吡喃葡萄糖功能化氧化鉬納米酶的合成以及抗菌性能分析

摘要 過(guò)氧化物酶介導(dǎo)的化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療（CDT）和光熱療法（PTT）協(xié)同抗菌策略已被證實(shí)可以有效抗菌，但是，由于活性氧（ROS）壽命短（lt;200 ns）和擴(kuò)散距離不足（約20～200 nm）等因素，嚴(yán)重限制了對(duì)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的抗菌作用。本研究采用一鍋水熱法成功合成了具有類過(guò)氧化物酶活性和光熱效應(yīng)的吡喃葡萄糖功能化氧化鉬（P-MoO3-x）納米酶，并對(duì)其聯(lián)合抗菌性能及生物安全性進(jìn)行了分析驗(yàn)證。P-MoO3-x 納米酶能夠利用與吡喃葡萄糖和凝集素的特異性相互作用靶向銅綠假單胞菌表面，有效縮短了羥基自由基的作用距離，顯著增強(qiáng)了對(duì)銅綠假單胞菌的抗菌效果。在光熱作用下， P-MoO3-x 最佳反應(yīng)溫度為70 ℃，即使在低濃度（50 μmol/L）H2O2 存在下，也能釋放更多的羥基自由基。體外抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，P-MoO3-x 抗菌系統(tǒng)對(duì)銅綠假單胞菌（106 CFU/mL）的失活效率超過(guò)99%。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)， P-MoO3-x 在治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染創(chuàng)面和促進(jìn)傷口愈合方面療效顯著，并且不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。本研究制備的P-MoO3-x 具有優(yōu)良的抗菌效果和良好的生物相容性，在抗感染治療中具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 氧化鉬；類過(guò)氧化物酶活性；光熱效應(yīng)；抑菌

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）可引起多種感染，包括胃腸道感染、尿路感染、呼吸道感染和中耳炎等[1-3]。目前，針對(duì)銅綠假單胞菌感染的抗生素包括氟喹諾酮類、氨基糖苷類以及β-內(nèi)酰胺類抗生素[4-5]。然而，由于銅綠假單胞菌存在復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[6]、較差的滲透性和藥物外排，使其對(duì)傳統(tǒng)抗生素表現(xiàn)出耐藥性[7-9]，從而導(dǎo)致治療時(shí)的并發(fā)癥增加，患者生活質(zhì)量下降[10]。因此，迫切需要開發(fā)一種高效非抗生素抗銅綠假單胞菌策略。

近年來(lái)，研究者開發(fā)了一些新型抗菌策略，如抗菌免疫反應(yīng)[ 11]、微波殺菌[ 12]、化學(xué)動(dòng)力療法（CDT）[13-14]、聲動(dòng)力療法（SDT）[15-16]、光動(dòng)力療法（PDT）[17-19]和光熱療法（PTT）[20-21]?；钚匝酰≧OS）介導(dǎo)的滅菌策略如PDT、SDT 和CDT，通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞毒性ROS，在高死亡率和位點(diǎn)精確激活方面表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)。由于電子-空穴對(duì)的快速重組， PDT 和SDT 的治療效果常常不理想[22]。納米酶介導(dǎo)的CDT 為ROS的生成提供了一種可替代的策略，其精度高、副作用小，可以提高CDT 效率[23]。具有類氧化酶或類過(guò)氧化物酶活性的納米酶可以促進(jìn)H2O2 或O2 轉(zhuǎn)化[24]，從而有效地調(diào)節(jié)活性氧水平[25-26]，并在較低濃度H2O2下破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖。然而，與天然酶相比，大多數(shù)納米酶催化活性較低，難以達(dá)到滿意的抗菌效果。作為一種非侵入性的治療手段， PTT 能夠?qū)⒔t外（NIR）光能轉(zhuǎn)化為熱能，從而有效地殺滅細(xì)菌[27-30]。此外， NIR 還能夠通過(guò)促進(jìn)電子-空穴對(duì)的激發(fā)以及高能電子的產(chǎn)生增強(qiáng)納米酶的催化活性[31-32]。作為一種新興的NIR 等離子體半導(dǎo)體，氧化鉬（MoO3）由于具有良好的生物可降解性、低毒性及多種價(jià)態(tài)[33-37]，被認(rèn)為是最具應(yīng)用潛力的納米酶之一。通過(guò)NIR 激發(fā)可提高M(jìn)oO3 的催化活性，并發(fā)揮PTT 和CDT 的協(xié)同效應(yīng)[38]。然而，由于ROS 的壽命短（lt;200 ns）且擴(kuò)散距離有限（約20～200 nm），仍難以達(dá)到滿意的殺菌效果。因此，增強(qiáng)納米酶與細(xì)菌的結(jié)合仍然是基于納米酶有效抗菌的關(guān)鍵。

銅綠假單胞菌表面的凝集素能夠通過(guò)碳水化合物與蛋白質(zhì)的相互作用，與多種類型的碳水化合物（如吡喃葡萄糖）特異性結(jié)合[39-41]?；诖耍狙芯块_發(fā)了PTT 和吡喃葡萄糖修飾的MoO3 納米酶介導(dǎo)的基于CDT 原理的抗銅綠假單胞菌耐藥感染的治療策略。采用簡(jiǎn)單的水熱法成功合成了尺寸小、分散均勻、具有優(yōu)良光熱效應(yīng)的吡喃葡萄糖功能化的MoO3-x（P-MoO3-x）納米酶，并對(duì)其靶向銅綠假單胞菌及抑菌性能進(jìn)行了分析。在NIR 激光照射下， P-MoO3-x 納米酶具有高效的NIR 光熱轉(zhuǎn)化能力，并增強(qiáng)了其類過(guò)氧化物酶活性，可釋放更多的羥基自由基（?OH）。此外，制備的P-MoO3-x 納米酶通過(guò)吡喃葡萄糖和凝集素在銅綠假單胞菌表面的相互作用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)銅綠假單胞菌的特異性靶向，縮短了?OH 的作用距離，進(jìn)而顯著提升了抗菌效果。P-MoO3-x 納米酶的合成及抗菌示意圖見圖1。本研究通過(guò)系統(tǒng)地開展體外抗菌和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)P-MoO3-x 的抗菌性能和生物相容性進(jìn)行了分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

JES-FA200 電子自旋共振譜儀和JEM-2100 透射電子顯微鏡（日本電子公司）；UV-6300 紫外-可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器）；FS5 熒光分光光度計(jì)（英國(guó)愛丁堡儀器）；TGL-15B 高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；FBZ1002-UP 標(biāo)準(zhǔn)試劑型純水機(jī)（青島富勒姆集團(tuán)）。

四水合鉬酸銨、葡萄糖、乙二醇、對(duì)苯二甲酸（TA）、H2O2 和NaCl（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、瓊脂培養(yǎng)基和肉湯培養(yǎng)基（分析純，上海源葉生物公司）；胎牛血清、青霉素、鏈霉素和胰酶（分析純，索萊寶科技有限公司）；E-BC-K318-M BCA 蛋白定量試劑盒（伊萊瑞特生物有限公司）；DP302 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）。

1.2 P-MoO3-x 的合成

采用一步水熱法合成P-MoO3-x[42]。將0.9 g 吡喃葡萄糖（Glucopyranose）和0.3 g （NH4）6Mo7O4·4H2O溶于30 mL 超純水中，用濃HCl 調(diào)至pH=2，在70 ℃下水熱反應(yīng)12 h，用截留分子量（MWCO）為1000 的透析膜透析48 h，真空冷凍干燥，于4 ℃保存。

1.3 P-MoO3-x 的光熱效應(yīng)分析

采用超純水為對(duì)照，將不同濃度的P-MoO3-x 樣品（50、100、200 和300 μg/mL）用NIR（808 nm，1 W/cm2）照射5 min，通過(guò)熱成像儀每30 s 記錄1 次溶液溫度。在室溫條件下，對(duì)P-MoO3-x（50 μg/mL）進(jìn)行升溫/降溫循環(huán)測(cè)試，每個(gè)循環(huán)光照5 min，自然冷卻5 min，連續(xù)測(cè)定3 個(gè)循環(huán)。根據(jù)文獻(xiàn)[11-12]的方法計(jì)算光熱轉(zhuǎn)換效率（η）。

1.4 細(xì)胞外ROS 的檢測(cè)

采用TA 法測(cè)量細(xì)胞外產(chǎn)生的?OH。將200 μL P-MoO3-x（50 μg/mL）、200 μL TA（5 mmol/L）和20 μLH2O2（100 mmol/L）加入到2 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS， 0.2 mol/L， pH=7.4）中，采用NIR（808 nm， 1 W/cm2）照射處理5 min。12 h 后，記錄樣品的熒光光譜。使用TMB 檢測(cè)乙酸鹽緩沖液中的?OH。

1.5 電子順磁共振（EPR） 光譜測(cè)量

為測(cè)定有/無(wú)H2O2 時(shí)·OH 的生成量，在室溫下，使用自旋捕集劑5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）捕獲游離的·OH，測(cè)量含DMPO（50 mmol/L）的H2O2（2 mmol/L）和H2O2（2 mmol/L）+P-MoO3-x（100 μg/mL）溶液的EPR 光譜。

1.6 P-MoO3-x 的類過(guò)氧化物酶催化活性考察

在H2O2 存在時(shí)，通過(guò)對(duì)TMB 的氧化反應(yīng)測(cè)定P-MoO3-x 的類過(guò)氧化物酶催化活性[43]。使用含有100 μL P-MoO3-x（0.5 mg/mL）、100 μL TMB（20 mmol/L）和100 μL H2O2（1 mmol/L）的1 mL 乙酸鹽緩沖溶液（100 mmol/L， pH=4），在25 ℃的條件下，測(cè)定不同濃度的TMB 和H2O2 條件下P-MoO3-x 的催化活性，進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究。

1.7 體外抗菌性能分析

選擇銅綠假單胞菌作為模型細(xì)菌，考察合成的P-MoO3-x 的抑菌能力。使用pH=7.2 的LB 培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)銅綠假單胞菌至生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，將菌液稀釋至1×106 CFU/mL，然后分為8 組：（1） 細(xì)菌單獨(dú)培養(yǎng)；（2） 細(xì)菌+H2O2（100 μmol/L）；（3） 細(xì)菌+P-MoO3-x（256 μg/mL）；（4） 細(xì)菌+H2O2+P-MoO3-x；（5） 細(xì)菌+NIR；（6） 細(xì)菌+H2O2+NIR；（7） 細(xì)菌+P-MoO3-x+NIR；（8） 細(xì)菌+P-MoO3-x+NIR+H2O2。NIR照射組在808 nm激光（1 W/cm2）下照射5 min。各組細(xì)菌在37 ℃下培養(yǎng)30 min， 涂布于平板上，于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)12 h，進(jìn)行CFU 計(jì)數(shù)。同時(shí)，進(jìn)行基于熒光的活/死細(xì)菌測(cè)定，觀察不同組的抗菌效果。

1.8 體內(nèi)抗感染治療及傷口愈合過(guò)程研究

構(gòu)建了局部感染Sprague-Dawley（SD）大鼠模型，以評(píng)估P-MoO3-x 體內(nèi)抗感染和傷口愈合效果（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理審批號(hào)為QDU-AEC-2024643）。將SD 大鼠（6 周齡；雌/雄性， 200 g/只）分為8 組（每組3 只）。麻醉后在大鼠背部皮膚切出傷口（d=10 mm）， 并使用銅綠假單胞菌懸液（1×106 CFU/mL）感染24 h后，給予SD 大鼠不同組的治療：（1） PBS；（2） P-MoO3-x（150 μg/mL）；（3） P-MoO3-x+H2O2；（4） P-MoO3-x+NIR；（5） P-MoO3-x+NIR+H2O2。NIR 輔助組中用808 nm 激光（1 W/cm2）照射SD 大鼠5 min。在第0、1、4 和7 d 測(cè)量并拍攝整個(gè)傷口。

將稀釋后的菌溶液倒在LB 瓊脂平板上，采用CFU 法計(jì)算存活菌數(shù)。將皮膚組織固定在4%多聚甲醛溶液中，采用蘇木精和伊紅（Hamp;E）染色，進(jìn)行組織學(xué)檢查。

1.9 細(xì)胞毒性及體內(nèi)生物安全性分析

采用MTT 比色法測(cè)定細(xì)胞毒性。在37 ℃和5% CO2 條件下，將L929 細(xì)胞接種到96 孔板中（5×103 cell/孔），在含1%青霉素-鏈霉素（Gibco）和10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。所有實(shí)驗(yàn)均在70%～80%的細(xì)胞融合度下進(jìn)行。然后，采用不同大小的P-MoO3-x 處理96 孔板，在37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。最后，在各孔中加入10 μL 二甲亞砜，繼續(xù)培養(yǎng)4 h， 采用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔在490 nm 處的吸光度。

為了研究P-MoO3-x 在體內(nèi)的生物安全效應(yīng)，將1.0 mL 150 μg/mL 的P-MoO3-x 懸浮液通過(guò)腹腔注射到正常SD 大鼠體內(nèi)；對(duì)照組注射1.0 mL PBS 緩沖溶液（pH 7.4）。7 d 后處死大鼠，收集主要器官進(jìn)行組織學(xué)分析；在注射PBS 和150 μg/mL 的P-MoO3-x 7 d 后采集大鼠血樣，用于生理指標(biāo)檢查。

1.10 蛋白質(zhì)外泄和DNA 損傷分析

將細(xì)菌與不同濃度的P-MoO3-x（0、150、300、600 和2000 μg/mL）共培養(yǎng)4 h（37 ℃、200 r/min），然后以12000 r/min 離心5 min， 取上清液。使用BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)泄露的蛋白濃度。細(xì)菌在37 ℃經(jīng)P-MoO3-x+H2O2+NIR 處理（200 r/min 培養(yǎng)4 h）后，提取細(xì)菌基因組DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳（110 V， 45 min）， 由凝膠成像儀成像，測(cè)定DNA 損傷情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 P-MoO3-x 的表征

透射電鏡（TEM）圖像顯示，制備的MoO3 均勻分散在吡喃葡萄糖基質(zhì)上（圖2A）。通過(guò)X 射線衍射（XRD）證實(shí)了MoO3 與吡喃葡萄糖（定義為P-MoO3-x）的結(jié)晶性質(zhì)（圖2B）。在引入無(wú)定形葡萄糖糖（JCPDs No.35-0609）的情況下， P-MoO3-x 的衍射峰并不尖銳，但與MoO3 的晶體結(jié)構(gòu)基本一致[27]。傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）結(jié)果證實(shí)了葡萄糖的存在（圖2C）。由于在3430 cm–1 附近有獨(dú)特的羥基拉伸振動(dòng)峰， 600～1400 cm–1 范圍內(nèi)的吸收帶被歸屬為C—C 和C—O 的振動(dòng)模式，尤其是與碳水化合物相關(guān)的振動(dòng)[44]。XPS 結(jié)果（圖2D）顯示存在C、O 和Mo 元素，對(duì)應(yīng)于吡喃葡萄糖還原的P-MoO3-x。圖2E 顯示了P-MoO3-x 的Mo 3d XPS 光譜，在235.45 和232.48 eV 處出現(xiàn)雙峰，可歸屬為高氧化態(tài)鉬離子（Mo6+）的3d3/2和3d5/2，位于234.51 和231.6 eV 處的另外兩個(gè)峰，對(duì)應(yīng)于Mo5+ [45]。Mo5+的存在表明（NH4）6Mo7O24·4H2O中的部分Mo6+被還原，所形成的納米酶為多價(jià)態(tài)共存的狀態(tài)。圖2F 顯示了O 1s 的XPS 光譜，在530.2 eV處的峰代表與Mo 結(jié)合的氧原子，而532.44 eV 處的另一個(gè)峰可能由于氧在表面的化學(xué)吸附所致[22]。

2.2 P-MoO3-x 的光熱性能和類酶活性

用NIR 激光照射P-MoO3-x，研究其光熱性能。結(jié)果如圖3A 所示， P-MoO3-x 具有良好的光熱穩(wěn)定性，結(jié)合公式計(jì)算出P-MoO3-x 的光熱轉(zhuǎn)換效率為20.3%。如圖3B 所示，通過(guò)3 次激光開-關(guān)循環(huán)，溫度未明顯降低。如圖3C 所示， P-MoO3-x 懸液的溫度隨著照射時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，表現(xiàn)出濃度依賴性的溫度升高。采用NIR 光照射300 s 后，當(dāng)P-MoO3-x 濃度為50 μg/mL 時(shí)，溫度升高了10.8 ℃；當(dāng)P-MoO3-x 濃度為300 μg/mL 時(shí)，溫度升高了23.7 ℃。

考察了P-MoO3-x 的類過(guò)氧化物酶催化活性，結(jié)果如圖3D 所示。在H2O2 和TMB 共存時(shí)，在652 nm處出現(xiàn)oxTMB 的吸收峰，具有類過(guò)氧化物酶活性的P-MoO3-x 能夠?qū)2O2 催化轉(zhuǎn)化為?OH，產(chǎn)生的?OH 進(jìn)一步將TMB 氧化為藍(lán)色產(chǎn)物oxTMB。當(dāng)TA 與?OH 反應(yīng)時(shí)，會(huì)生成新的化合物2-羥基對(duì)苯二甲酸（TAOH），在435 nm 處出現(xiàn)明顯的熒光峰，圖3E 展示了P-MoO3-x 基于TA 的熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)?OH 的結(jié)果。加入P-MoO3-x 后， TA 的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。ESR 光譜進(jìn)一步證實(shí)了P-MoO3-x 反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生了?OH。如圖3F 所示，當(dāng)P-MoO3-x 和H2O2 同時(shí)存在時(shí)，觀察到1 個(gè)強(qiáng)度比為1∶2∶2∶1 的特征峰，這是代表性的?OH 特征峰。NIR 照射對(duì)P-MoO3-x 類過(guò)氧化物酶催化活性的影響如圖3G 所示， NIR 照射組的吸收峰強(qiáng)度顯著高于未經(jīng)NIR 照射組。同時(shí)，經(jīng)NIR 照射的TAOH 熒光強(qiáng)度較高，這是由于NIR 加速了?OH 的產(chǎn)生（圖3H）。

圖4A 和4B 分別為pH 值和溫度對(duì)P-MoO3-x 類過(guò)氧化物酶催化活性的影響。P-MoO3-x 在較寬的pH范圍（2.0～11.0）和溫度范圍（20～90 ℃）內(nèi)均保持一定的催化活性，最佳催化條件為pH 3.0 和溫度70 ℃，顯示出較好的pH 耐受性，相較于天然酶溫度耐受性更高且更穩(wěn)定。通過(guò)Lineweaver-Burk 方程計(jì)算得到最大反應(yīng)速度（Vmax）和米氏常數(shù)（Km）（圖4C～4F）。當(dāng)H2O2 作為底物時(shí)，根據(jù)動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算結(jié)果，P-MoO3-x 的Km 為32.29 mmol/L，低于Zn-CuO[46] 和Co3O4[47]等過(guò)渡金屬氧化物，表明其對(duì)H2O2 的親和力更高，催化效果更好；P-MoO3-x 的Vmax 為0.508×10?6 mol/（L·s）， 明顯高于一些常見的過(guò)氧化物酶的Vmax[48]，說(shuō)明P-MoO3-x 催化H2O2 的速度更快。

2.3 P-MoO3-x 的抗菌活性分析

P-MoO3-x 對(duì)銅綠假單胞菌的抗菌活性如圖5A 和5B 所示。無(wú)論是否進(jìn)行NIR 照射，空白組和單獨(dú)H2O2 處理的細(xì)菌均正常生長(zhǎng)，表明低濃度H2O2 不會(huì)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。經(jīng)P-MoO3-x+H2O2 處理后，菌落數(shù)量顯著降低，這是由于P-MoO3-x 催化H2O2 轉(zhuǎn)化為對(duì)細(xì)菌具有高毒性的·OH。為了增強(qiáng)P-MoO3-x 的抑菌能力，添加NIR 照射，提高其類過(guò)氧化物酶的催化效率。結(jié)果表明， P-MoO3-x+H2O2+NIR 的抑菌效果最佳，對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌率超過(guò)99%，顯著高于其它實(shí)驗(yàn)組。通過(guò)活/死（綠/紅）染色實(shí)驗(yàn)（圖5C）和活/死細(xì)菌比（圖5D）評(píng)估了P-MoO3-x 聯(lián)合抗菌體系的抗菌活性，在P-MoO3-x+NIR+H2O2 組中觀察到最多的紅色熒光，其它組中多表現(xiàn)為綠色熒光，表明P-MoO3-x 由于光熱效應(yīng)和類酶活性的協(xié)同作用而具有很強(qiáng)的抗菌能力。上述結(jié)果與通過(guò)CFU 法得到的殺菌率結(jié)果一致，證實(shí)此協(xié)同體系比P-MoO3-x+H2O2 和P-MoO3-x+NIR 具有更好的殺菌效果。

2.4 傷口消毒和愈合性能分析

以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染的SD大鼠為模型動(dòng)物，通過(guò)協(xié)同抗菌策略評(píng)估了P-MoO3-x在體內(nèi)的傷口愈合情況。如圖6A 和6B 所示， P-MoO3-x+NIR+H2O2 治療組的SD 大鼠水腫和炎癥程度最小，傷口愈合速度最快， P-MoO3-x+H2O2 和P-MoO3-x+NIR 組中存在輕度炎癥。傷口愈合情況如圖6C 所示， P-MoO3-x+NIR+H2O2 處理組表皮更完整，其它組則現(xiàn)出不同程度的碎片化表皮層。與其它組中不同程度的組織間斷層相比， P-MoO3-x+NIR+H2O2 組出現(xiàn)了新形成的上皮，證實(shí)傷口再上皮化的增強(qiáng)。

2.5 P-MoO3-x 的生物安全性

P-MoO3-x 對(duì)L929 細(xì)胞活力的影響如圖7A 所示。P-MoO3-x 濃度高達(dá)500 μg/mL 時(shí)也未產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性。36 h 內(nèi)不同處理組的細(xì)胞增殖能力和遷移能力（圖7B）、血液分析（圖7C）和組織學(xué)檢查（圖7D）結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了P-MoO3-x 良好的生物相容性。如圖7B 所示，與對(duì)照組相比，處理組的細(xì)胞具有更好的形態(tài)、增殖能力和遷移能力。處理組的遷移能力優(yōu)于對(duì)照組，表明吡喃葡萄糖作為細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)具有一定的促進(jìn)作用。采用150 μg/mL P-MoO3-x 處理的血液樣本中，所有生理指標(biāo)均與對(duì)照組無(wú)顯著差異（圖7C），主要器官無(wú)明顯損傷或組織學(xué)異常（圖7D）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， P-MoO3-x 具有良好的生物相容性和低細(xì)胞毒性，對(duì)銅綠假單胞菌具有較高的殺菌效果，對(duì)正常組織無(wú)顯著影響。

2.6 P-MoO3-x 的抗菌機(jī)理研究

細(xì)菌外膜或細(xì)胞壁的物理或化學(xué)損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)蛋白等成分泄漏，從而產(chǎn)生殺菌作用。如圖8A 和8B 所示，經(jīng)P-MoO3-x 處理4 h 后，蛋白泄露量呈現(xiàn)出劑量依賴性的顯著增加，這表明P-MoO3-x 可以有效破壞銅綠假單胞菌的細(xì)胞膜。TEM 表征結(jié)果（圖8C）也表明，未經(jīng)處理的細(xì)菌顯示出更完整的細(xì)胞壁/膜，并且顏色偏深，細(xì)菌內(nèi)部的物質(zhì)并未外泄。經(jīng)NIR+H2O2+P-MoO3-x 處理后，可明顯觀察到材料結(jié)合在細(xì)菌表面（圖8D），這是由于吡喃葡萄糖與銅綠假單胞菌的結(jié)合作用輔助材料緊貼細(xì)菌，有利于縮短ROS 的作用距離，提高材料的滅菌性能。處理后的細(xì)菌的細(xì)胞壁/膜不完整，細(xì)菌的顏色由于胞內(nèi)物質(zhì)外泄而明顯變淺，說(shuō)明在P-MoO3-x 的類過(guò)氧化物酶催化活性下產(chǎn)生的·OH 破壞了細(xì)菌的細(xì)胞壁/膜。

采用瓊脂糖凝膠電泳分析經(jīng)P-MoO3-x+H2O2+NIR 處理和未處理的銅綠假單胞菌二者之間的DNA 損傷情況（圖8E）。處理過(guò)的細(xì)菌基因組條帶的亮度弱于對(duì)照組，并且分散在整條泳道上，表明P-MoO3-x 不僅會(huì)損傷細(xì)胞膜，還會(huì)破壞細(xì)菌的核酸，使DNA 斷裂成小片段。P-MoO3-x 通過(guò)發(fā)揮類過(guò)氧化物酶活性產(chǎn)生毒性·OH，對(duì)細(xì)菌結(jié)構(gòu)和核酸造成損傷，從而實(shí)現(xiàn)良好的抗菌效果。

3 結(jié)論

采用水熱法制備了具有高類過(guò)氧化物酶催化活性和光熱性能的P-MoO3-x 納米酶，并對(duì)其抗菌性能和生物相容性進(jìn)行了分析。在較低濃度的H2O2 條件下，利用P-MoO3-x 的高類過(guò)氧化物酶催化活性介導(dǎo)的CDT 治療和PTT 治療，實(shí)現(xiàn)了對(duì)銅綠假單胞菌的高效抗菌。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此納米酶的生物相容性良好，對(duì)細(xì)胞的毒性小，有利于細(xì)胞遷移，并且會(huì)破壞銅綠假單胞菌的細(xì)菌膜和基因組DNA。將P-MoO3-x 應(yīng)用于治療小鼠傷口感染，效果良好。本研究提出的P-MoO3-x 類過(guò)氧化物酶協(xié)同抗菌體系展現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌效果，可以有效預(yù)防傷口感染，促進(jìn)傷口愈合。

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