基于高分辨串聯(lián)質(zhì)譜的人血清多肽組總體特征和分布規(guī)律研究

摘要 血清多肽組生物標志物的研究通常采用比較多肽相對含量的方法進行，但有關(guān)人血清多肽組中多肽的分布規(guī)律研究尚未見報道。本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析了50 位志愿者的血清多肽組，比較和歸納了鑒定得到的肽段及其歸屬蛋白質(zhì)的數(shù)量、肽段強度以及肽段序列特點，考察了血清多肽組的分布規(guī)律。結(jié)果表明，肽段在蛋白質(zhì)水平上的分布具有明顯的不均一性，排名在前20%的優(yōu)勢降解蛋白質(zhì)占據(jù)了大約78%的總肽段數(shù)量和85%的總肽段強度，而對于排名靠后的約40%的降解蛋白質(zhì)僅能檢測出一條肽段；在血清樣品中檢測到的肽段數(shù)目與其歸屬的降解蛋白數(shù)目正相關(guān)，在血清多肽組中總是存在一系列分子量相近但序列不同的肽段。進一步以胸腺素β4、補體C3 和纖維蛋白原α鏈等多種降解蛋白為例，闡明了在優(yōu)勢降解蛋白中總是存在一系列相對集中和連續(xù)的酶切位點，由此產(chǎn)生的一系列階梯序列或相關(guān)序列肽段是多肽組肽段分布不均的原因。本研究發(fā)現(xiàn)，在不同樣本中各降解肽段的信號絕對強度差異很大，甚至達到百倍以上；但是，某些信號強度較高的肽段在不同樣本中具有相對穩(wěn)定的特性，并被頻繁地報道為疾病生物標志物。這些血清多肽組的分布規(guī)律和特點不僅可為生物標志物的選擇標準提供新的參考，也可用于分離以及質(zhì)譜分析過程中方法學的質(zhì)量評價。

關(guān)鍵詞 多肽組；血清；分布規(guī)律；生物標志物；高分辨串聯(lián)質(zhì)譜

多肽組學的概念最早出現(xiàn)于2001 年，通常是指生物樣品中分子量小于10 kDa 的全部肽段或多肽[1]，生物標志物研究是近年來多肽組學的主要應用之一[2]。血液樣品具有易獲取、穩(wěn)定和微創(chuàng)的特點，其成分能夠揭示組織和器官的整體病理生理狀況，提供深入了解人體健康狀態(tài)的有效途徑[3-4]。血清多肽組是指存在于血液中特別是血清中的一系列小分子多肽的總稱，血清多肽組在一定程度上可以反映機體的生理特性，已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)血液生物標志物的重要方法，目前已用于多種疾病生物標志物的發(fā)現(xiàn)[5-8]。

早期的血清多肽組學研究通常采用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜（Matrix-assisted laserdesorption ionization time-of-flight mass spectrometry， MALDI-TOF MS）方法[9]，利用分子量表征肽段，進而通過比較不同肽段的離子強度篩選生物標志物[10]，但是，由于電離抑制效應，通常檢測到的肽段數(shù)目較少。液相色譜（Liquid chromatography， LC）-MALDI 或使用串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（Tandem time-of-flight massspectrometry， TOF/TOF）[11]可以獲得更多的肽段數(shù)目和序列信息，并且具有實現(xiàn)組織成像和量化生物標志物水平進而徹底改變癌癥診斷的潛力[12-13]， 但是，非胰蛋白酶酶切肽段在MALDI-TOF/TOF 中的斷裂不充分。近年來，高分辨質(zhì)譜技術(shù)愈發(fā)成熟，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（High-performance liquid chromatographytandemmass spectrometry， HPLC-MS/MS）成為了血清多肽組分析的重要方法，相較于前者，經(jīng)過液相色譜分離后檢出的肽段數(shù)目更多，在獲得多肽的氨基酸序列信息的同時能夠鑒定的肽段豐度范圍更廣[14]。因此，目前通常采用HPLC-MS/MS 方法研究血清多肽組學。多肽組學也從早期的以分子量為表征標志發(fā)展為鑒定肽段序列、描述樣本中肽的特征、獲得其潛在活性以及如何與環(huán)境相互作用的信息[15]。但是，目前血清多肽組標志物的選擇仍以肽段的強度變化為依據(jù)，對于人血清多肽組是否存在統(tǒng)一的規(guī)律的研究很少，而了解這種規(guī)律不僅可以幫助研究者更好地理解蛋白質(zhì)的功能和降解機制，也能更加精準地選擇潛在的生物標志物。本研究采用HPLC-MS/MS 技術(shù)分析了50 位志愿者的血清多肽組，比較和歸納了鑒定得到的肽段及其歸屬蛋白質(zhì)的數(shù)量、肽段強度以及肽段序列特點，考察了血清多肽組的分布規(guī)律。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Eksigent nano LC-UltraTM 2D 系統(tǒng)、LC-MS/MS 5600 高分辨質(zhì)譜和Protein Pilot 4.5 軟件（美國ABSCIEX 公司）；Y26X-442136-YX 真空冷凍干燥機（美國Thermo Savant 公司）；Centrifuge 5804R 低溫離心機（德國Eppendorf 公司）；PierceTM C18 Tips 固相萃取柱、Acclaim PepMapTM C18 預柱和超純水儀（美國Thermo Scientific 公司）。

氧化石墨烯-磷酸鑭納米磁性復合材料（LaGM）為本實驗室合成[10]；三氟乙酸（TFA）、乙腈（ACN）和甲酸（質(zhì)譜純，美國Sigma Aldrich 公司）。實驗用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 血清多肽的分離和富集

實驗所用樣本來自深圳大學總醫(yī)院志愿者，均知情同意，并經(jīng)深圳大學醫(yī)學部倫理委員會批準。在1.5 mL EP 管中加入1 mL 血液樣品， 4 ℃條件下以12000 r/min 離心10 min。移取上清液，去除沉淀，加入30 μL 氧化石墨烯-磷酸鑭納米磁性復合材料（30 mg/mL）， 振蕩5 min 后，置于恒溫混勻器上渦旋10 min，采用相同的方法離心，去除上清液；加入500 μL 去離子水，振蕩5 min， 渦旋10 min， 采用相同的方法離心，棄去上清液，重復此操作兩次；加入20 μL 洗脫液（80% ACN-0.1% TFA 混合溶液），振蕩5 min， 渦旋10 min， 采用相同方法離心，收集上清液，重復一次，將兩次上清液合并，采用相同方法離心，收集上清液并將其置于真空冷凍干燥機中40 min， 使溶劑蒸發(fā)，收集固體，備用。

1.3 液相色譜分析

納升液相色譜流動相A（Nano-reverse phase liquid chromatography buffer A， Nano-RPLC Buffer A）為含0.1%甲酸的水-乙腈溶液（98∶2， V/V），納升液相色譜流動相B（Nano-reverse phase liquid chromatographybuffer B， Nano-RPLC Buffer B）為含0.1%甲酸的乙腈-水溶液（98∶2， V/V）。將收集的固體多肽樣品重新溶解于20 μL Nano-RPLC Buffer A （2% ACN+0.1% TFA）中，渦旋10 min， 4 ℃條件下以12000 r/min 離心10 min。取18 μL 上清液進行在線Nano-RPLC 液相色譜分析。實驗在EksigentnanLC-UltraTM2D 系統(tǒng)（AB SCIEX）中進行，樣品溶液以2 μL/min 的流速上樣到Acclaim PepMapTM C18 預柱（75 μm×2 cm， 3 μm，10 nm， 美國Thermo Scientific 公司）中，然后用Buffer A 溶液以相同流速沖洗脫鹽10 min。分析柱為ChromXP Eksigent C18 反相色譜柱（75 μm×15 cm， 3 μm， 12 nm）。梯度洗脫條件：0～42 min， 5%～25% B;42～56 min， 25%～40% B; 56～64 min， 80% B; 64～70 min， 5% B。

1.4 質(zhì)譜分析

質(zhì)譜分析在配備有納升噴霧Ⅲ離子源（美國AB SCIEX 公司）的Triple TOF 5600 系統(tǒng)中進行，噴霧電壓為2.4 kV， 氣簾氣壓和霧化氣壓分別為30 和5 psi（1 psi=6.9 kPa）， 溫度為150 ℃。質(zhì)譜掃描方式為信息依賴的采集工作模式（Information dependent analysis， IDA），一級TOF-MS 單張圖譜掃描時間為250 ms， 每次IDA 循環(huán)最多采集35 個電荷（2+～8+）并且單秒計數(shù)大于100 的二級圖譜，每張二級圖譜的累積時間為80 ms。每次循環(huán)時間固定為2.5 s， 碰撞室能量設定為適用于所有前體離子碰撞誘導解離（CID），動態(tài)排除設置為11 s。

1.5 數(shù)據(jù)分析

將質(zhì)譜數(shù)據(jù)保存為wiff 圖譜文件，傳送到Protein Pilot Software 4.5 軟件的analysis 文件夾中，打開ProteinPilot Software 4.5，選擇新建項目，然后選擇離子化方式，選擇需要搜庫的wiff 文件，選擇蛋白庫（2018 年1 月2 日在uniprot 庫中下載的Homosapiens 人種全蛋白數(shù)據(jù)庫）和翻譯后修飾；檢索參數(shù)設置為磷酸化修飾（+79.97）、氧化修飾（+15.99）、脫酰胺（+0.98）和氨基酸取代，酶切選項選擇非酶切。搜庫完成后，將假陽性率控制為1%，輸出Excel 數(shù)據(jù)文件。

對Protein Pilot Software 4.5 軟件輸出的Excel 數(shù)據(jù)文件進行數(shù)據(jù)處理。以置信度（Confidence）為篩選條件，去除分數(shù)低于95 以下的肽段，隨后以肽段序列為篩選條件去除重復肽段，統(tǒng)計所有數(shù)據(jù)中肽段和歸屬蛋白的數(shù)目和種類，采用COUNTIF 函數(shù)進行歸類分析，得到每個蛋白質(zhì)和肽段在各個樣品中的頻率?；诘玫降碾亩涡蛄袛?shù)據(jù)，使用SnapGene 軟件對肽段降解位點進行標記，并利用Origin 軟件對肽段強度進行表征。

2 結(jié)果與討論

2.1 血清多肽組的總體特征和個體差異

本研究將序列相同但修飾不同的肽段視為差異肽段，共檢測到歸屬于757 個蛋白質(zhì)的5452 條特異性肽段。如圖1 所示，與本研究組前期小樣本（6 個）的研究結(jié)果[10]類似，在50 個樣本中，肽段在降解蛋白質(zhì)水平上并非平均分布（見電子版文后支持信息表S1）。前20%的降解蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的肽段數(shù)目占總肽段數(shù)目的69%～87%，平均值為78%。肽段的強度變化更加明顯，歸屬于前20%的降解蛋白質(zhì)的肽段總強度占總肽段強度的68%～98%，平均值為85%（圖1A），即血清多肽組的多肽數(shù)目和強度分布都呈現(xiàn)不均一性，前20%的優(yōu)勢降解蛋白質(zhì)貢獻了約80%的肽段數(shù)目和信號強度。其次，在每個樣本中排名第一的降解蛋白質(zhì)檢測到的肽段數(shù)目最多，在50 個樣本中，其肽段數(shù)目占總肽段的9%～62%，平均值為26%；此外，在38%～69%（平均值59%）的歸屬蛋白中均檢出一條以上的降解肽段，并且這些肽段通常具有序列相關(guān)性，但排名靠后的40%蛋白只能檢出一條肽段（見電子版文后支持信息表S2）。值得注意的是，該特征并不局限于人血清樣本，例如， Zheng 等[16]對低分子量牛血清多肽組進行了分析，共檢測出歸屬于61 個蛋白質(zhì)的345 條特異性肽段，其中，前20%的歸屬蛋白質(zhì)降解了276 條肽段，占總肽段的80%。血清樣品中檢測到的肽段數(shù)目與其歸屬蛋白數(shù)目之間的R2gt;0.5，表明兩個變量之間存在正相關(guān)性（圖1B）。本研究還發(fā)現(xiàn)了一系列分子量相近但序列不同的肽段，而且這些肽段還可能存在于同一樣本中（表1），此結(jié)果提示利用MALDI-TOF 將分子量作為標志物的篩選依據(jù)[17]的方法具有潛在的局限性。

血清多肽組的肽段數(shù)目表現(xiàn)出了明顯的個體差異（見電子版文后支持信息表S1）。例如，檢測到的多肽數(shù)目最多的是4 號樣本，共鑒定到1499 條肽段，而在25 號樣本中只鑒定到195 條肽段， 50 個樣本鑒定到的降解肽段的均值為620 條。此外，在個體水平上肽段數(shù)目與其歸屬的降解蛋白質(zhì)數(shù)目并非總是正相關(guān)，例如在樣品5 中鑒定到屬于93 種蛋白質(zhì)的405 條肽段，而在樣品27 中鑒定到1092 條肽段，但對應的降解蛋白質(zhì)僅有53 種。

2.2 血清多肽組降解蛋白質(zhì)的梯度序列特征

當歸屬于同一種蛋白質(zhì)的降解肽段數(shù)目大于3 時，通常具有序列關(guān)聯(lián)性。為了更清楚地闡明此關(guān)聯(lián)性，整合50 個樣本的結(jié)果分析血清多肽組的規(guī)律，結(jié)果表明，在2 個以上樣本的血清多肽組中鑒定到的降解蛋白質(zhì)共有347 種，占總數(shù)的46%，其中出現(xiàn)頻率最高的前5 種為胸腺素β4（Thymosin beta-4）、補體C3（Complement C3）、α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4（Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4）、纖維蛋白原α 鏈（Fibrinogen alpha chain）和α2-巨球蛋白（Alpha-2-macroglobulin），在49 個以上的樣本中被檢出。本研究主要以這5 種出現(xiàn)頻率高的蛋白質(zhì)降解的肽段為例，說明血清多肽的分布規(guī)律。

將肽段N 端或C 端逐級相差一個氨基酸殘基的肽段稱為階梯序列肽段[1]。本研究選取的5 種蛋白質(zhì)中，前4 種均表現(xiàn)出明顯的階梯序列特征（具體肽段序列見電子版文后支持信息表S3～S6）。以胸腺素β4 為例進行說明，歸屬于胸腺素β4 的最短肽段為SDKPDMAEIEK，以此為起點，可發(fā)現(xiàn)該肽段的羧基依次增加1 個或2 個氨基酸的肽段；類似的，以肽段SKETIEQEKQAGES 為起點，檢測到了25 條氨基端連續(xù)增加一個氨基酸殘基的肽段，所有這些肽段都是由最長肽段SDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES逐步降解產(chǎn)生（見電子版文后支持信息表S3）。階梯序列肽段在補體C3 蛋白質(zhì)、α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4 和纖維素蛋白原α 鏈中也非常明顯（但并不限于這些降解蛋白質(zhì)），即在人血清多肽組中一定存在階梯序列，這與蛋白質(zhì)組學研究中通過特異性酶切產(chǎn)生的序列分布形式截然不同。將50 個血清多肽組的數(shù)據(jù)整合并在整體水平上進行分析時，階梯序列的規(guī)律變得更清晰。例如，在1 號、5 號和7 號樣本中，補體C3 蛋白僅降解了2 條肽段，并未發(fā)現(xiàn)明顯的關(guān)聯(lián)肽段。然而，在46 號樣本中檢出了高達26 條肽段，從中可以清晰地觀察到階梯序列的特征，該特點也為深入理解血清多肽組的復雜性提供了新的視角。

2.3 血清多肽組的準連續(xù)酶切

在分析個體肽段時，觀察到了酶切位點具有在蛋白質(zhì)序列的特定區(qū)域聚集的趨勢，通過匯總并統(tǒng)計志愿者樣本中5 種蛋白質(zhì)的酶切位點及相應階梯肽段的數(shù)量（表2），發(fā)現(xiàn)這種趨勢更明顯，而且酶切位點的總數(shù)與階梯序列在所有檢測到的肽段中的占比存在相關(guān)性。當階梯序列存在時，酶切位點更傾向于在序列的某些區(qū)域集中且連續(xù)分布。首先，胸腺素β4 在所有樣本中均被檢出，共鑒定出89 條特異性肽段。由圖2 可見，胸腺素β4 全序列包含44 個氨基酸，而在50 個樣本中共發(fā)現(xiàn)了41 個酶切位點。因此，來源于胸腺素β4 的降解肽段在總體上展現(xiàn)出幾乎完全連續(xù)的階梯序列肽段分布。

補體C3 蛋白的全序列包含1663 個氨基酸，在所有樣本中共檢測出48 條特異性肽段和46 個酶切位點，盡管這些酶切位點相對于全序列的氨基酸數(shù)量而言很少，但在1304～1338 這個特定的氨基酸序列區(qū)間內(nèi)，觀察到22 個降解位點，呈現(xiàn)出比較連續(xù)的酶切現(xiàn)象（圖3）。

同樣地，在α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4 中檢測出158 條特異性肽段（圖4），其中134 條為相關(guān)序列肽段，并且在610～690 的蛋白質(zhì)區(qū)間內(nèi)，發(fā)現(xiàn)了60 個幾乎緊密相連的酶切位點，而其它序列區(qū)間檢測到的肽段較少。

纖維素蛋白原α 鏈的全序列共包含866 個氨基酸，在特定的4 個區(qū)域，即1～36、100～129、237～281和413～625 區(qū)間內(nèi)，酶切位點呈現(xiàn)出顯著的連續(xù)性和集中性（圖5），這些位點的連續(xù)酶切產(chǎn)生了大量階梯序列肽段，而這些肽段經(jīng)常出現(xiàn)于文獻報道中[18-20]。

當降解蛋白質(zhì)的檢出肽段數(shù)量較少時，雖然無法觀察到明顯的階梯序列肽段，但仍能檢測到序列相關(guān)的肽段。以α2-巨球蛋白為例，盡管在49 個樣本中都能夠被檢出，但僅發(fā)現(xiàn)了8 條特異的肽段，其中頻數(shù)最高的肽段為VGFYESDVMGR；α2-巨球蛋白全序列包含1474 個氨基酸，但酶切位點卻僅有8 個位點，主要集中在668～716 區(qū)間內(nèi)（圖6）。

載脂蛋白A-I（Apolipoprotein A-I）、踝蛋白（Talin-1）和血紅蛋白α 亞基（Hemoglobin subunit alpha）等其它相對低頻的降解蛋白也具有上述特征，都具有相對集中且連續(xù)的酶切區(qū)域。例如，血紅蛋白α 亞基全序列包含142 個氨基酸，包含100 個酶切位點（見電子版文后支持信息圖S1），因此，可以推測，具有相對集中且連續(xù)的酶切區(qū)域是優(yōu)勢降解蛋白的普遍特征，這也可以解釋在實驗中檢測到優(yōu)勢降解蛋白質(zhì)的某一特定肽段時，通常能夠同時發(fā)現(xiàn)該肽段的其它序列相關(guān)肽段。例如， Wen 等[18]識別出包括RGSESGIFTNTKESSS在內(nèi)的13 個歸屬于纖維蛋白原α 鏈的相關(guān)序列肽段，并將其作為共同的子癇前期潛在生物標志物。在本研究中有53條特異性肽段都包含該序列。Zhao 等[ 21]認為胸腺素β4 的降解肽段DKPDMAEIEKFDKSKLK 是脊髓損傷的重要潛在標志物，在本研究中該肽段的相關(guān)序列肽段多達上百條。De Oliveira 等[19]提出歸屬于補體C3 蛋白質(zhì)的降解肽段HWESASLL 為胃腺癌患者的潛在生物標志物，而本研究中檢測到該肽段相關(guān)的最短肽段為IHWESASLL，最長肽段為SSKITHRIHWESASLLR。因此，不難看出，很多文獻中提出的多肽生物標志物實際上僅僅是一系列序列相關(guān)肽段中的某一條肽段，說明根據(jù)肽段表達水平的差異尋找生物標志物具有一定的隨機性。此外，對于血紅蛋白、胸腺素β4 和纖維蛋白原α鏈等蛋白質(zhì)，多肽組的酶切幾乎發(fā)生于蛋白質(zhì)全部序列，而α2-巨球蛋白等的降解僅發(fā)生在很窄的范圍，其原因尚需進一步探究。

2.4 血清多肽組主要降解肽段的強度分析

為考察肽段出現(xiàn)頻率與其信號強度的關(guān)系，選取頻數(shù)超過10 的部分序列肽段進行熱圖表征。在比較50 個樣本中肽段的絕對強度時發(fā)現(xiàn)，歸屬于胸腺素β4 的部分序列肽段的絕對強度差異顯著，最高可達100 倍以上，在不同樣本之間未發(fā)現(xiàn)明顯的規(guī)律性。然而，這些肽段的相對強度在不同樣本中具有一定的穩(wěn)定性。例如， SDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES 和KNPLPSKETIEQEKQAGES這兩個歸屬于胸腺素β4 的降解肽段，在所有樣本中均能被檢出。經(jīng)歸一化處理后，前者在25 個樣本中的信號強度超過90，在50 個樣本中的平均值為75.74；后者在11 個樣本中強度超過90，平均值為56.22。同時，為了突出小峰的差異，本研究取相對強度的對數(shù)后進行歸一化處理（圖7）。與胸腺素β4 類似，這種肽段相對強度在不同樣本中的穩(wěn)定性也體現(xiàn)在另外3 種蛋白質(zhì)中，具體而言，補體C3 中的降解肽段SSKITHRIHWESASLLR、α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4 的降解肽段QLGLPGPPDVPDHAAYHPF以及纖維蛋白原α 鏈的降解肽段ADEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPV 因其高頻出現(xiàn)而展現(xiàn)出較高的肽段相對強度（見電子版文后支持信息圖S2～S4）。以上結(jié)果表明，雖然不同樣本之間血清多肽的含量和信號強度可能相差較大，但有些多肽具有一定的穩(wěn)定性，出現(xiàn)頻率高，這種特性也使其更易被選為生物標志物。例如， α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4 的降解肽段QLGLPGPPDVPDHAAYHPF 已被視為預測后續(xù)自發(fā)性早產(chǎn)[22]和胃腺癌[19]的潛在生物標志物。在本研究的47 個樣本中，該肽段均以較高的相對強度被檢出（見電子版文后支持信息圖S3）。同樣，纖維蛋白原α 鏈的降解產(chǎn)物ADSGEGDFLAEGGGVR 和DSGEGDFLAEGGGVR 被認為是子癇前期[18]、胃腺癌[19]和潰瘍性結(jié)腸炎[20]的潛在生物標志物。本研究中，上述兩種標志物在46個樣本中均可被檢測到，并且同樣具有較高的相對強度（見電子版文后支持信息圖S4）。

3 結(jié)論

在血清多肽組中存在一系列階梯序列或相關(guān)序列肽段，其產(chǎn)生源自優(yōu)勢降解蛋白質(zhì)的特定區(qū)域發(fā)生連續(xù)酶切，這種降解模式不僅導致血清多肽組的肽段數(shù)目和強度的分布不均，也反映了多肽組形成過程中蛋白質(zhì)降解的連續(xù)性，而且相對強度較高的肽段的檢出具有一定的規(guī)律性和重現(xiàn)性。這些發(fā)現(xiàn)揭示了人血清多肽組的分布規(guī)律，有助于更全面地理解血清多肽組的復雜性和多樣性，提示降解蛋白質(zhì)比血清多肽更適合作為生物標志物。

References

[1] SCHRADER M， SCHULZ-KNAPPE P. Trends Biotechnol. ， 2001， 19（10）： S55-S60.

[2] LIN L， ZHENG J X， ZHENG F J， CAI Z L， YU Q. J. Proteomics， 2020， 215： 103671.

[3] CHAMI N， LETTRE G. Genes， 2014， 5（1）： 51-64.

[4] YU X， SCHWENK J M， XU P， LABAER J. Proteomics： Clin. Appl. ， 2022， 16（6）： e2200083.

[5] KONTOSTATHI G， MAKRIDAKIS M， ZOIDAKIS J， VLAHOU A. Expert Rev. Mol. Diagn. ， 2019， 19（6）： 499-515.

[6] MENSCHAERT G， VANDEKERCKHOVE T T， BAGGERMAN G， SCHOOFS L， LUYTEN W， VAN CRIEKINGE W. J.Proteome Res. ， 2010， 9（5）： 2051-2061.

[7] TAMMEN H， PECK A， BUDDE P， ZUCHT H D. Expert Rev. Mol. Diagn. ， 2007， 7（5）： 605-613.

[8] WANG Y， LIU X， LIU D， CHENG M， ZHAO N， HE M， ZHANG X. Proteomics： Clin. Appl. ， 2021， 15（6）： e2000058.

[9] WIJTE D， MCDONNELL L A， BALOG C I， BOSSERS K， DEELDER A M， SWAAB D F， VERHAAGEN J， MAYBORODA O A. Methods， 2012， 56（4）： 500-507.

[10] KONG Xiang-Yi， SHI Kai， CONG Le-Le， WANG Jing， JIANG Li-Jun， HONG Xiao-Yu， LI Shui-Ming， WANG Yong，ZHAO Qing. Chin. J. Anal. Chem. ， 2017， 45（1）： 133-138.

孔祥怡， 石鍇， 叢樂樂， 王靜， 蔣立軍， 洪曉愉， 李水明， 王勇， 趙晴. 分析化學， 2017， 45（1）： 133-138.

[11] VESTAL M L， CAMPBELL J M. Methods Enzymol. ， 2005， 402： 79-108.

[12] HUSSON S J， LANDUYT B， NYS T， BAGGERMAN G， BOONEN K， CLYNEN E， LINDEMANS M， JANSSEN T，SCHOOFS L. Peptides， 2009， 30（3）： 449-457.

[13] MAJEROVA P， BARATH P， MICHALICOVA A， KATINA S， NOVAK M， KOVAC A. J. Alzheimer′s Dis. ， 2017， 58（2）：507-520.

[14] YANG Qian， WANG Dan， CHANG Li-Li， SUN Yong， JIN Xiang， WANG Xu-Chu. Chin. Agric. Sci. Bull. ， 2015， 31（1）： 239-246.

楊倩， 王丹， 常麗麗， 孫勇， 靳翔， 王旭初. 中國農(nóng)學通報， 2015， 31（1）： 239-246.

[15] FOREMAN R E， GEORGE A L， REIMANN F， GRIBBLE F M， KAY R G. J. Proteome Res. ， 2021， 20（8）： 3782-3797.

[16] ZHENG X Y， BAKER H， HANCOCK W S. J. Chromatogr. A， 2006， 1120（1-2）： 173-184.

[17] SONG W， WANG N A， LI W， WANG G， HU J， HE K， LI Y， MENG Y， CHEN N， WANG S， HU L， XU B， WANG J， LI A，CUI J. Oncol. Lett. ， 2013， 6（5）： 1453-1460.

[18] WEN Q， LIU L Y， YANG T， ALEV C， WU S， STEVENSON D K， SHENG G， BUTTE A J， LING X B. PLoS One， 2013， 8（6）：e5571.

[19] DE OLIVEIRA T M， DE LACERDA J T J G， LEITE G G F， DIAS M， MENDES M A， KASSAB P， SILVA C G S E，JULIANO M A， FORONES N M. Clin. Biochem. ， 2020， 79： 61-69.

[20] MIAO Z W， DING K， JIN S Y， DAI L， DAI C， LI X. J. Pharm. Biomed. Anal. ， 2021， 193： 113725.

[21] ZHAO Y， TONG D， WANG M， XU C， GONG X， WANG Z， LI C. Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expression， 2022， 32（2）： 1-9.

[22] ESPLIN M S， MERRELL K， GOLDENBERG R， LAI Y， IAMS J D， MERCER B， SPONG C Y， MIODOVNIK M， SIMHAN H N， VAN DORSTEN P， DOMBROWSKI M. Am. J. Obstet. Gynecol. ， 2011， 204（5）： 391. E1-391. E8.

深港腦科學創(chuàng)新研究院項目（No. 2023SHIBS0003）資助。