褪黑素預(yù)處理對擠壓綜合征大鼠海馬體中一氧化氮及其合酶的影響

【摘要】目的 探討褪黑素（MT）預(yù)處理應(yīng)用于擠壓綜合征（CS）大鼠對其海馬體中一氧化氮（NO）合成及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響。方法 選取健康Sprague Dawley（SD）雄性大鼠30只，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組（10只）、對照組（10只）、褪黑素組（10只）。褪黑素組大鼠尾靜脈推注10 mL/kg體質(zhì)量褪黑素溶液，空白組和對照組大鼠均無處理。給藥30 min后建立CS大鼠模型。3組大鼠均進(jìn)行麻醉處理，將對照組和褪黑素組大鼠雙側(cè)后肢根部用卡式止血帶壓迫4 h后恢復(fù)血流灌注，其中空白組大鼠麻醉后不進(jìn)行任何處理。

3組大鼠均飼養(yǎng)至再灌注4 h。比較3組大鼠再灌注4 h后海馬體中誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（iNOS）和核因子-κB（NF-κB）蛋白表達(dá)、NO含量、iNOS含量、氧化應(yīng)激指標(biāo)水平。結(jié)果 與空白組比，再灌注4 h后，對照組和褪黑素組大鼠海馬體中的iNOS與NF-κB蛋白表達(dá)水平均升高，與對照組比，褪黑素組大鼠海馬體中的iNOS與NF-κB蛋白表達(dá)水平均降低；與空白組比，再灌注4 h后，對照組和褪黑素組大鼠的海馬體中NO與iNOS含量均升高，與對照組比，褪黑素組大鼠海馬體中NO與iNOS含量均降低；與空白組比，再灌注4 h后，對照組和褪黑素組大鼠海馬體中丙二醛（MDA）含量均增加，超氧化物歧化酶（SOD）活性均降低，與對照組比，褪黑素組大鼠海馬體中的MDA含量降低，SOD活性升高（均P<0.05）。結(jié)論 CS大鼠應(yīng)用MT預(yù)處理能夠抑制其海馬體組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并調(diào)節(jié)iNOS與NF-κB蛋白表達(dá)水平，降低iNOS的含量，抑制NO合成，減輕缺血再灌注損傷。

【關(guān)鍵詞】擠壓綜合征 ; 缺血再灌注損傷 ; 褪黑素 ; 海馬體 ; 一氧化氮 ; 氧化應(yīng)激

【中圖分類號】R642 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2096-3718.2024.17.0024.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2024.17.008

擠壓綜合征（crush syndrome， CS）主要是由富含肌肉的四肢或軀干受到外界持續(xù)擠壓而引起，以酸中毒、高鉀血癥、急性腎損傷等為特點(diǎn)的臨床綜合征。受擠壓肢體突然解除壓迫后能夠重新獲得血液灌注，再灌注過程中會產(chǎn)生大量的氧自由基，引起機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等，造成缺血再灌注損傷（IRI）。CS對原位器官與遠(yuǎn)隔器官都會造成損傷，若治療不及時，會引起橫紋肌溶解、急性腎損傷和多器官衰竭等，最終導(dǎo)致患者死亡[1]。目前，關(guān)于CS對遠(yuǎn)隔器官造成損傷的研究主要集中于腎臟和心臟，而其他部位較少[2]。海馬體是大腦的重要結(jié)構(gòu)，主要與學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知功能等相關(guān)，其損傷會引起認(rèn)知功能障礙，這可能是CS引起腦組織損傷，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的原因。研究表明，當(dāng)肌肉組織受到長期擠壓后，誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)水平上升，會催化一氧化氮（NO）大量合成，導(dǎo)致NO含量增加，從而加重IRI [3]。褪黑素（MT）是由松果體分泌的一種調(diào)節(jié)激素，具有抑制炎癥反應(yīng)、清除氧自由基、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律等作用。研究表明，MT能夠抑制iNOS表達(dá)，降低NO的含量，有效減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制線粒體凋亡，進(jìn)而減輕IRI[4]。基于此，本研究旨在探討MT預(yù)處理應(yīng)用于CS大鼠，對其海馬體中NO合成及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Sprague Dawley（SD）雄性大鼠[湖北省實驗動物研究中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2020-0018]，大鼠6～8周齡，平均（7.1±0.6）周；體質(zhì)量220～250 g，平均（228.90±8.46） g。飼養(yǎng)于牡丹江醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，在恒溫（22～26 ℃）且濕度適宜（40%～47%）的受控環(huán)境中，確保無噪音和光線干擾，同時提供充足的食物和水，以滿足其生理需求。大鼠均按清潔級標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本研究經(jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器 褪黑素（北京索萊寶科技有限公司，規(guī)格：1 g/瓶）；10%水合氯醛溶液（上海原葉生物科技有限公司，規(guī)格：100 mL/瓶）；二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；NO測定（硝酸還原酶法）試劑盒（南京建成生物科技研究所）；丙二醛測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；超氧化物歧化酶測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。迷你雙垂直電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號：DYCZ-24DN）；多功能凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能生命科學(xué)有限公司，型號：2500R GIS）；全自動酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司，型號：Cytation5）；高速冷凍離心機(jī)（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司，型號：Neofuge 15R）；低溫保存箱（三洋貿(mào)易株式會社，型號：MDF-436）。

1.3 研究方法

1.3.1 動物分組和干預(yù) 取健康SD雄性大鼠30只，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組（10只）、對照組（10只）、褪黑素組（10只）。取100 mg褪黑素粉末溶于4 mL無水乙醇中，利用生理鹽水稀釋至100 mL，持續(xù)電磁力攪拌至粉末完全溶解，配制成褪黑素溶液。褪黑素組大鼠于5 min內(nèi)尾靜脈推注10 mL/kg體質(zhì)量褪黑素溶液，空白組和對照組大鼠均無處理。給藥后30 min造模。

1.3.2 CS大鼠模型構(gòu)建 空白組大鼠只進(jìn)行麻醉處理，對照組和褪黑素組大鼠均進(jìn)行造模處理。采用10%水合氯醛溶液以3 mL/kg體質(zhì)量對每組大鼠行腹腔注射麻醉后，對照組和褪黑素組大鼠參考Murata[5]的造模方法加以改進(jìn)，使用卡式止血帶對大鼠的雙后肢根部進(jìn)行擠壓，壓力相當(dāng)于3 kg重物，當(dāng)觀察到大鼠的足趾由紅潤變?yōu)樯n白呈缺血狀，表示造模成功。對大鼠雙側(cè)后肢壓迫4 h后，松開止血帶，恢復(fù)血流灌注。再灌注4 h后，快速對3組大鼠進(jìn)行斷頭取材。

1.3.3 大鼠海馬體中iNOS蛋白和核因子-κB（NF-κB）蛋白表達(dá)水平的測定 取大鼠海馬體于-80 ℃冰箱中備用，使用低溫超聲裂解，離心（4 ℃，12 000 r/min，20 min）獲取蛋白上清液。利用BCA法測定iNOS、NF-κB蛋白濃度。利用蛋白質(zhì)印跡法檢測iNOS、NF-κB蛋白表達(dá)水平，蛋白樣品經(jīng)加熱變性后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上；加入一抗iNOS、NF-κB（1∶500）和β-肌動蛋白（β-actin），以及標(biāo)記有辣根過氧化物酶的二抗，通過化學(xué)發(fā)光法顯色，利用凝膠圖像分析系統(tǒng)記錄圖像。通過分析圖像中蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白/β-actin蛋白的強(qiáng)度比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.3.4 大鼠海馬體中NO含量的測定 將大鼠海馬體組織與生理鹽水按1 g∶9 mL的比例混合，并通過機(jī)械攪拌制成10%組織勻漿液，采用硝酸還原酶法測定勻漿液中NO的含量。取適量10 %組織勻漿液，以3 500 r/min離心10 min，取300 μL上清液。按照試劑盒說明書制備反應(yīng)混合液，靜置10 min，以3 500～4 000 r/min離心15 min，取適量上清液，向其中加入顯色劑混勻，室溫靜置15 min后，在550 nm波長下使用酶標(biāo)儀測定各孔的光密度（OD）值，測定NO的濃度。

1.3.5 大鼠海馬體中iNOS含量的測定 10%組織勻漿液制備方法同上文1.3.4。取0.5 mL 10%組織勻漿液于離心管，將離心管置于液氮中10 min，室溫放置，反復(fù)凍融3次。在冰浴條件下，超聲3 s，間歇4 s，共4次。離心（12 000 r/min，4 ℃，30 min）后取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測大鼠海馬體組織中iNOS的含量。

1.3.6 大鼠海馬體組織中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性測定 10%組織勻漿液制備方法同上文1.3.4。取適量勻漿后分別按照試劑盒說明書測定MDA含量、SOD活性。MDA含量=[（樣品管OD值－對照管OD值）/標(biāo)準(zhǔn)管OD值]×標(biāo)準(zhǔn)品濃度/勻漿液中蛋白濃度；SOD活性=[（對照管OD值－樣品管OD值）/對照管OD值]/50%×（反應(yīng)液總體積/勻漿液取樣量）/勻漿液中蛋白濃度。

1.4 觀察指標(biāo) ⑴大鼠海馬體組織中iNOS蛋白與NF-κB蛋白表達(dá)水平。利用蛋白質(zhì)印跡法檢測3組大鼠再灌注4 h后海馬體組織中iNOS蛋白與NF-κB蛋白表達(dá)水平。⑵大鼠海馬體中NO與iNOS含量。再灌注4 h后，采用硝酸還原酶法測定大鼠海馬體中NO含量；利用ELISA法檢測大鼠海馬體組織中的iNOS含量。⑶大鼠海馬體氧化應(yīng)激指標(biāo)水平。分別測定3組大鼠再灌注4 h后海馬體組織中MDA含量與SOD活性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料經(jīng)S-W法檢驗證實符合正態(tài)分布且方差齊，以（ x ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠海馬體組織中iNOS蛋白與NF-κB蛋白表達(dá)水平比較

與空白組比，再灌注4 h后，對照組和褪黑素組大鼠海馬體組織中的iNOS蛋白、NF-κB蛋白表達(dá)水平均升高；與對照組比，褪黑素組大鼠海馬體組織中的iNOS蛋白、NF-κB蛋白表達(dá)水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），見圖1、表1。

2.2 3組大鼠海馬體組織中NO與iNOS含量比較

與空白組比，再灌注4 h后，對照組和褪黑素組大鼠的海馬體中NO與iNOS含量均升高；與對照組比，褪黑素組大鼠海馬體中NO與iNOS含量均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），見表2。

2.3 3組大鼠海馬體組織MDA含量與SOD活性比較

與空白組比，再灌注4 h后，對照組和褪黑素組大鼠海馬體內(nèi)MDA含量均增加，SOD活性均降低；與對照組比，褪黑素組大鼠海馬體中的MDA含量降低，SOD活性升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），見表3。

3 討論

CS又稱為橫紋肌溶解癥，通常發(fā)生在地震、山體滑坡等自然災(zāi)害和戰(zhàn)爭、踩踏等人為災(zāi)害中，死亡率較高，是僅次于直接災(zāi)害的第二大死亡原因[6]。CS治療以補(bǔ)液為主要措施，早期輸液可以治療高鉀血癥，預(yù)防患者休克和急性腎衰竭，但很難對IRI誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等起作用。在血液再灌注過程中，氧自由基水平升高，細(xì)胞因子和其他炎癥因子的參與，以及NO大量合成等均會加重缺血組織損傷，甚至導(dǎo)致器官衰竭。

MT是一種激素和自由基清除劑，主要在松果體中合成，具有多種藥理作用，包括抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡等。研究表明，MT可以減輕CS大鼠的氧化應(yīng)激損傷，并提高大鼠的存活率[7]。MT作為活性氧清除劑，可以保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)的完整性，抑制炎癥反應(yīng)，有助于減輕血液再灌注導(dǎo)致的組織損傷，增加機(jī)體MT含量可能成為改善IRI的有效方法[8]。

NO作為一種重要的信號傳遞分子，參與機(jī)體多種生理反應(yīng)。在病理狀態(tài)下，iNOS被激活，能夠催化NO大量合成，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成腦組織損傷。NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，被激活后可調(diào)節(jié)多種炎癥因子的表達(dá)，加重缺血組織的損傷，還可促進(jìn)氧自由基的釋放，在缺血再灌注損傷過程中起著重要調(diào)節(jié)作用[9]。NF-κB是NO合成過程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在NO的合成過程中起著重要的作用。激活后的NF-κB會上調(diào)iNOS的表達(dá)，并誘導(dǎo)機(jī)體合成大量NO，可能加速神經(jīng)元的損傷或死亡[10]。在本研究中，與空白組比，再灌注4 h后，對照組和褪黑素組大鼠海馬體組織中的iNOS蛋白與NF-κB蛋白表達(dá)水平均升高；與對照組比，褪黑素組大鼠海馬體組織中的iNOS蛋白與NF-κB蛋白表達(dá)水平均降低。這提示MT預(yù)處理能有效抑制大鼠海馬體中iNOS蛋白與NF-κB蛋白的表達(dá)。分析其原因可能為，CS大鼠雙側(cè)肢體解除壓迫后，血流再灌注導(dǎo)致炎癥因子和氧自由基大量產(chǎn)生，通過血液循環(huán)誘導(dǎo)大鼠海馬體中的NF-κB的蛋白表達(dá)，上調(diào)iNOS蛋白表達(dá)。MT可以阻斷NF-κB的轉(zhuǎn)錄過程，進(jìn)而抑制其蛋白表達(dá)，并降低iNOS蛋白的表達(dá)水平[11]。

本研究結(jié)果顯示，與空白組比，再灌注4 h后，對照組和褪黑素組大鼠的海馬體中NO與iNOS含量均升高；與對照組比，褪黑素組大鼠海馬體中NO與iNOS含量均降低。這提示MT預(yù)處理可以降低大鼠海馬體中iNOS的含量。分析其原因為，iNOS是NO合成過程中的關(guān)鍵酶，在催化NO合成中發(fā)揮重要作用，而MT預(yù)處理降低大鼠海馬體中iNOS含量，影響NO合成過程，進(jìn)而導(dǎo)致NO含量降低。

SOD是一種關(guān)鍵的抗氧化酶，能夠通過歧化反應(yīng)清除細(xì)胞內(nèi)的超氧自由基，其活性升高能有效減輕細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)；MDA是自由基與脂質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，其含量升高反映了氧化應(yīng)激損傷加重。在本實驗中，與空白組比，再灌注4 h后，對照組和褪黑素組大鼠海馬體內(nèi)MDA含量均增加，SOD活性均降低；與對照組比，褪黑素組大鼠海馬體中的MDA含量降低，SOD活性升高。這提示MT預(yù)處理可以減輕大鼠海馬體中的氧化應(yīng)激反應(yīng)程度。

綜上，MT預(yù)處理可以抑制CS大鼠海馬體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，并通過下調(diào)iNOS蛋白與NF-κB蛋白表達(dá)，降低iNOS的含量來影響NO的合成，降低NO含量以減輕IRI，發(fā)揮保護(hù)海馬體組織的作用。但本研究仍存在考察指標(biāo)較少、褪黑素最佳給藥劑量不明確的局限，后續(xù)應(yīng)針對給藥劑量開展深入研究，并增加相應(yīng)的考察指標(biāo)。

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基金項目：2021年度黑龍江省省屬高等學(xué)?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)科研項目（編號：2021-KYYWF-0511）

作者簡介：王兆宇，2021級在讀碩士生，研究方向：臨床麻醉。

通信作者：張月順，碩士研究生，主任醫(yī)師，研究方向：臨床麻醉。E-mail：zhangyueshun1968@163.com