水稻褐變穗病病原鑒定及其生物學(xué)特性分析

摘要 對石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗基地水稻病穗進(jìn)行分離和純化，通過形態(tài)學(xué)、核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）和組蛋白3基因序列對分離病原物進(jìn)行分析及致病性測定，并研究其生物學(xué)特性。結(jié)果表明，引起水稻穗部褐色病斑的病原為鏈格孢菌（Alternaria alternata），通過致病性測定，分離菌株均可導(dǎo)致水稻穗部出現(xiàn)與采樣稻穗類似的癥狀，且從發(fā)病的水稻穗部分離出同樣的鏈格孢菌。該病原菌最適生長培養(yǎng)基是以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基，最適pH 5～7，最適生長溫度29～32 ℃，最適生長光照24 h全光。綜上，本試驗中水稻褐變穗病是由鏈格孢菌（A. alternata）引起。

關(guān)鍵詞 水稻褐變穗；鏈格孢菌；形態(tài)學(xué)鑒定；分子生物學(xué)鑒定；生物學(xué)特性

中圖分類號 S435.111.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2024）19-0080-06

DOI號 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2024.19.017

Identification and biological characteristics of rice brown panicle disease

DU Juan1 CAO Jiyu1 YANG Rui2 HAIZILA·Saiyilihan1 YAO Zhaoqun1 ZHANG Xuekun1 ZHANG Li1

（1College of Agriculture， Shihezi University/Key Laboratory of Oasis Agricultural Pest Management and

Plant Protection Resources Utilization of Xinjiang Uygur Autonomous Region， Shihezi 832003， China;

2Agricultural Technology Extension Station of the First Division of Xinjiang Production and

Construction Corps， Alaer 843300， China）

Abstract The diseased panicles of rice was isolated and purified in the experimental base of College of Agricultural， Shihezi University. The isolated pathogens was analyzed by morphology， ribosomal DNA internal transcribed spacers（rDNA-its）and histone 3 gene sequences， and the pathogenicity was determined， and its biological characteristics was studied. The results showed that Alternaria alternata was the pathogen causing brown lesions on rice panicles. The pathogenicity test showed that the rice panicles had the same symptoms as the sampled rice panicles， and the same Alternaria was isolated from the diseased panicle of rice. The optimum medium for the growth of the pathogen was sucrose as carbon source. The optimum pH 5-7. The optimum growth temperature 29-32 ℃. The optimum growth light 24 h full light. In conclusion， the rice brown panicle disease was caused by Alternaria alternata.

Keywords rice brown panicle disease; Alternaria alternata; morphological identification; molecular biological identification; biological characteristics

據(jù)統(tǒng)計，目前新疆地區(qū)水稻總種植面積約8×104 hm2，產(chǎn)量高達(dá)7×104 t[1]。水稻生產(chǎn)中常會發(fā)生病蟲危害，如在石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗田出現(xiàn)稻穗穎殼褐色或淺褐色癥狀，少數(shù)形成發(fā)白的稻穗空殼，影響稻穗的外觀、產(chǎn)量及品質(zhì)。用刀片刮取穎殼表面的褐色斑于顯微鏡下鏡檢，發(fā)現(xiàn)是鏈格孢屬（Alternaria sp.）真菌分生孢子。

鏈格孢屬95%以上的種類兼性寄生于植物上，可造成田間和產(chǎn)后損失，包括黑斑、果腐等在內(nèi)的多種經(jīng)濟作物病害。例如，邵雪花等[2]報道鏈格孢菌（A. alternata）可引起橄欖黑斑??；馬文娟等[3]報道A. alternata可引起西番蓮果腐?。焕钛砰萚4]報道A. alternata可引起馬鈴薯黑點?。淮送庠摬≡€會產(chǎn)生鏈格孢霉毒素，給食品安全帶來隱患，如關(guān)文碧等[5]報道，被鏈格孢屬真菌侵染的食品中會產(chǎn)生細(xì)胞毒素、生殖和發(fā)育毒素，威脅食品安全和人類健康。目前，有關(guān)水稻褐變穗的研究報道較多，該病害的病原具有多樣性的特點。例如，黃世文等[6]鑒定出水稻穗腐病的病原為細(xì)交鏈孢菌（Alternaria tenuis）、層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）、澳大利亞平臍蠕孢菌（Bipolaris australiensis）和新月彎孢菌（Curvularia lunata）；費丹等[7]研究表明，水稻穗腐病的病原為新月彎孢菌（Cartularies lunatics）、細(xì)交鏈格孢菌、層出鐮刀菌和稻黑孢菌（Nigrospora oryzae）；胡頌平等[8]研究表明，水稻穗腐病的病原為稻黑孢菌、細(xì)極鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）、厚垣鐮刀菌（Fusarium chlamydosporum）和香茅彎孢菌（Curvularia cymbopogonis）；張俊華等[9]研究表明，鏈格孢菌為水稻穗腐病的主要病原菌；馬盾等[10]研究表明，細(xì)交鏈孢菌、新月彎孢菌和層出鐮刀菌為水稻穗腐病的病原菌。已有研究結(jié)果表明，水稻穗部病害是由多種真菌侵染引起的。為探究石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗基地內(nèi)水稻褐變病穗的病原，本研究對該試驗基地水稻病穗進(jìn)行分離和純化，通過形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和致病性測定進(jìn)行病原菌物種鑒定，并研究了其生物學(xué)特性，為該病害田間防治及管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 病樣的采集、分離、純化及代表性菌株的選擇

參考《植病研究方法》[11]中5點取樣法，采集石河子大學(xué)試驗田中具有典型病癥的稻穗，通過組織分離法對病穗進(jìn)行病原菌分離。將采集的病穗置于尼龍紗制成的網(wǎng)袋內(nèi)，自來水沖洗2 h，用無菌手術(shù)刀剝離發(fā)病谷殼，切取病健交界處組織，用75%乙醇浸泡10 s，之后用無菌水沖洗3次，處理后的病組織置于無菌吸水紙上，于超凈工作臺晾干，然后置于添加鏈霉素的PDA平板培養(yǎng)基上，每皿等邊三角形接入3塊病組織，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

單孢分離參照Luo等[12]的方法進(jìn)行。病組織周圍長出菌絲后，挑針取邊緣菌絲塊轉(zhuǎn)入新鮮PDA培養(yǎng)基（直徑90 mm），28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)特征是否一致。移液器吸取0.1 mL分離株孢子懸浮液（300～500個孢子/mL），注入新鮮PDA培養(yǎng)基表面，用涂布器均勻涂開，待孢子萌發(fā)形成單孢菌落，挑選長勢旺、萌發(fā)快的菌落轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，依據(jù)菌落形態(tài)、顏色及分生孢子特點選取代表性菌株進(jìn)行鑒定。

1.2 致病性測定

水稻種子編號：T43，由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供，水稻清水催芽后，均勻種植于營養(yǎng)缽內(nèi)（直徑30 cm，高40 cm），待水稻生長至抽穗期時備用。

接種方法采用噴霧方式，分生孢子懸浮液濃度為1×106 cfu/mL。用50 mL噴壺將孢子懸浮液均勻噴灑在抽穗期健康水稻穗部，用白色保鮮袋保濕24～48 h，以噴灑無菌水作為對照。分別于接種后2、4、6和8 d觀察并記錄其發(fā)病情況及癥狀，根據(jù)柯赫氏法則，同時對發(fā)病病穗再次進(jìn)行病原分離，觀察分離得到的菌株生物學(xué)形態(tài)是否與接種菌株相同。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 采用蓋玻片斜插培養(yǎng)法：在PDA培養(yǎng)基表面正三角斜插滅菌蓋玻片，將病原菌接種至蓋玻片周圍，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，然后用帶測量標(biāo)尺的數(shù)碼顯微鏡查看分生孢子梗、分生孢子的著生狀態(tài)，以及分生孢子大小和縱、橫隔數(shù)，并測量30個分生孢子及其喙的大小，根據(jù)鏈格孢屬種的特征描述對病菌進(jìn)行鑒定。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定 根據(jù)真菌基因組DNA提取試劑盒（BioFlux 50T）使用步驟，將培養(yǎng)6 d的3個病原菌進(jìn)行DNA提取。選用真菌通用rDNA-ITS區(qū)域引物ITS1/ITS4，以及鏈格孢菌的特異性引物（Histone3）H3-1 a/H3-1b對病原菌DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）擴增，擴增條件（表1）參考焦瑞蓮[13]的研究方法。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠，0.5×TBE緩沖液中電泳30 min（120 V），于凝膠成像系統(tǒng)中檢測目標(biāo)條帶，并記錄結(jié)果。獲得的PCR純化產(chǎn)物送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，獲得的序列在NCBI基因數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，同時從數(shù)據(jù)庫中下載10條序列相似性高且含rDNA-ITS和H3基因的鏈格孢屬（Alternaria sp.）參考菌株序列。以大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）（ITS和Histone3登錄號分別為DQ266216.1和DQ266192.1）作為外群，采用MEGA 7.0軟件中鄰接法（NJ）構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其分類地位。

1.4 生物學(xué)特性測定

測定不同碳源、pH、溫度和光照對病原菌菌落生長的影響。用直徑5 mm的滅菌打孔器從培養(yǎng)6 d的菌落邊緣取菌餅，轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)皿并在以下條件中進(jìn)行培養(yǎng)：（1）分別接種于以麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉和蜂蜜為碳源的培養(yǎng)基上；（2）分別接種于pH 5、6、7、8和9的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)；（3）分別置于15、20、25、30和32 ℃條件下培養(yǎng)；（4）置于24 h完全光照、24 h完全黑暗和12 h光暗交替3種處理的培養(yǎng)箱中，光照強度為5 000 lx。每處理3個重復(fù)，培養(yǎng)至第6天時觀察菌落形態(tài)并用十字交叉法測量菌落直徑。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 23.0軟件中鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離

采集田間水稻病樣，經(jīng)過分離純化與單孢分離，得到純化菌株，根據(jù)菌株在PDA培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)特征與分生孢子形態(tài)，歸類相似形態(tài)菌株3類，編號為A1～A3。

2.2 致病性測定

病害田間癥狀主要表現(xiàn)在穗部，發(fā)病水稻穎殼上出現(xiàn)褐色斑點，病斑呈不規(guī)則形，發(fā)病重的稻?？瞻T，穗部較薄弱的穎殼發(fā)病后呈白色。以接種無菌水為對照，病原菌接種健康稻穗后均可引起水稻穗部發(fā)病，產(chǎn)生黃褐色至褐色病斑，布滿穎殼，其癥狀與田間自然發(fā)病癥狀一致（圖1）。從發(fā)病稻穗上再分離得到的菌株在PDA平板上培養(yǎng)，觀察到菌落特性及分生孢子形態(tài)特征與純化所得原菌株一致。

2.3 菌落形態(tài)學(xué)觀察

病原菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃黑暗恒溫培養(yǎng)6 d，菌落平均直徑為5.43～6.10 cm，菌落初期呈灰白色，后期底部呈淺灰色或灰橄欖綠，有時中心呈白色，菌落表面有灰白色棉氈狀菌絲，氣生菌絲多，生長較快，邊緣有淺黃色絨毛狀暈圈；分生孢子梗單生，曲膝狀彎曲，大小在（23.0～65.0）μm×（3.0～4.5）μm；分生孢子鏈生，且鏈不分枝；分生孢子具1～3個橫隔，較粗，0～2個縱隔，0～1個斜隔，分隔處略縊縮，淺褐色或深褐色，棒形、卵形、倒梨形或近橢圓形，表面光滑，孢子大?。?.31～36.13）μm×（4.11～9.00）μm；分生孢子有喙或無喙，喙呈短棒狀，淡褐色，大?。?～3.54）μm×（0～2.59）μm。其形態(tài)特征與鏈格孢菌（A. alternata）一致，如圖2所示。

2.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用rDNA-ITS基因引物對3個供試菌株進(jìn)行PCR擴增后測序，獲得長度分別為627、576和580 bp的DNA片段，在GenBank數(shù)據(jù)庫經(jīng)BLAST比對，菌株（A1～A3）與鏈格孢菌（A. alternata）（登記號MF422130.1、KR822138.1和MK640599.1）同源性在99.31%～99.65%。基于rDNA-ITS區(qū)引物無法確定其歸屬[14]，用組蛋白3基因引物H3-1a/H3-1b進(jìn)行PCR擴增，獲得長度分別為440和438 bp的DNA片段，經(jīng)BLAST比對，菌株（A1～A3）與鏈格孢菌（A. alternata）（登記號MK799610.1、MN481961.1和MK799475.1）同源性達(dá)99.25%～99.75%。對供試菌株（A1～A3）進(jìn)行ITS/H3聯(lián)合序列系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建（圖3），結(jié)果顯示，A1、A2和A3菌株聚在2個分支上，但均與鏈格孢菌（A. alternata）聚在一起，外群大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）與鏈格孢屬真菌聚為2個分支。

以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合rDNA-ITS和組蛋白3基因序列及多基因聯(lián)合發(fā)育樹分析，確定分離到的菌株均為鏈格孢菌（A. alternata）。

參考菌株均按菌株號列出；標(biāo)尺為遺傳距離（歐氏距離平方）。

2.5 病原菌的生物學(xué)特性

2.5.1 不同碳源對菌落生長的影響 A1～A3在5種碳源培養(yǎng)基上均可生長，同一菌株在不同碳源培養(yǎng)基上的生長速率存在差異（表2），A1和A3菌落大小差異明顯，最大直徑為（7.22±0.021）cm，最小為（5.46±0.023）cm；A2菌落在以蜂蜜為碳源的培養(yǎng)基上生長速率最差，直徑（4.88±0.033）cm，在其他4種碳源培養(yǎng)基上菌落大小基本一致。3株病原菌均在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上生長最快，菌落直徑最大。

2.5.2 不同pH對菌落生長的影響 病原菌在pH 5～9的培養(yǎng)基上均可生長（表3），pH在5～7時菌落生長速率較快，直徑較大，pH在8～9時，菌落生長速率明顯變慢，直徑變小，說明該病原菌適合在中性稍偏酸的環(huán)境下生長。

2.5.3 不同溫度對菌落生長的影響 病原菌對溫度的適應(yīng)能力較強（表4），不同溫度下生長速率存在差異。在15～32 ℃范圍內(nèi)均可以生長，15～20 ℃培養(yǎng)條件下菌落生長較緩慢，25～32 ℃時生長較快。30 ℃時，A1～A3菌落直徑分別為（7.80±0.057）、（6.57±0.066）和（7.70±0.057）cm，高于30 ℃時菌落生長速率有變慢趨勢，直徑變小。

2.5.4 不同光照對菌落生長的影響 光照對病原菌菌落生長速率影響較大（表5），在全光和光暗交替條件下A1菌落生長速率較快，最大直徑（7.82±0.036）cm；全光條件下，A2、A3菌株菌落生長速率最快，直徑分別為e+7GZa/GEpVMYAwoAM6uJw==（6.92±0.061）、（7.84±0.012）cm；在完全黑暗條件下，3株病原菌菌落直徑分別為（4.11±0.060）、（4.32±0.067）和（3.84±0.031）cm。說明光照對菌落生長具有促進(jìn)作用，全光照的培養(yǎng)條件更適合該病原菌生長。

3 結(jié)論與討論

研究區(qū)試驗田采集的水稻病穗經(jīng)分離、純化和篩選得到3個代表性菌株，經(jīng)鑒定均為鏈格孢菌（A. alternata）。其發(fā)病原因可能與該地區(qū)6—7月雨水多、風(fēng)沙大，水稻抽穗后穗穎殼較脆弱，易造成穗部傷口，此外，稻蝽象等昆蟲進(jìn)入稻田活動為害也會造成傷口，為病菌侵入植株創(chuàng)造了條件[15-16]；種植管理方式不適及氣候條件不同；水稻生長過程中施肥不當(dāng)?shù)扔嘘P(guān)。

本研究報道的水稻褐變穗病病原與已報道的鏈格孢菌（A. alternata）可以引起水稻褐變穗病結(jié)果吻合，而與新疆地區(qū)已報道的水稻褐變穗病原不同。如馬盾等[10]采用形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方法鑒定了新疆地區(qū)水稻褐變穗病病原，層出鐮刀菌（F. proliferatum）為優(yōu)勢致病菌，其次是新月彎孢菌（C. lunata）和細(xì)交鏈孢菌（A. tenuis）。水稻褐變穗病病原菌不一致的原因可能有以下幾個方面：一是采集病樣的地點環(huán)境不同，已報道的水稻病樣主要采集于水稻種植區(qū)及試驗田，屬于大田環(huán)境；二是采集時間不同，已報道的研究對象采集時間為水稻成熟期（9—10月），雜菌及復(fù)合侵染較多，本研究病樣采集時間為水稻抽穗期（6—7月），此時病害比較單一；三是不同地區(qū)、不同寄主和不同環(huán)境中鏈格孢菌種群結(jié)構(gòu)存在差異，因而侵染后在植物組織上造成的癥狀及病原也存在差異。

生物學(xué)特性研究表明，鏈格孢菌在5種碳源的培養(yǎng)基上均可生長且均在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上生長最快，菌落直徑最大且菌絲茂密，這與韓雨桐[17]的研究結(jié)果相近；鏈格孢菌在pH 5～9的培養(yǎng)基上均可生長，適宜pH 5～7，與張俊華等[9]研究結(jié)果相近；鏈格孢菌在15～32 ℃范圍均可生長，在15～20 ℃生長較緩慢，最適生長溫度在25～32 ℃，與費丹等[7]、李雪等[18]研究結(jié)果相近；在全光照條件下鏈格孢菌菌落生長速度最快，與喬金玲等[19]研究結(jié)果相近。

綜上，本試驗探究了石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗基地水稻褐變病穗的病原，通過形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和致病性測定，明確該病害的病原為鏈格孢菌（A. alternata），并研究了其生物學(xué)特性。因在校園試驗田小環(huán)境中分離鑒定出的菌株較單一，在本文中對該水稻病穗病原菌生物學(xué)特性的研究較少，但初步了解了鏈格孢菌種類及其生物學(xué)特性和發(fā)病規(guī)律，對水稻褐變穗病種類有了進(jìn)一步的認(rèn)識，為該病害田間防治及管理提供了參考。

參考文獻(xiàn)

[1] 新疆維吾爾自治區(qū)統(tǒng)計局，國家統(tǒng)計局新疆調(diào)查總隊. 新疆統(tǒng)計年鑒2019[M]. 北京：中國統(tǒng)計出版社，2019.

[2] 邵雪花，楊永璐，賴多，等.橄欖黑斑病病原菌的分離鑒定及防治藥劑篩選[J].核農(nóng)學(xué)報，2024，38（1）：68-75.

[3] 馬文娟，梁向東，劉月廉. 廣西玉林西番蓮果腐病病原菌的分離與鑒定[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021（10）：43-45，54.

[4] 李雅楠，SAYED R A S，孫少慧，等.黑龍江省馬鈴薯葉斑類病害Alternaria屬病原組成和分布[J].分子植物育種，2017，15（3）：1077-1083.

[5] 關(guān)文碧，馬嘉麗. 食品中鏈格孢霉毒素殘留分析的樣品前處理技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 糧油食品科技，2024，32（2）：114-120.

[6] 黃世文，王玲，劉連盟，等. 水稻穗腐病病原分離、鑒定及生物學(xué)特性[J]. 中國水稻科學(xué)，2012，26（3）：341-350.

[7] 費丹，檀根甲，羅道宏. 安徽省水稻穗腐病病原鑒定及生物學(xué)特性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，41（5）：777-782.

[8] 胡頌平，余建，魏開發(fā)，等. 江西水稻穗腐病病原菌鑒定及生物學(xué)特性研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2019，41（2）：234-242.

[9] 張俊華，李云鵬，韓雨桐，等.黑龍江省水稻褐變穗病病原鑒定及生物學(xué)特性研究[J]東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2018，49（1）：27-38，46.

[10] 馬盾，王奉斌，吳強，等. 新疆水稻穗腐病病原菌種類鑒定及防控研究[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，54（6）：1093-1098.

[11] 方中達(dá). 植病研究方法[M]. 3版. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：123-124.

[12] LUO C X，HANAMURA H，SEZAKI H，et al. Relationship between avirulence genes of the same family in rice blast fungus Magnaporthe grisea[J]. Journal of general plant pathology，2002，68：300-306.

[13] 焦瑞蓮. 新疆棉田僵鈴、裂鈴發(fā)生因素的研究[D]. 石河子：石河子大學(xué)，2020.

[14] 李映程，張國麗，任毓忠，等. 基于rDNA-ITS和組蛋白3基因序列分析鑒定新疆棉花葉斑病病原[J]. 棉花學(xué)報，2018，30（3）：272-281.

[15] LEE F N，TUGWELL N P，F(xiàn)ANNAH S J，et al. Role of fungi vectored byrice stink bug（Heteroptera：Pentatomidae） in discoloration of ricekernels[J]. Journal of economic entomology，1993，86（2）：549-556.

[16] PATEL D T，STOUT M J，F(xiàn)UXA J R. Effects of rice panicle age on quantitative and qualitative injury by the rice stink bug（Hemiptera：Pentatomidae）[J]. Florida entomologist，2006，89（3）：321-327.

[17] 韓雨桐. 黑龍江省水稻褐變穗病原鑒定、抗源及藥劑篩選研究[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[18] 李雪，孫宇佳，劉瑞，等. 黑龍江省水稻穗腐病致病菌（Alternaria spp.）的鑒定及生物學(xué)特性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，51（19）：102-109.

[19] 喬金玲，臺蓮梅，王平，等. 水稻褐變穗病原菌生物學(xué)特性的研究[J]. 現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)，2010（4）：9-10.

（責(zé)任編輯：何 艷）