分析泛素特異性蛋白酶5在不同腫瘤中的致癌作用

【摘要】目的 分析泛素特異性蛋白酶5（USP5）在不同腫瘤中的致癌作用，為臨床治療提供參考。方法 利用癌癥基因組圖譜（TCGA）、基因型組織表達（GTEx）、基因表達譜交互式分析2（GEPIA2）分析USP5 mRNA在不同腫瘤中的表達情況，USP5與不同癌癥患者病理分期的相關性。利用GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析USP5表達與不同癌癥患者預后的相關性。利用cBioPortal數(shù)據(jù)庫分析USP5基因變異情況。利用UCLCAN數(shù)據(jù)庫分析USP5磷酸化水平。利用TIMER2數(shù)據(jù)庫分析USP5表達與腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）免疫浸潤的相關性。利用STRING、GEPIA2、注釋、可視化及綜合發(fā)現(xiàn)（DAVID）數(shù)據(jù)庫構建USP5相關基因的富集圖。結(jié)果 USP5在多種腫瘤中的表達顯著增高，而在急性髓性白血?。↙AML）中表達顯著降低；USP5蛋白在乳腺癌（BRCA）、結(jié)腸腺癌（COAD）、膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）、肺腺癌（LUAD）及胰腺癌（PAAD）中表達明顯偏低；USP5蛋白在腎透明細胞癌（KIRC）、肺鱗癌（LUSC）及卵巢癌（OV）中表達明顯偏高；USP5表達與BRCA、KIRC、肝細胞癌（LIHC）、LUAD、OV及PAAD的病理分期之間存在顯著關系（均P<0.05）。USP5的高表達與LAML、LUAD、皮膚黑色素瘤（SKCM）及葡萄膜黑色素瘤（UVM）的總體生存率（OS）呈正相關（均P<0.05）。子宮內(nèi)膜癌（UCEC）中USP5的改變頻率最高，主要改變類型為突變；子宮癌肉瘤（UCS）中USP5改變頻率次高，主要類型為“擴增”。進一步分析USP5的額外突變和位置，未獲得主導性的遺傳改變，遺傳改變的位置較少。USP5在COAD、GBM等腫瘤中顯著的去磷酸化。宮頸鱗狀細胞癌（CESC）、頭頸部鱗狀細胞癌（HNSC）、HPV陰性HNSC的CAFs與USP5水平呈正相關（均P<0.05）?！昂瞬糠帧薄昂饲弧薄凹艚芋w”“泛素介導的蛋白水解”可能參與USP5在腫瘤發(fā)生中的作用。結(jié)論 USP5表達水平與生存預后、基因突變、免疫浸潤及與USP5相關基因富集之間有相關性，有助于從多個方面了解USP5在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用，為今后腫瘤免疫治療方面的研究提供理論依據(jù)。

【關鍵詞】泛素特異性蛋白酶5；腫瘤；基因突變；免疫浸潤

【中圖分類號】R730.2 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-2665.2024.18.0030.07

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2024.18.010

惡性腫瘤的發(fā)生機制十分復雜，篩選疾病進展中的關鍵基因并對其進行綜合泛癌分析、探究其臨床意義對深入理解腫瘤發(fā)生發(fā)展機制、提高早期診斷率、改善預后評估、指導臨床治療具有重要意義。去泛素化是一種常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程，參與調(diào)節(jié)多種生理功能和病理過程，包括細胞周期進程、信號轉(zhuǎn)導等[1]。去泛素化酶（DUB）能夠識別并切割泛素與靶蛋白之間的連接，從而介導泛素鏈的可逆去除、維持細胞穩(wěn)態(tài)[2]。泛素特異性蛋白酶5（USP5）是一種半胱氨酸去泛素化酶[3]。多項研究顯示， USP5在多種癌癥中異常表達，如膽管癌（cholangiocarcinoma， CHOL）[4]、膀胱癌[5]、乳腺癌（breast invasive carcinoma， BRCA）[6]、肝細胞癌（liver hepatocellular carcinoma， LIHC）[7]等。 USP5與癌癥發(fā)展中的關鍵分子和通路密切相關，但目前尚不清楚USP5在不同癌癥中的具體作用機制?；诖耍狙芯刻骄縐SP5在不同腫瘤中的致癌作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法 ⑴USP5在不同腫瘤中的表達情況及相關性分析。利用癌癥基因組圖譜（TCGA）和基因型組織表達（GTEx）數(shù)據(jù)庫篩選出33種癌癥類型、癌旁細胞、正常樣本的USP5 mRNA數(shù)據(jù)。利用CPTAC 數(shù)據(jù)庫分析不同腫瘤中的USP5蛋白表達水平。利用基因表達譜交互式分析2（GEPIA2）數(shù)據(jù)庫分析USP5表達與不同癌癥病理分期的相關性。利用R包進行統(tǒng)計學分析，利用ggplot2包進行可視化分析。組間差異比較采用 Wilcoxon 秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。⑵USP5表達與不同癌癥患者預后的相關性分析。利用GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析不同腫瘤中USP5基因的總體生存率（OS）的顯著性地圖數(shù)據(jù)（設置組分割點=中位數(shù)）。采用Log-Rank方法進行統(tǒng)計學假設檢驗。⑶USP5基因變異情況分析。利用cBioPortal數(shù)據(jù)庫獲取USP5的遺傳改變特征。遺傳改變特征包括改變頻率、突變類型、突變位點信息、拷貝數(shù)改變及蛋白質(zhì)的三維結(jié)構。⑷USP5磷酸化水平分析。利用UCLCAN數(shù)據(jù)庫獲取不同腫瘤中USP5的磷酸化水平。⑸USP5表達與腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）免疫浸潤的相關性分析。利用TIMER2數(shù)據(jù)庫獲取USP5表達與CAFs免疫浸潤間的關聯(lián)數(shù)據(jù)，將USP5輸入“基因名稱”字段進行分析。采用熱圖和散點圖呈現(xiàn)結(jié)果。使用TIMER算法， EPIC、 XCELL、 MCPCOUNTER、 CIBERSORT-ABS、 QUANTISEQ及CIBERSORT評估免疫浸潤的程度。⑹構建USP5相關基因的富集圖。利用STRING數(shù)據(jù)庫篩選與USP5結(jié)合的蛋白質(zhì)。設置參數(shù)：最低交互所需的分數(shù)[低置信度（0.150）]，顯示的互作蛋白質(zhì)的最大數(shù)量（≤50個），網(wǎng)絡邊緣的示例（證據(jù)）和活躍的相互作用（實驗）；檢測可以與USP5結(jié)合的蛋白質(zhì)。利用GEPIA2數(shù)據(jù)庫篩選與USP5相關的前100個靶向基因，并與USP5進行基因Pearson相關性成對分析。使用log2 TPM的均值計算點圖。使用TIMER2的Gene_Corr模塊呈現(xiàn)熱圖數(shù)據(jù)。使用校正純度測試計算Spearman等級相關性。利用注釋、可視化和綜合發(fā)現(xiàn)（DAVID）數(shù)據(jù)庫和ggplot2包分析代謝通路公共（KEGG）通路，結(jié)果以氣泡圖形式呈現(xiàn)。利用cluster Profiler包和R語言軟件分析基因本體（GO）富集，根據(jù)結(jié)果生成條形圖。

2 結(jié)果

2.1 USP5mRNA在不同腫瘤中的表達情況及相關性分析結(jié)果 USP5在腎上腺皮質(zhì)癌（adrenocortical carcinoma， ACC）、 BRCA、宮頸鱗狀細胞癌（cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma， CESC）、 CHOL、結(jié)腸腺癌（colon adenocarcinoma， COAD）、彌漫性大B細胞淋巴瘤（lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma， DLBC）、食管癌（esophageal carcinoma， ESCA）、膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma multiforme， GBM）、 頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma， HNSC）、腎乳頭狀細胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma， KIRP）、腦低級別膠質(zhì)瘤（brain lower grade glioma， LGG）、 LIHC、肺腺癌（lung adenocarcinoma， LUAD）、肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma， LUSC）、卵巢癌（ovarian serous cystadenocarcinoma， OV）、胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma， PAAD）、前列腺癌（prostate adenocarcinoma， PRAD）、直腸腺癌（rectum adenocarcinoma， READ）、皮膚黑色素瘤（skin cutaneous melanoma， SKCM）、胃腺癌（stomach adenocarcinoma， STAD）、睪丸生殖細胞腫瘤（testicular germ cell tumors， TGCT）、甲狀腺癌（thyroid carcinoma， THCA）、胸腺癌（thymoma， THYM）、子宮內(nèi)膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma， UCEC）、子宮癌肉瘤（uterine carcinosarcoma， UCS）、嗜鉻細胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（pheochromocytoma and paraganglioma ， PCPG）中表達顯著升高； USP5在急性髓性白血病（acute myeloid leukemia， LAML）中表達顯著降低（均P<0.05），見圖1-A。 USP5蛋白在BRCA、 COAD、 GBM、 LUAD、 PAAD中表達明顯偏低； USP5蛋白在腎透明細胞癌（kidney renal clear cell carcinoma， KIRC）、 LUSC、 OV中表達明顯偏高（均P<0.05），見圖1-B。 USP5表達水平與BRCA、 KIRC、 LIHC、 LUAD、 OV、 PAAD的病理分期之間存在顯著關系（均P<0.05），見圖1-C。

2.2 USP5表達與不同癌癥患者預后的相關性分析結(jié)果 USP5的高表達與LAML、 LUAD、 SKCM、葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma， UVM）的OS呈正相關（均P<0.05），見圖2。

2.3 USP5基因變異情況分析結(jié)果 UCEC中USP5的改變頻率最高，主要改變類型為突變； UCS中USP5改變頻率次高，主要類型為擴增，見圖3-B。進一步分析USP5的額外突變和位置，未獲得主導性的遺傳改變，遺傳改變的位置較少，見圖3-B。

2.4 USP5的磷酸化水平分析結(jié)果 USP5在COAD、GBM、 HNSC、 KIRC、 LUAD、 LUSC、 OV、PAAD的腫瘤中顯著的去磷酸化，見圖4。

2.5 USP5表達與CAFs免疫浸潤相關性的分析結(jié)果 CESC、 HNSC、 HPV陰性HNSC的CAFs與USP5水平呈正相關（均P<0.05），見圖5。

2.6 USP5相關基因的富集分析結(jié)果 熱圖數(shù)據(jù)顯示， USP5在多數(shù)腫瘤中均與圖述5個基因呈顯著正相關，見圖6-A。利用STRING數(shù)據(jù)庫獲得50個與USP5結(jié)合的蛋白質(zhì)，見圖6-B；利用GEPIA2數(shù)據(jù)庫獲得排名前100位與USP5表達相關的基因，交集顯示共同成員為交叉盆蛋白質(zhì)（FOX）M1，見圖6-C。 USP5的表達與信號轉(zhuǎn)導蛋白亞基（COPS）7A（R=0.73）、凋亡抑制蛋白IAP結(jié)合線粒體蛋白（DIABLO）（R=0.52）、 MLF2（R=0.77）、線粒體核糖體蛋白（MRP）L51（R=0.57）和STRAP（R=0.58）基因呈正相關（均P<0.001），見圖6-D。 “核部分”“核腔”“剪接體”“泛素介導的蛋白水解”可能參與USP5在腫瘤發(fā)生機制中的作用，見圖6-E、圖6-F。

3 討論

近年來，研究證實USP5與癌癥密切相關，但USP5在不同癌癥中是否依靠特定機制發(fā)揮重要作用仍需探索[8-9]。

本研究發(fā)現(xiàn)USP5在多數(shù)腫瘤中表達顯著升高，在LAML中表達顯著降低。 有研究表明，USP5能夠通過穩(wěn)定YBX1促進CHOL進展[6]，穩(wěn)定c-Jun蛋白促進膀胱癌進展[7]等。本研究結(jié)果顯示，USP5的高表達與LAML、 LUAD、SKCM及UVM的總生存預后不良呈正相關，故不同腫瘤受基因表達影響的程度不同。

本研究結(jié)果顯示，USP5主要的變異類型是錯義突變。UCEC最常發(fā)生基因錯義突變，而UCS最常發(fā)生基因擴增。USP5在COAD、GBM、HNSC、KIRC、LUAD、LUSC、OV及PAAD的腫瘤組織顯著去磷酸化。但USP5的磷酸化修飾尚無與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間有相關報道，需進一步探索。

腫瘤免疫浸潤細胞是腫瘤微環(huán)境中關鍵的組成之一，與免疫檢查點及腫瘤的預后密切相關[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，CESC、HNSC及HPV陰性HNSC的CAFs與USP5水平呈正相關。本研究結(jié)果顯示，“核部分”“核腔”“剪接體”“泛素介導的蛋白水解”可能參與USP5在腫瘤發(fā)生機制中的作用，這可為后續(xù)的分子生物學研究提供依據(jù)。

綜上所述，USP5表達水平與生存預后、基因突變、免疫浸潤及USP5相關基因富集相關，有助于了解USP5在腫瘤發(fā)生中的作用，為腫瘤免疫治療的研究提供理論依據(jù)。

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