基于羧基化多壁碳納米管的分子印跡電化學傳感器檢測羅丹明B

摘要 將分子印跡聚合物（MIP）與羧基化多壁碳納米管（f-MWCNT）引入到玻碳電極（GCE）表面，構建了一種用于羅丹明B（RhB）檢測的電化學傳感器。借助于f-MWCNT優(yōu)異的導電性能以及MIP的高選擇性， 基于MIP/f-MWCNT/GCE的電化學傳感器檢測RhB時表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。在最優(yōu)條件下，此傳感器檢測RhB具有寬的線性響應范圍（0.01～30 nmol/L， 30～500 nmol/L）和低至0.01 nmol/L的檢出限。此傳感器具有良好的選擇性，與RhB結構相近的染料分子（羅丹明6G、亞甲基藍和甲基橙）以及常見金屬離子（K+、Ca2+、Mg2+和Fe3+）不干擾測定。此傳感器還表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，利用其測定自來水和河水樣品中的RhB，加標回收率分別為99.8%～105.6% 和99.2%～105.0%，顯示出良好的應用潛能。

關鍵詞 分子印跡聚合物；電化學傳感器；羧基化多壁碳納米管；羅丹明B

羅丹明B（RhB）是一種具有鮮桃色的人工合成的三苯甲烷類堿性染料，具有高水溶性和高色牢度，并且制備成本低，廣泛應用于造紙、皮革和紡織品染色[1-3]。但是，過量接觸或者誤食RhB會對人體造成危害，主要體現(xiàn)為咽痛、四肢疼痛、頭痛、腹痛和嘔吐等癥狀，甚至引起基因突變和癌變，即使在極低濃度下也會對環(huán)境和人類健康造成嚴重風險[4-5]。我國以及歐美等國家和地區(qū)均嚴禁在食品中添加RhB，但由于RhB 的成本低、色牢度高、穩(wěn)定性好，非法使用現(xiàn)象仍然常見[6-7]。因此，開發(fā)一種快速準確的RhB檢測技術具有重要意義。目前， RhB的檢測方法包括液相色譜-質譜法（LC-MS）[8]、高效液相色譜法[9]、表面增強拉曼散射光譜法[10]、熒光光譜法[11]、紫外-可見吸收光譜法[12]和電化學方法[13-18]。這些傳統(tǒng)的檢測方法具有較高的準確度和精密度，但大部分存在成本高、樣品預處理過程復雜、檢測過程復雜且耗時長等問題。電化學方法因其成本低、靈敏度高、操作簡單和便攜性等優(yōu)勢備受關注[19-21]。但是，電化學方法在復雜基質中易受干擾物的影響，準確檢測目標物具有較大難度。因此，開發(fā)高選擇性和高靈敏度的電化學傳感器檢測復雜基質中的痕量RhB具有很大的挑戰(zhàn)性。

分子印跡聚合物（MIPs）具有親和力高、選擇性和穩(wěn)定性好、制備過程簡單以及成本低等優(yōu)點[22-23]。然而， MIP在電化學傳感器中的實際應用受到其導電性不佳和電化學活性弱等問題的限制[24]。因此，在聚合MIP前，通常采用納米材料（如氧化石墨烯[25]、金屬納米顆粒[26]、碳納米管（CNTs）[27]或復合材料等增敏材料）修飾電極提高MIP電化學傳感器的靈敏度。羧基化多壁碳納米管（f-MWCNTs）因在溶液中的溶解度、吸附能力和電催化活性均較高而備受關注[28-29]。Deng等[30]采用f-MWCNT和聚乙烯亞胺修飾玻碳電極制備電化學傳感器，對RhB氧化具有良好的電催化性能，在0.1～15.0 μmol/L的濃度范圍內具有良好的線性關系，檢出限（LOD）為6 nmol/L。研究表明， f-MWCNT對RhB具有高的電催化活性，可有效提高傳感器檢測的靈敏度[31]。

本研究以f-MWCNT為電極修飾材料、RhB為模板分子、鄰苯二胺（o-PD）為功能單體，采用電聚合的方法直接在修飾電極表面制備MIP膜，構建了用于檢測RhB的MIP電化學傳感器，并將其用于實際水樣中RhB的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

S-4800掃描電子顯微鏡（SEM，日本日立公司）；CHI660E電化學工作站（上海辰華儀器公司）；電化學實驗采用三電極系統(tǒng)：玻碳電極（φ=3 mm）及其修飾電極為工作電極，對電極為鉑絲，參比電極為飽和甘汞電極（SCE）。

RhB、o-PD、亞甲基藍（MB）、甲基橙（MO）、羅丹明6G（R6G）和f-MWCNT（外徑50 μm， 長度15 nm）購自阿拉丁試劑有限公司。所用試劑均為分析純；實驗用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS， pH=7.0）由NaH2PO4 和Na2HPO4 配制而成。

1.2 電化學傳感器的制備

1.2.1 f-MWCNT 修飾電極的制備

對裸GCE進行拋光，再分別用無水乙醇和超純水超聲清洗，自然晾干，待用。將10 μL f-MWCNT懸浮液（1 mmol/L， 分散在0.5%（m/V）殼聚糖溶液中）滴涂在GCE電極的表面，在45 ℃ 下干燥60 min， 即得到f-MWCNT修飾玻碳電極（f-MWCNT/GCE）。

1.2.2 印跡電極和非印跡電極的制備

以f-MWCNT/GCE為工作電極、鉑絲為對電極、SCE（3 mol/L KCl 溶液）為參比電極，在含10 mmol/Lo-PD 和1 mmol/L RhB 的0.1 mol/L PBS 溶液（pH=7.0）中進行電化學聚合， 聚合條件為：掃描速率0.05 V/s， 電位范圍0～0.8 V， 掃描20圈。在甲醇-乙酸（4∶1，V/V）混合液中浸泡一定時間以去除RhB分子，并用水清洗表面，獲得印跡電極（MIP/f-MWCNT/GCE）。制備非印跡電極（NIP/f-MWCNT/GCE）時，除不加RhB外，其余步驟與印跡電極相同。

1.3 電化學檢測

將制備好的傳感器置于不同濃度的RhB 溶液中吸附20 min 后再進行電化學檢測。以含0.1 mol/LKCl的5 mmol/L [Fe（CN）6]3–/4–為電解質溶液，對于循環(huán)伏安（CV）法檢測，掃描速率為0.05 V/s， 電位窗口為?0.2～0.6 V；電化學阻抗譜（EIS）檢測電位為0.175 V， 頻率范圍為1 MHz～0.1 Hz， 增幅為10 mV；差分脈沖伏安法（DPV）測量電位窗口為?0.2～0.6 V， 掃描速率為0.025 V/s。所有實驗均在室溫條件下進行。

1.4 實際樣品的預處理和檢測

實際水樣為合肥市自來水和合肥市清溪路南淝河水域的河水。自來水水樣直接檢測；河水水樣經(jīng)0.22 μm 的濾膜過濾后，用0.1 mol/L PBS （pH=7.0）按體積比1∶1進行稀釋。將MIP/f-MWCNT/GCE電極放入實際樣品溶液中吸附20 min， 按照1.3 節(jié)的條件進行DPV 測試。采用自來水樣品進行加標回收實驗，加標水平為1、2和5 μmol/L。

2 結果與討論

2.1 MIP 傳感器的制備及檢測機理

MIP電化學傳感器的制備和對目標物RhB的識別機理如圖1所示。以RhB為模板分子、o-PD為功能單體，采用CV 法在f-MWCNT/GCE電極表面電聚合形成聚合物膜，洗脫模板分子后，在聚合物膜上留下與RhB空間結構大小相同、結合位點相匹配的印跡孔穴。將傳感器置于RhB溶液中，由于RhB與印跡孔穴的大小和形狀匹配，會被特異性吸附到印跡孔穴中，阻礙了溶液中探針分子到達電極表面，電子轉移過程被抑制，因而電流信號減小，并且電流減小程度與測試液中RhB含量呈正相關關系，因此，可根據(jù)響應電流的變化實現(xiàn)RhB的定量檢測。

圖2 為含RhB 的o-PD 在f-MWCNT/GCE 電極表面的電化學聚合過程曲線。由圖2 可知， RhB 存在時， o-PD在修飾電極表面的電聚合是一個不可逆的過程，隨著電聚合圈數(shù)增加，電流逐漸減??；當聚合圈數(shù)達到20 圈時，電流趨于零。這是因為聚合后，在修飾電極表面形成了不導電的聚o-PD 膜。上述結果也表明，在GCE表面成功制備了MIP膜。

2.2 修飾電極表面形貌的分析

通過SEM觀察修飾電極的表面形貌，結果如圖3所示。由圖3A和圖3D可見，在GCE電極表面堆積了一層f-MWCNT，并且分布均勻；經(jīng)過電聚合并洗脫后， f-MWCNT表面被均勻覆蓋了一層聚合膜，此薄膜比較疏松（圖3B 和3E），這主要是因為經(jīng)過洗脫，聚o-PD 薄膜的結構發(fā)生了變化，摻雜在膜中的模板分子RhB從聚合物網(wǎng)絡中釋放出來，形成模板分子的孔穴。NIP/f-MWCNT/GCE表面（圖3C和3F）因沒有模板分子，不會形成印跡空穴，因此比MIP/f-MWCNT/GCE表面致密。

2.3 修飾電極的電化學性能分析

采用CV和EIS技術表征MIP/f-MWCNT/GCE的電極制備過程，結果見圖4。由圖4A可見，[Fe（CN）6]3–/4–探針在裸GCE電極上有一對對稱的氧化還原峰。將f-MWCNT修飾到GCE表面后，峰電流明顯增大，這是因為f-MWCNT 可增加電極的比表面積，增強電極的導電性，從而增大了電流信號[31]。然而，當在f-MWCNT/GCE電極表面電聚合一層聚合物膜（PPD）后，峰電流強度明顯下降，這是由于聚合物膜致密且不導電，阻礙了電極表面的電子傳遞。將模板分子洗脫后的MIP/f-MWCNT/GCE 電極的電流又有所增加，這是因為將RhB洗脫除去后，在MIP/f-MWCNT/GCE表面形成大量的印跡孔穴，探針[Fe（CN）6]3–/4–能夠穿過這些印跡孔穴到達電極表面。在含有RhB 模板分子的溶液中重吸附一定時間后，電極表面的氧化還原峰有一定程度的減小，這是因為RhB與印跡空穴在空間大小和形狀上高度匹配，因此特異性吸附在印跡空穴中，阻礙了探針的電子轉移。上述結果表明，MIP膜修飾電極制備成功。

對不同修飾電極進行EIS測試，結果如圖4B所示，在Nyquist譜圖中，高頻區(qū)半圓的直徑大小對應電極的電荷轉移電阻（Ret）， f-MWCNT/GCE電極的Ret 值遠小于GCE電極，證明f-MWCNT的引入有效地提高了電極表面電子轉移的能力。在電沉積聚合物膜之后，由于致密的聚合物膜不導電，電極的Ret 值大幅增加。當RhB分子洗脫后，修飾電極的Ret 明顯降低；當RhB重新占據(jù)印跡孔穴后， Ret 再次增大。這是因為RhB分子洗脫后產(chǎn)生了印跡孔穴，這些孔穴允許探針分子通過并到達電極表面；吸附RhB后，印跡膜孔穴又被重新占據(jù)，阻礙探針到達電極表面。這與CV檢測的結果一致，再次證明MIP修飾電極成功構建。

2.4 實驗條件的優(yōu)化

考察了f-MWCNT用量、o-PD 與RhB 的比例、電聚合圈數(shù)、洗脫劑種類、洗脫時間以及重吸附時間對傳感器性能的影響，結果見圖5。如圖5A 所示，當f-MWCNT 用量為6 μL 時，電流變化值達到最大；當其用量大于6 μL時，電流反而降低。這是因為過多的f-MWCNT 會在電極表面堆積，阻礙了電子轉移，影響印跡電極的靈敏度。由圖5B可知，當o-PD與RhB 的摩爾比為10∶1 時，傳感器的電流變化值最大。這是因為功能單體與模板分子的摩爾比不僅影響印跡膜的厚度，還會影響印跡孔穴的數(shù)量，當其比例為10∶1時，制備的MIP膜的厚度和印跡孔穴的數(shù)量最合適。電聚合掃描圈數(shù)對印跡電極也有明顯影響（圖5C）。在pH=7.0的PBS中，電聚合掃描20圈時，響應電流值最大。

模板分子的有效洗脫直接影響印跡孔穴的數(shù)量，而洗脫劑的種類決定了模板分子是否能夠順利地從聚合物膜中洗脫?？疾炝怂o水乙醇、甲醇和甲醇-乙酸混合液（4∶1，V/V）分別作為洗脫劑的洗脫效果，由圖5E可見，采用甲醇-乙酸（4∶1，V/V）洗脫20 min時，峰電流變化值最大，說明此時模板分子已洗脫完全。吸附時間也是影響印跡電極靈敏度的重要因素。將MIP/f-MWCNT/GCE浸入到10 μmol/L RhB溶液中進行吸附，如圖5F所示，隨著吸附時間延長，電流的響應逐漸增加，在20 min時達到最大值，并趨于穩(wěn)定。這說明當吸附時間為20 min時，印跡電極對RhB分子的吸附已達到平衡。

2.5 傳感性能分析

2.5.1 MIP/f-MWCNT/GCE 對RhB 的傳感性能

采用最優(yōu)條件下制備的MIP/f-MWCNT/GCE電化學傳感器對不同濃度的RhB 溶液（0.01、0.1、1、10、30、100、300 和500 nmol/L）進行檢測，結果見圖6。由圖6A 可見，隨著RhB 濃度增大，傳感器的DPV 響應電流不斷降低，這是因為隨著溶液中RhB 濃度增大，MIP 修飾電極的印跡孔穴不斷被RhB 占據(jù)，阻礙了電子轉移。由圖6B 可見，RhB 濃度在0.01～500 nmol/L 范圍內，傳感器的響應電流變化值與RhB 濃度的對數(shù)分兩段呈線性關系。在0.01～30 nmol/L 濃度范圍內，線性方程為ΔI（μA）=1.57lgCRhB+4.22，相關系數(shù)（R2）為0.9747；在30～500 nmol/L 濃度范圍內，線性方程為ΔI（μA）=5.50 lgCRhB?1.77，R2 為0.9905，檢出限（S/N=3）為0.01 nmol/L。

與已報道的RhB電化學傳感器相比（表1），本研究制備的基于MIP/f-MWCNT/GCE的傳感器具有更低的檢出限；與RGO-Fc-CS/GCE傳感器相比，本傳感器制備簡單、快速。

2.5.2 MIP/f-MWCNT/GCE 的選擇性

考察了MIP/f-MWCNT/GCE傳感器對RhB和3種常見染料分子（R6G、MB和MO）以及常見金屬離子（K+、Ca2+、Mg2+和Fe3+）的電流響應，結果見圖7。MIP/f-MWCNT/GCE 傳感器對RhB 的電流響應（20 μA）遠大于相同濃度的R6G、MB 和MO 的電流響應（4 μA）?？疾斓慕饘匐x子的濃度為RhB 濃度100倍時，對于RhB檢測無顯著影響，其ΔI 值均小于1 μA。NIP/f-MWCNT/GCE傳感器對所有物質的電流響應都不明顯， ΔI 值均小于2 μA。MIP/f-MWCNT/GCE傳感器對RhB的高選擇性主要得益于MIP膜上印跡孔穴的大小、形狀等空間結構及結合位點與模板分子RhB高度契合。金屬離子引起的微小電流變化可能是由電極上的非特異性吸附引起的。上述結果說明， MIP/f-MWCNT/GCE 電化學傳感器可對RhB進行特異性識別和檢測。

2.6 MIP/f-MWCNT/GCE 傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

為了評估MIP/f-MWCNT/GCE 傳感器檢測RhB 的重現(xiàn)性，在相同的實驗條件下，制備5 根MIP/f-MWCNT/GCE電極，采用DPV方法檢測10 μmol/L RhB，檢測結果的相對標準偏差（RSD）為7.11%，表明MIP/f-MWCNT/GCE 傳感器具有良好的制備重現(xiàn)性。將所制備的MIP/f-MWCNT/GCE 電極在4 ℃ 保存30 d后，其電流響應為初始電流的85%～90%，表明MIP/f-MWCNT/GCE傳感器具有良好的的穩(wěn)定性。

2.7 實際樣品分析

采用MIP/f-MWCNT/GCE傳感器測定自來水和河水中的RhB，以評估傳感器的實用性。采用DPV法對水樣進行檢測，結果見表2，自來水中RhB的加標回收率為90.5%～106.5%，河水中的加標回收率為90.8%～112.6%， RSDlt;9.9%。因此，MIP/f-MWCNT/GCE傳感器在實際水樣的RhB檢測中具有良好的應用潛能。

3 結論

以f-MWCNT為增敏材料修飾GCE、RhB為模板分子、o-PD為功能單體，構建了一種用于檢測RhB的MIP電化學傳感器。f-MWCNT具有較大的比表面積和優(yōu)異的電子傳輸能力，結合MIP的選擇性，此傳感器對RhB具有良好的檢測性能。在最佳實驗條件下，此傳感器在0.01～30 nmol/L和30～500 nmol/L的濃度范圍內，對RhB 分兩段呈良好的線性響應，檢出限為0.01 nmol/L。此外，此傳感器具有較高的選擇性，并具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，將其用于實際水樣中RhB的檢測，結果令人滿意。

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