究通過(guò)Western blotting檢驗(yàn)鐵死亡信號(hào)通路蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果顯示，A549細(xì)胞感染H1N1流感病毒后鐵死亡關(guān)鍵蛋白SLC7A11和GPX4的表達(dá)水平顯著下降，而5-HDF 的干預(yù)可以顯著增加其表達(dá)水平。SLCA11 激活后可以通過(guò)調(diào)控GPX4 的生成來(lái)影響脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生，以此保護(hù)細(xì)胞，避免發(fā)生鐵死亡。當(dāng)SLC7A11被抑制后，GSH合成減少，GPX4抗氧化活性降低，活性氧含量增加，過(guò)氧化產(chǎn)物如MDA增多，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生鐵死亡［28， 29］。由此推斷，5-HDF的干預(yù)可以降低被H1N1流感病毒感染后A549細(xì)胞內(nèi)的活性氧含量。

研究顯示，細(xì)胞內(nèi)活性氧含量持續(xù)增加最終會(huì)激活caspase3 通路，導(dǎo)致線粒體功能受損，繼而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［30］。Caspase3 是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵因子，cleaved caspase3 是caspase3 的活化形式，是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的主要裂解酶。TRAIL是一種腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體，由281個(gè)氨基酸組成，與死亡受體DR4和DR5相結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而激活PARP，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［31］。本研究流式細(xì)胞術(shù)和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)A549細(xì)胞被病毒感染后，會(huì)增強(qiáng)TRAIL 的表達(dá)水平，增加cleaved caspase3 和cleaved PARP 的表達(dá)，增加細(xì)胞凋亡；而5-HDF的干預(yù)可以明顯抑制這種趨勢(shì)。因此，本研究認(rèn)為5-HDF 發(fā)揮抗流感作用與TRAIL/caspase3/PARP信號(hào)通路的激活相關(guān)。

激活TRAIL 導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的過(guò)程也會(huì)同時(shí)激活NF-κB信號(hào)通路，繼而促進(jìn)IL-8的分泌［31］。IL-8能夠促進(jìn)炎癥介質(zhì)的合成與分泌，趨化并激活炎癥因子聚集于肺部，促進(jìn)肺部炎癥的發(fā)生，加重肺損傷，是重要的促炎細(xì)胞因子之一［32， 33］。另一方面，當(dāng)TRAIL與其受體結(jié)合后，可以激活一系列的激酶，這些激酶進(jìn)一步激活MAPK信號(hào)通路。MAPK和NF-κB通路是氧化-還原敏感信號(hào)通路，活性氧的增加可能會(huì)激活這兩條通路產(chǎn)生炎癥反應(yīng)［34， 35］。流感病毒感染會(huì)使MAPK和NF-κB信號(hào)通路異?；罨?，導(dǎo)致急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征［36， 37］。在A549 細(xì)胞中，活性氧可激活p38 MAPK和caspase3，并通過(guò)激活活性氧/p38 MAPK通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［35-38］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H1N1 流感病毒的感染會(huì)增加A549細(xì)胞中P-NF-κB-p65和IL-8的表達(dá)，增加Pp38MAPK的表達(dá)，加重細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。加入5-HDF進(jìn)行干預(yù)后可以降低P-NF- κB-p65、IL-8 和P-p38MAPK的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。由此推斷，5-HDF抗流感作用機(jī)制可能與NF-κB、MAPK信號(hào)通路有關(guān)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組小鼠相比，H1N1 模型組小鼠的體質(zhì)量明顯降低，肺指數(shù)明顯升高，肺組織明顯受損，病理切片中肺泡壁增厚，肺泡間隙縮小，支氣管部分上皮細(xì)胞脫落，同時(shí)有肺泡炎癥、肺血管炎癥和氣管外周炎癥等表現(xiàn)。這表明H1N1 流感病毒感染導(dǎo)致了小鼠肺部炎癥的產(chǎn)生。而5-HDF的干預(yù)可以使感染H1N1流感病毒小鼠的肺指數(shù)降低，并抑制小鼠的體質(zhì)量下降，減少病理切片中的泡壁增厚和炎癥表現(xiàn)，這提示5-HDF對(duì)H1N1流感病毒導(dǎo)致的小鼠肺部炎癥具有一定程度的抵抗作用。

綜上所述，本研究表明 5-HDF具有一定的抗小鼠H1N1流感病毒感染作用，在病毒感染導(dǎo)致的線粒體損傷細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)過(guò)程中具有出色的調(diào)控作用，其抗凋亡作用可能是通過(guò)TRAIL/caspase3/PARP信號(hào)通路介導(dǎo)，抗炎癥作用可能是通過(guò)MAPK/ NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)。但5-HDF更具體的作用機(jī)制以及其對(duì)其他亞型的流感病毒感染的抵抗作用仍需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Javanian M， Barary M， Ghebrehewet S， et al. A brief review ofinfluenza virus infection[J]. J Med Virol， 2021， 93（8）： 4638-46.

[2] Du J， Li H， Lian J， et al. Stem cell therapy： a potential approach fortreatment of influenza virus and coronavirus-induced acute lunginjury[J]. Stem Cell Res Ther， 2020， 11（1）： 192.

[3] Ma N， Li XJ， Jiang HY， et al. Influenza virus neuraminidase engagesCD83 and promotes pulmonary injury[J]. J Virol， 2021， 95（3）：e01753-20.

[4] Pan H， Huang WH， Wang ZJ， et al. The ACE2-ang- （1-7） -mas axismodulates M1/M2 macrophage polarization to relieve CLP-inducedinflammation via TLR4-mediated NF-кb and MAPK pathways[J]. JInflamm Res， 2021， 14： 2045-60.

[5] Liu XF， Shao JH， Liao YT， et al. Regulation of short-chain fattyacids in the immune system[J]. Front Immunol， 2023， 14： 1186892.

[6] Weng SC， Wen MC， Hsieh SL， et al. Decoy receptor 3 suppresses Tcellpriming and promotes apoptosis of effector T-cells in acute cellmediatedrejection： the role of reverse signaling[J]. Front Immunol，2022， 13： 879648.

[7] Xiao YS， Ren Q， Wu LH. The pharmacokinetic property andpharmacological activity of acteoside： a review[J]. BiomedPharmacother， 2022， 153： 113296.

[8] Jiang HL， Ashraf GM， Liu MM， et al. Tilianin ameliorates cognitivedysfunction and neuronal damage in rats with vascular dementia viap-CaMKII/ERK/CREB and ox-CaMKII-dependent MAPK/NF- κBpathways[J]. Oxid Med Cell Longev， 2021， 2021： 6673967.

[9] Li QT， Feng YM， Ke ZH， et al. KCNN4 promotes invasion andmetastasis through the MAPK/ERK pathway in hepatocellularcarcinoma[J]. J Investig Med， 2020， 68（1）： 68-74.

[10]Kulaphisit M， Pomlok K， Saenjum C， et al. The anti-leukemicactivity of a luteolin-apigenin enriched fraction from an edible andethnomedicinal plant， Elsholtzia stachyodes， is exerted through anER stress/autophagy/cell cycle arrest/apoptotic cell death signalingaxis[J]. Biomed Pharmacother， 2023， 160： 114375.

[11]Yang LY， Du JC， Li RT， et al. Bodiniosides S-Y， seven newtriterpenoid saponins from Elsholtzia bodinieri and their antiinfluenzaactivities[J]. Molecules， 2021， 26（21）： 6535.

[12]Ling HY， Lou YJ. Total flavones from Elsholtzia blanda reduceinfarct size during acute myocardial ischemia by inhibitingmyocardial apoptosis in rats[J]. J Ethnopharmacol， 2005， 101（1-3）：169-75.

[13]周雪倩. 幾種唇形科清熱解毒藥用植物的化學(xué)成分和抗流感活性研究[D]. 昆明： 昆明理工大學(xué)， 2022.

[14]Kim SY， Hassan AHE， Chung KS， et al. Mosloflavone-resveratrolhybrid TMS-HDMF-5z exhibits potent in vitro and in vivo antiinflammatoryeffects through NF?κB， AP-1， and JAK/STATinactivation[J]. Front Pharmacol， 2022， 13： 857789.

[15]Cai W， Zhang SL. Anti-inflammatory mechanisms of totalflavonoids from Mosla scabra against influenza A virus-inducedpneumonia by integrating network pharmacology and experimentalverification[J]. Evid Based Complement Alternat Med， 2022， 2022：2154485.

[16]Chen X， Li JB， Kang R， et al. Ferroptosis： machinery and regulation[J]. Autophagy， 2021， 17（9）： 2054-81.

[17]陳海永， 周長(zhǎng)新， 樓宜嘉， 等. 四方蒿化學(xué)成分的研究[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2005， 30（20）： 1589-91.

[18]Yang Y， Wang Y， Guo L， et al. Interaction between macrophages andferroptosis[J]. Cell Death Dis， 2022， 13（4）： 355.

[19]Pan WX， Xiang L， Liang XH， et al. Vitronectin destroyed intestinalepithelial cell differentiation through activation of PDE4-mediatedferroptosis in inflammatory bowel disease[J]. Mediators Inflamm，2023， 2023： 6623329.

[20]Gao WT， Wang XY， Zhou Y， et al. Autophagy， ferroptosis，pyroptosis， and necroptosis in tumor immunotherapy[J]. SignalTransduct Target Ther， 2022， 7（1）： 196.

[21]Liu PF， Feng YT， Li HW， et al. Ferrostatin-1 alleviateslipopolysaccharide-induced acute lung injury via inhibitingferroptosis[J]. Cell Mol Biol Lett， 2020， 25： 10.

[22]Dong X， Li DD， Fang ZY， et al. Astaxanthin alleviateslipopolysaccharide-induced acute lung injury by suppressingferroptosis[J]. Food Funct， 2023， 14（13）： 6115-27.

[23]Li JC， Lu KM， Sun FL， et al. Panaxydol attenuates ferroptosis against LPS-induced acute lung injury in mice by Keap1-Nrf2/HO-1pathway[J]. J Transl Med， 2021， 19（1）： 96.

[24]Lv YW， Du Y， Ma SS， et al. Proanthocyanidins attenuates ferroptosisagainst influenza-induced acute lung injury in mice by reducing IFN-Γ[J]. Life Sci， 2023， 314： 121279.

[25]Li Y， Yang Y， Yang YF. Multifaceted roles of ferroptosis in lungdiseases[J]. Front Mol Biosci， 2022， 9： 919187.

[26]Hirschhorn T， Stockwell BR. The development of the concept offerroptosis[J]. Free Radic Biol Med， 2019， 133： 130-43.

[27]Xie DD， Li K， Feng RX， et al. Ferroptosis and traditional Chinesemedicine for type 2 diabetes mellitus[J]. Diabetes Metab SyndrObes， 2023， 16： 1915-30.

[28]Forcina GC， Dixon SJ. GPX4 at the crossroads of lipid homeostasisand ferroptosis[J]. Proteomics， 2019， 19（18）： e1800311.

[29]Huang SM， Le HB， Hong GB， et al. An all-in-one biomimetic ironsmallinterfering RNA nanoplatform induces ferroptosis for cancertherapy[J]. Acta Biomater， 2022， 148： 244-57.

[30] Jorge J， Neves J， Alves R， et al. Parthenolide induces ROS-mediatedapoptosis in lymphoid malignancies[J]. Int J Mol Sci， 2023， 24（11）：9167.

[31]Braithwaite AT， Marriott HM， Lawrie A. Divergent roles for TRAILin lung diseases[J]. Front Med， 2018， 5： 212.

[32]Lambrecht BN， Hammad H， Fahy JV. The cytokines of asthma[J].Immunity， 2019， 50（4）： 975-91.

[33]Boonpiyathad T， S?zener ZC， Satitsuksanoa P， et al. Immunologicmechanisms in asthma[J]. Semin Immunol， 2019， 46： 101333.

[34]Sano M， Fukuda K， Sato T， et al. ERK and p38 MAPK， but not NFkappaB，are critically involved in reactive oxygen species-mediatedinduction of IL-6 by angiotensin II in cardiac fibroblasts[J]. CircRes， 2001， 89（8）： 661-9.

[35]Ramalingam P， Poulos MG， Lazzari E， et al. Chronic activation ofendothelial MAPK disrupts hematopoiesis via NFKB dependentinflammatory stress reversible by SCGF[J]. Nat Commun， 2020， 11（1）： 666.

[36]Li T， Wu YN， Wang H， et al. Dapk1 improves inflammation，oxidative stress and autophagy in LPS-induced acute lung injury viap38MAPK/NF-κB signaling pathway[J]. Mol Immunol， 2020， 120：13-22.

[37]Feng Y， Fang ZC， Liu BY， et al. p38MAPK plays a pivotal role in thedevelopment of acute respiratory distress syndrome[J]. Clinics，2019， 74： e509.

[38]Cui SQ， Nian Q， Chen G， et al. Ghrelin ameliorates A549 cellapoptosis caused by paraquat via p38-MAPK regulatedmitochondrial apoptotic pathway[J]. Toxicology， 2019， 426：152267.

（編輯：郎 朗）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（82004155）；廣州醫(yī)科大學(xué)科研提升計(jì)劃項(xiàng)目（2024SRP066）