hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制備、穿膜效應及其抗氧化、抗炎癥功效

摘要：目的 探究人源性細胞膜穿透肽hPP10攜帶人源性抗氧化蛋白Cu，Zn-SOD的穿膜效應并觀察其抗氧化、抗炎功效。方法利用RT-PCR技術擴增人源性SOD基因片段、酶切連接法構建重組質粒pET15b-Cu，Zn-SOD，pET15b-hPP10-Cu，Zn-SOD；利用鎳柱親和層析法、分子篩方法純化Cu，Zn-SOD、hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白并利用Western blotting法鑒定其正確性；利用免疫熒光法、熒光共定位實驗、Western blotting法鑒定hPP10-Cu，Zn-SOD在細胞中的穿膜效應；利用Western blotting法鑒定hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白穿膜時間梯度和濃度梯度效應；利用SOD酶活性測定試劑盒檢測hPP10-Cu，Zn-SOD穿膜后的SOD酶活性；利用MTT法檢測hPP10對細胞活性的影響。利用H2O2建立HEK293氧化應激細胞模型，通過流式細胞分析術（FCM）分析hPP10-Cu，Zn-SOD穿膜后細胞凋亡情況；并RT-qPCR分析hPP10-Cu，Zn-SOD穿膜后凋亡相關因子的表達情況；通過ROS檢測分析hPP10-Cu，Zn-SOD穿膜后抗氧化能力。TPA誘導建立小鼠耳部炎癥模型（5只/組，共4組），然后RT-qPCR分析hPP10-Cu，Zn-SOD穿膜后，NFκB，IL-1β、IL-6、TNFα因子的轉錄情況；Western blotting檢測NFκB p65、p-NFκB p65、IL-1β、TNFα基因的表達；免疫組化分析炎性因子p-NFκB p65、TNFα基因的表達。結果 成功構建了重組質粒pET15b-Cu，Zn-SOD，pET15b-hPP10-Cu，Zn-SOD，并獲得Cu，Zn-SOD蛋白和hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白；免疫熒光試驗結果表明5 μmol/L濃度的hPP10-Cu，Zn-SOD轉導HEK293細胞具有明顯的穿膜效應；熒光共定位實驗顯示融合蛋白hPP10-Cu，Zn-SOD入胞后定位在細胞膜內，部分蛋白定位在細胞核內；Western blotting實驗結果表明hPP10-Cu，Zn-SOD轉導Hela（Plt;0.05），HEK293（Plt;0.01）細胞具有濃度依賴性，細胞內hPP10-Cu，Zn-SOD存在可持續(xù)24 h；5 μmol/L的hPP10-Cu，Zn-SOD轉導細胞具有較好的抗氧化活性（Plt;0.01）；MTT結果顯示高達10 μmol/L濃度的hPP10-Cu，Zn-SOD對于細胞活力的影響小。在氧化應激模型中，FCM結果顯示hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白孵育細胞降低了細胞的早期凋亡（Plt;0.01）和晚期凋亡（Plt;0.05）；RT-qPCR結果顯示hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白孵育細胞使Bcl2、Mcl1、Deptor 等抗凋亡因子升高（Plt;0.05），降低了Bad、P21、P27 等促凋亡因子的表達（Plt;0.05）；ROS 結果顯示hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白孵育細胞顯著降低了細胞內的活性氧含量（Plt;0.01）。在炎癥模型中，hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白可顯著降低IL-1β、IL-6、TNFα因子的轉錄（Plt;0.05）；p-NFκB p65、IL-1β及TNFα的表達都呈現了抑制作用（Plt;0.05）；hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白處理組較Cu，Zn-SOD蛋白處理組，降低了炎性因子p-NFκB p65及TNFα基因的表達（Plt;0.05）。結論 融合蛋白hPP10-Cu，Zn-SOD具有明顯的穿膜入胞、抗氧化、抗炎功效，且對細胞毒副作用很小。這些結果為hPP10作為新的遞送載體奠定基礎，也為hPP10-Cu，Zn-SOD應用于護膚品等提供了理論依據。

關鍵詞：人源性細胞膜穿透肽hPP10；銅鋅超氧化物歧化酶Cu，Zn-SOD；抗氧化；抗炎；酶活力測定

細胞有氧代謝產生的活性氧，是細胞氧化損傷的重要原因，氧化損傷被認為是衰老甚至疾病發(fā)生的特征之一。超氧化物歧化酶（SOD）是體內重要的抗氧化酶，能有效地清除氧自由基，解除氧化造成的衰老甚至疾病，具有延緩衰老、抗炎、抗輻射、抗腫瘤等功效［1， 2］。根據所含金屬離子不同分為：Cu，Zn-SOD、Mn-SOD 和Fe-SOD［3］。其中，Cu，Zn-SOD是人體內重要的抗氧化酶，用以維系細胞內活性氧的穩(wěn)態(tài)［4］，避免過多的自由基對體內生物大分子造成損害［5］，因其在細胞內含量最多，活性最穩(wěn)定而受到廣泛關注［6］。但是，Cu，Zn-SOD是生物大分子，必須進入細胞內才能發(fā)揮功效［7， 8］。

自1988 年Green 和Frankel 等［9， 10］首次發(fā)現了TAT——人免疫缺陷病毒（HIV）的轉錄調節(jié)蛋白可以穿透細胞膜、核膜進入細胞核，掀起了對于細胞膜穿透肽（CPP）的研究熱潮。CPPs 不依賴受體［11］，多組織普適性［12］使其很快被應用到靶向治療和導入技術研究中來，其傳遞的分子包括核酸、治療肽、小分子抑制劑、抗癌劑［13-15］等，穿膜肽可融合核酸酶在特定位點切割基因組DNA并誘導修復和重組［16］。為推動基因工程藥物發(fā)展，建立高效、安全的蛋白分子導入技術提供了非常有價值的載體工具。國內外學者探索了將穿膜肽融合到Cu，Zn-SOD，制備TAT-Cu，Zn-SOD［17］，LMWP-Cu，Zn-SOD［18］，PEP1-Cu，Zn-SOD［19-21］，PTD4-Cu，Zn-SOD［22， 23］等融合蛋白，表現出抗氧化、抗輻射等功效，緩解了氧化應激模型下細胞的炎癥反應及皮膚細胞老化現象。但是病毒源的穿膜肽仍存在潛在的細胞毒性，目前尚未有人源性穿膜肽融合Cu，Zn-SOD，降低氧化損傷的報道。

課題組從KDM4A蛋白的c端片段中發(fā)現了一種新的人源性穿膜肽（命名為hPP10）。前期研究［24-26］表明，hPP10-FITC可以被Caski細胞攝取定位于細胞質和細胞核，hPP10-GFP融合蛋白可以穿透B16細胞膜定位于細胞質中，且穿膜效應高于TAT組；hPP10-Apoptin 融合蛋白有效導入細胞，誘導B16黑色素瘤細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用；hPP10-GCLC（谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基）可通過抑制肝臟相關基因，特別是膠原和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），顯著減輕肝纖維化的過程。

因此，運用基因工程技術表達hPP10-Cu，Zn-SOD，有望解決非人源性蛋白的抗原性刺激以及大分子蛋白SOD不能穿透細胞膜進入細胞內發(fā)揮抗氧化功能的缺陷，從而制備更有效、更經濟、更安全的具有護膚、保健和藥用功效的SOD，更有效地保護人體細胞，發(fā)揮抗氧化、抗炎功效，達到護膚美容和預防治療的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

pET15b 質粒、E.coli DH 5α、Rossatta（DE3）、Hela細胞株和HEK293細胞株由本實驗室保存；限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶、Taq 酶、dNTP、RT-PCR試劑盒（Fermentas）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（Thermos）；核糖核酸酶、溴化乙錠、EDTA、DAPI（Sigma）；超氧化物歧化酶（SOD）測試盒（南京建成生物工程研究所）；羊抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP、鼠源一抗GAPDH（北京中杉金橋公司）；His 單克隆抗體（Abmart）；β-actin 單克隆抗體、SOD 單克隆抗體（Santa Cruz）；白細胞介素IL-1β、腫瘤壞死因子TNF-α等抗體（Affinity）；兔源一抗NFκB p65（Proteintech）；Cy3 標記的羊抗鼠二抗（NovoGene）；PCR儀、蛋白質電泳系統（Bio-Rad）；GelLogic-200 凝膠成像系統（Kodak）；倒置熒光顯微鏡（尼康）；全波長酶標儀（Thermo）；生物安全柜（ECSO）；移液槍（Eppendorf）；免疫熒光共聚焦顯微鏡（Leica）。

1.2 方法

1.2.1 pET15b-Cu，Zn-SOD 及pET15b- hPP10-Cu，Zn-SOD重組質粒的構建

Trizol 法提取HEK293 細胞總RNA；以此為模板通過RT-PCR法克隆人Cu，Zn-SOD的cDNA片段，上游引物為：5'-aatctcgaggcgacgaaggccgtgtgcgtg-3'，下游引物為：5'-cggggatccttattgggcgatcccaattac-3'，并于上下游引物兩端分別插入Xho I和BamH I酶切位點；將Cu，Zn-SOD 的PCR 產物與酶切回收的pET15b 載體經T4 DNA連接酶連接，構建成重組質粒pET15b-SOD。通過退火PCR獲得hPP10基因片段，上游引物為：5'- tatgaaaatccccctgccccgcttcaaactgaaatgtatcttctgtaagaagcggaggaaaagaggcggttctc-3'，下游引物為：5'-tcgagagaaccgcctcttttcctccgcttcttacagaagatacatttcagtttgaagcggggcagggggattttca-3'，并于上下游引物兩端分別插入NdeI和Xho I酶切位點；將退火得到的hPP10雙鏈片段與經酶切回收的pET15b-Cu，Zn-SOD載體經T4 DNA連接酶連接，構建成重組質粒pET15b-hPP10-Cu，Zn-SOD。重組表達載體轉化至感受態(tài)大腸桿菌E. coliDH5α，涂布于含Amp+瓊脂平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，37 ℃震蕩培養(yǎng)提取質粒進行酶切鑒定。送上海生物工程有限公司測序。

1.2.2 Cu，Zn-SOD、hPP10-Cu，Zn-SOD重組蛋白誘導表達和純化

質粒轉化感受態(tài)細胞Rossatta（DE3），形成穩(wěn)定的高表達細菌株。在含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上劃單菌落，挑取單克隆至3 mL培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，細菌生長至對數期時加入1 mmol/L IPTG誘導6 h，收集細菌。超聲裂菌，4 ℃，12 000 r/min 離心20 min，取上清和Ni-NTA-agarose 親和層析柱進行純化。經經典透析液TGE 透析后，純化產物進行SDSPAGE電泳分析及Western blotting驗證。

純化試劑配方：Binding buffer（5 mmol/Limidazole，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH7.9）；Washing buffer （60 mmol/L imidazole， 0.5 mol/LNaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.9）；Elution buffer（1 mol/L imidazole，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl， pH 7.9）。變性條件下使用含有6 mol/L urea 的Binding buffer超聲，破碎菌體。

透析液配方：50 mmol/L Tris（pH=8.0） 100 mL，0.5 mmol/L EDTA（pH=8.0） 2 mL，50 mmol/L NaCl100 mL，100%丙三醇100 mL，還原型谷胱甘肽1 g，ddH2O定容至2 L，透析液的pH值要偏離目的蛋白的等電點。

1.2.3 Western blot 檢測純化原核蛋白

Cu，Zn-SOD、hPP10-Cu，Zn-SOD純化蛋白用BCA試劑盒測定蛋白濃度，按5 μg 蛋白上樣量制樣，經SDS-PAGE 電泳分析，濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上，條件為100 mA，90 min；用含1%脫脂牛奶封閉2 h；棄牛奶，一抗結合目的蛋白室溫孵育2 h；TBST洗滌5 min×3 次后，加入二抗室溫孵育40～50 min；TBST洗滌5 min×3 次后，使用ECL法顯影。

1.2.4 蛋白轉導細胞

24/6 孔板中傳代培養(yǎng)Hela 細胞（或HEK293 細胞），待細胞生長90%左右時棄去培養(yǎng)基，換為RPMI 無血清細胞培養(yǎng)基處理1 h；5% DMSO預處理1 h促進穿膜效應；加入一定濃度的過濾除菌的純化蛋白處理一定時間。

1.2.5 免疫熒光法鑒定穿膜效應

24 孔板中傳代培養(yǎng)HEK293細胞，預熱PBS洗3次，4%多聚甲醛固定細胞20 min；預熱PBS洗3次，0.1% triton-X100處理15 min；預熱PBS洗3次，1%山羊血清封閉30 min；加入1：2000稀釋的一抗（His單抗）室溫2 h；預熱PBS洗5 min×3次，加入1∶400稀釋的二抗（Cy3標記的羊抗鼠IgG抗體）置37 ℃避光處理1 h；PBS 洗5 min×3 次，DAPI 染細胞核5 min，上述所有操作要保證每孔加入量不少于200 μL足以覆蓋住全部細胞；PBS洗5 min×3 次后，每孔加入200 μL PBS，倒置熒光顯微鏡觀察有無穿膜效應。

1.2.6 熒光共定位實驗

將HEK293細胞種植在大鼠尾膠原蛋白（Roche）預處理的蓋玻片上12～16 h，PBS短暫洗滌2 次后，用4% 多聚甲醛在PBS 中固定20 min，0.1% Triton X-100 滲透，分別用鼠抗SOD、兔抗EGFR的單克隆抗體原代封閉孵育，與羊抗鼠、羊抗兔抗體孵育后，細胞用PBS洗滌，用DAPI染色并用固定劑固定，通過3D共聚焦掃描顯微鏡成像。

1.2.7 Western blotting分析

6孔板中傳代培養(yǎng)HEK293（Hela）細胞株，待細胞生長至80%～90%的融合度時棄培養(yǎng)基，預熱PBS洗2次，做蛋白轉導試驗；冰上裂解細胞2 h，期間不斷彈EP管，4 ℃離心12 000 r/min，25 min。用BCA試劑盒測定蛋白濃度，按10 μg上樣量取上清液與5×上樣緩沖液混合后，煮沸5 min，12 000 r/min 離心1 min，點樣；SDS-PAGE 膠電泳條件為：60 V 電泳30 min，待樣品進入分離膠后，改為120 V；待電泳完成后，濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上，條件為100 mA，90 min；轉膜完成后，含1%脫脂牛奶封閉2 h；棄牛奶，兔源SOD 多克隆抗體結合目的蛋白室溫孵育2 h；TBST洗滌5 min×3 次后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體室溫孵育40～50 min；TBST洗滌5 min×3次后，使用ECL法顯色。

1.2.8 SOD酶活力測定

本試劑盒采用黃嘌呤氧化法測定SOD酶活力，細胞超聲破碎后，4000 r/min，15 min，離心取上清測定。本試劑盒內含試劑共7種：其中試劑五和六按照比例配制顯色劑（現用現配），試劑七用于樣品前處理，清除其他SOD，保留Cu，Zn-SOD酶活力。取樣本0.2 mL加試劑七0.2 mL，渦旋混勻器充分混勻1 min后，以3500～4000 r/min，離心15 min，取上清測定。同時取生理鹽水0.2 mL加試劑七0.2 mL，渦旋混勻器充分混勻1 min后，以3500～4000 r/min，離心15 min，取上清做對照組。按照表1依次加入各種試劑盒樣本。

計算公式如下：

SOD活力（U/mgprot ） =（對照管A550 - 測定管A550／對照管A550）÷ 50% ×（反應總體積／取樣量（mL）） ÷ 待測樣本蛋白濃度（mgprot/mL）

1.2.9 MTT 檢測細胞毒性

取對數生長期HEK293 細胞，以1.2×105/孔的密度接種于96 孔板；待細胞生長至對數期，棄培養(yǎng)基，換為1640-培養(yǎng)液，處理1 h；每孔分別換成濃度梯度為0.5 μmol/L、1 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L 及無血清的1640-培養(yǎng)液，處理24 h；棄培養(yǎng)基，用500 μL/孔預熱PBS 洗滌3 次；加入80 μL/孔含血清的正常培養(yǎng)液及20 μL MTT溶液，處理4 h后棄去培養(yǎng)液，加入150 μL/孔DMSO，搖床振蕩30 min至結晶物徹底溶解后測定A490；該實驗需設置3 個以上復孔，重復3次以上，最終求得細胞存活率。

1.2.10 流式細胞分析術（FCM）

用25 μmol/L H2O2孵育HEK293細胞3 h誘導ROS水平，建立體外細胞氧化應激模型后，流式細胞分析術分別檢測空白對照組Vehicle+Vehicle，H2O2+Vehicle 組，H2O2+Cu，Zn-SOD組，H2O2+hPP10-Cu，Zn-SOD組4組細胞凋亡的情況。

1.2.11 RT-qPCR分析

使用Trizol 試劑盒提取細胞中的總RNA，然后采取RT-qPCR檢測抗凋亡因子Bcl2、Mcl1、Deptor，促凋亡因子Bad、P21、P27的表達情況，以及α核因子κB（NFκB），促炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的表達情況，引物見表2。

1.2.12 DCFH-DA探針檢測細胞內ROS含量

取對數生長期的HEK293細胞接種于6孔板中過夜（同1.3.9分組），去上清，PBS 漂洗３次，每孔加入胰酶1 mL，收集細胞，離心棄上清，將細胞重懸于DCFH-DA 稀釋液（1∶1000）中，混勻，置在37 ℃、CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。1500 r/min，4 ℃離心3～4 min，沉淀細胞，棄上清。用無血清培養(yǎng)基洗滌3次，流式細胞儀定量細胞中ROS的含量。1500 r/min，4 ℃離心3～4 min，沉淀細胞，棄上清。重懸細胞后上多功能微孔板檢測儀分析，488 dm激發(fā)，525 nm發(fā)射。

1.2.13 TPA誘導的皮膚炎癥及組織樣本的收集與實驗

20只8周大的雌性裸鼠購自珠海百試通生物科技有限公司（許可證號SCXK（粵）2020-0051）。局部應用TPA誘導小鼠耳部皮膚炎癥，設計4 組體內實驗（5 只/組）：Vehicle+Vehicle組、TPA+Vehicle組、TPA+Cu，Zn-SOD組、TPA+hPP10-Cu，Zn-SOD組。10 μg TPA溶解于20 μL丙酮，涂于小鼠耳部內外表面，2次/d，連續(xù)3 d。TPA處理1 h 后Cu，Zn-SOD、hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白局部涂于小鼠耳部。第4天處死小鼠，每只小鼠取直徑為8 mm的穿孔收集組織進行實驗分析。PBS 洗滌耳部組織，Trizol 試劑盒從20 mg 樣品中提取總RNA，RTqPCR檢測NFκB，IL-1β、IL-6、TNF-α等的表達情況，并Western blot分析NFκB p65，p-NFκB p65，IL-1β、TNF-α等的活化或蛋白表達情況。本研究動物實驗經南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準（批準號：NO.2023-0359）。

1.2.14 免疫組化分析

60 ℃烤箱烤片30 min，二甲苯和梯度酒精脫蠟，過氧化氫去除內源性過氧化酶，EDTA或檸檬酸鈉高壓修復，5% BSA 37 ℃封閉，TNF-α和p-NFκB p65單克隆抗體4 ℃孵育，羊抗鼠二抗37 ℃孵育，DAB顯色，清水終止，蘇木素復染，鹽酸酒精分化和流水沖洗返藍和樹膠封片，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統計學分析

使用SPSS22.0統計軟件進行數據分析。數據采用均數±標準差表示，兩組比較采用t檢驗，Plt;0.05時認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 pET15b-Cu，Zn-SOD、pET15b-hPP10-Cu，Zn-SOD重組質粒的構建和鑒定

質粒構建結果顯示：獲得HEK293 細胞總RNA（圖1A）；反轉錄PCR獲得人Cu，Zn-SOD基因片段，大小約為462 bp（圖1B）；獲得hPP10的基因片段，大小約為60 bp（圖1C）；重組質粒pET15b-Cu，Zn-SOD經XhoⅠ、BamHⅠ和NcoⅠ、Hind Ⅲ兩組酶切反應得到基因片段大小約為462 bp、823 bp；重組質粒pET15b- hPP10-Cu，Zn-SOD經XhoⅠ、BamHⅠ和NcoⅠ、HindⅢ兩組酶切反應得到基因片段大小約為462 bp、892 bp（圖1D）。經上海生工測序證實重組質粒構建成功，且無突變。

2.2 Cu， Zn-SOD、hPP10-Cu， Zn-SOD 融合蛋白的表達、純化及鑒定

SDS-PAGE結果顯示：在18 000 和25 000 附近出現Cu，Zn-SOD、hPP10-Cu，Zn-SOD 融合蛋白強表達帶，并獲得咪唑透析的天然融合蛋白及尿素透析的變性融合蛋白（圖2）。

Western blotting 結果顯示：融合蛋白Cu，Zn-SOD和hPP10-Cu，Zn-SOD大小正確，且無雜帶（圖3A、B）。

2.3 hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白能有效的穿透并進入Hela、HEK293細胞內

免疫熒光結果顯示：在HEK293細胞中2.5 μmol/L天然hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白處理組較Cu，Zn-SOD蛋白已有明顯的紅色熒光，5 μmol/L 天然hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白處理組紅色熒光強度更明顯（圖4）。

熒光共定位實驗結果顯示：在HEK293 細胞中，10 μmol/L hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白處理組較Cu，Zn-SOD蛋白處理組有明顯的代表SOD的胞內綠色熒光，其主要位于代表膜蛋白EGFR的紅色熒光之內（圖5）。

Western blotting結果顯示：在Hela細胞（圖6A、B）和HEK293細胞（圖6C、D）中，隨著hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白濃度的增大，其穿膜能力有顯著提高；而Cu，Zn -SOD融合蛋白處理組并不能有效的穿膜進入細胞內。同時，hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋可以在HEK293細胞中可持續(xù)存在24 h以上（圖6E）。

2.4 hPP10-Cu，Zn-SOD入胞后保持有意義的酶活力且其毒副作用小

SOD 酶活力實驗結果顯示：隨著hPP10-Cu，Zn-SOD處理濃度的提高，細胞內SOD酶活力也一致的提高，其中5 μmol/L濃度組的Cu，Zn-SOD酶活力提高最明顯（圖7A）。MTT實驗結果顯示：在一定濃度范圍內hPP10-Cu，Zn-SOD長時間處理后活細胞數量依然保持在80%以上，對細胞的活性影響甚微（圖7B）。

2.5 hPP10-Cu，Zn-SOD入胞后抗凋亡、抗氧化能力

FCM結果顯示：hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白入胞后，顯著抑制了細胞早期凋亡和晚期凋亡現象的發(fā)生（圖8A～C）。RT-qPCR結果顯示hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白入胞后，顯著提高了抗凋亡因子Bcl2、Mcl1、Deptor的表達，抑制了促凋亡因子Bad、P21、P27的表達（圖8D）。ROS檢測結果顯示：hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白入胞后，細胞的氧自由基含量顯著下降（圖8E）。

2.6 hPP10-Cu，Zn-SOD對TPA誘導的小鼠耳部炎癥的抗炎作用

RT-qPCR結果顯示：hPP10-Cu，Zn-SOD可顯著降低小鼠體內炎性因子的表達，差異有統計學意義（Plt;0.05，圖9B）。Western blotting 結果顯示：TPA+Vehicle組和TPA+Cu，Zn-SOD 組耳部組織中p-NFκB p65、IL-1β、TNFα表達升高；而TPA+hPP10-Cu，Zn-SOD組炎性因子的表達有所下降（圖9C）。免疫組化結果顯示：hPP10-Cu，Zn-SOD 處理組降低了炎性因子p-NFκBp65及TNFα的表達（圖9D）。

3 討論

氧化應激被認為是ROS生成和抗氧化防御之間的平衡受損，與皮膚衰老及炎癥反應的發(fā)生有關。SOD是胞內核心的自由基清除劑，其中Cu，Zn-SOD在人體內占比80%，且最為穩(wěn)定，在抗氧化過程的早期發(fā)揮作用，其在疾病治療、化妝品業(yè)中具有廣闊的前景［27，28］。然而，Cu，Zn-SOD相對分子質量大，外源補充難以進入細胞內發(fā)揮作用，利用基因工程表達穿膜肽介導的Cu，Zn-SOD融合蛋白成了當下的研究熱點。皮膚的衰老機制復雜，目前多數學者認為ROS過多引發(fā)氧化損傷是核心機制之一。據報道，SOD2低表達會引發(fā)果蠅的嗅覺衰老加快［29］；SOD模擬物可抑制自由基并減輕衰老引起的認知障礙［30］；適當濃度的PTD-Cu，Zn-SOD乳膏可有效減少氧化損傷，緩解D-半乳糖誘導的亞急性衰老模型，防治皮膚衰老［23］。本研究中hPP10-Cu，Zn-SOD處理組顯著降低了ROS含量，提高了氧化應激初期細胞的抗氧化能力，這與上述研究結果一致。不同的是，PTD是病毒源的跨膜轉導結構域，免疫原性和安全性還是存在一定風險。而本研究所用的hPP10源于人類細胞核蛋白，賴氨酸特異性去甲基酶4A的一段多肽序列，可攜帶蛋白、核酸跨膜進入細胞，是安全有效的跨膜運輸載體［25］。

炎癥是許多疾病的主要驅動因素，炎癥介質在各種疾病的發(fā)展過程中起著至關重要的作用［31］。NFκB引發(fā)和放大炎癥過程中涉及的主要信號通路，在炎性發(fā)生中起著核心作用，直接參與1L-1β、1L-6、TNF-α等炎性基因的調控與表達［32］。有報道稱銀屑?。?3］作為一種慢性炎癥性皮膚病，ROS表達增多，發(fā)病機制可能與NF-κB炎性通路失調有關。TPA誘導的小鼠耳部炎性模型［5］中，利用變性TAT-SOD融合蛋白（避免金屬離子影響酶活及考慮成本因素）局部涂抹可抑制促炎性細胞因子表達，被認為是通過調控NFκB信號通路的表達實現的。本研究亦證實了TPA可導致ROS的過量產生從而誘導炎性反應，而且hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白有效清除ROS，降低了NFκB 信號通路中p-NFκB p65、IL-1β、TNFα的表達，抑制NFκB信號通路，調節(jié)其下游基因的表達從而起到抗炎的作用。不同的是本研究咪唑透析純化的天然條件下hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白表現出更好的穿膜入胞效應，且有效減輕TPA誘導小鼠皮膚炎癥。

本研究證實了融合蛋白hPP10-Cu，Zn-SOD具有較好的穿膜入胞、抗氧化、抗炎功效，且對細胞毒性微弱。并通過熒光共定位實驗呈現了融合蛋白穿膜入胞后定位于細胞膜內，甚至于細胞核內。本研究和多數文獻相似之一在于融合蛋白的作用均具有濃度依賴性升高，卻有報道［23］指出，外源性抗氧化劑補充，鐘形圖或成為未來考慮的重要因素之一。與此同時，hPP10是通過何種機制介導Cu，Zn-SOD穿膜入胞的，穿膜機制尚不明確。值得注意的是，hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白進入皮膚會如何代謝，效果可持續(xù)多久還待進一步研究。后續(xù)研究可以考慮制備SOD 單乳及不同濃度的hPP10-Cu，Zn-SOD乳膏，外用觀察小鼠涂抹部位皮膚致敏性及安全性，hPP10-Cu，Zn-SOD融合蛋白的透皮機制、組織定位都有待探究。

綜上所述，本研究成功構建了重組質粒pET15bhPP10-Cu，Zn-SOD并獲得純化蛋白，通過多種分子生物學手段證實了融合蛋白hPP10-Cu，Zn-SOD具有一定的穿膜入胞、抗氧化、抗凋亡、抗炎功效。具體的，入胞的hPP10-Cu，Zn-SOD能有效的降低H2O2刺激細胞而產生的ROS的含量，同時，在TPA誘導的炎性模型中，入胞的hPP10-Cu，Zn-SOD可能是通過抑制炎性因子NFκB活化及其相關炎癥基因IL-6、IL-1β、TNFα等的表達從而起到了抗炎的效果。總之，hPP10作為一種新型人源性細胞膜穿透肽，具有較高的穿膜效率和安全性。該研究為SOD應用于護膚、人體保健和疾病治療提供了實驗基礎，也為hPP10作為分子藥物遞送載體的應用前景提供理論依據。

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（編輯：余詩詩）

基金項目：國家自然科學基金（81902788）；深圳市科技計劃（JCYJ20210324130801004）；海南省重點研發(fā)項目基金（社發(fā)方向，SQ2021SHFZ0739）