基于柱前衍生化-GC-MS技術(shù)探究不同采摘期青錢柳葉揮發(fā)性物質(zhì)組成

摘要 ［目的］采用GC-MS技術(shù)，解析青錢柳葉中的揮發(fā)性物質(zhì)組成，探究13批次不同采摘期青錢柳葉中揮發(fā)性物質(zhì)含量差異。［方法］用甲醇超聲、甲醇加熱回流、乙醇超聲、乙醇加熱回流、乙酸乙酯超聲和正己烷超聲6種提取方法，分別對(duì)青錢柳葉的揮發(fā)性成分進(jìn)行提取，再結(jié)合BSTFA衍生法，綜合探究青錢柳葉的揮發(fā)性成分組成；研究2023年4月15日—11月1日13個(gè)不同采摘期樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)含量差異。［結(jié)果］乙酸乙酯提取-BSTFA衍生化法能更全面探究青錢柳葉中揮發(fā)性物質(zhì)的組成，研究共鑒定出25種物質(zhì)，青錢柳葉中揮發(fā)性物質(zhì)主要是亞麻酸、棕櫚酸、呋喃果糖、丙三醇、葉綠醇和硬脂酸等，脂肪酸總含量約為50%，還包括小分子有機(jī)酸、醇類和單糖類物質(zhì)等。S1～S9和S10～S13批次樣本物質(zhì)的含量存在一定的差異。［結(jié)論］春夏季采摘的青錢柳葉不飽和脂肪酸含量較高，秋季單糖類物質(zhì)含量明顯增高。

關(guān)鍵詞 青錢柳葉；揮發(fā)性物質(zhì)；采摘期；柱前衍生化-GC-MS

中圖分類號(hào) R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2024）17-0189-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.17.044

Study on the Composition of Volatile Substances in Leaves of Cyclocarya paliurus at different Picking Stages by Pre-column Derivatization and GC-MS Technology

WANG An， CHENG Gui-lin， SU Min et al

（Chizhou Quality Supervision and Inspection Research Institute， Chizhou， Anhui 247099）

Abstract ［Objective］ GC-MS technology was used to analyse the composition of volatile substances in the leaves of Cyclocarya paliurus， and to explore the differences in the content of volatile substance in 13 batches of Cyclocarya paliurus leaves at different picking periods.［Method］ The volatile components of Cyclocarya paliurus leaves were extracted by methanol ultrasound， methanol heating reflux， ethanol ultrasound， ethanol heating reflux， ethyl acetate ultrasound and n-hexane ultrasound extraction methods， respectively， and then combined with BSTFA derivatization method to comprehensively explore the volatile composition of Cyclocarya paliurus leaves. The difference of volatile substances content in 13 batches of Cyclocarya paliurus leaves samples in different picking periods from April 15，2023 to November 1，2023 was studied. ［Result］ The ethyl acetate ultrasound extraction and BSTFA derivatization method could comprehensively explore the composition of volatile substances in the leaves of Cyclocarya paliurus. A total of 25 substances were identified in the study. The volatile substances in the leaves of Cyclocarya paliurus mainly included linolenic acid， palmitic acid， fructofuran， glycerol， phytol and stearic acid.The total content of fatty acids was about 50%， the small molecule organic acids， alcohols and monosaccharides were also included. There was a certain difference in the content of substances in the samples between S1-S9 and S10-S13 samples. ［Conclusion］Unsaturated fatty acids were higher in Cyclocarya paliurus leaves picked in spring and summer，while the monosaccharides were significantly higher in autumn.

Key words Leaves of Cyclocarya paliurus;Volatile substance;Picking stages;Pre-column derivatization and GC-MS

基金項(xiàng)目 安徽省藥品監(jiān)督管理局2022年度科技創(chuàng)新項(xiàng)目（AHYJ-KJ-202217）。

作者簡(jiǎn)介 汪安（1976—），男，安徽銅陵人，副高級(jí)藥品檢查員，從事藥學(xué)相關(guān)研究。

收稿日期 2024-04-14

青錢柳又稱青錢李、一串錢、山麻柳、搖錢樹(shù)等，屬于胡桃科青錢柳屬，目前僅存于我國(guó)，是我國(guó)二級(jí)保護(hù)樹(shù)種［1］。青錢柳多分布于安徽、江蘇和湖南等地，青錢柳的樹(shù)根、樹(shù)皮和樹(shù)葉均可入藥，具有清熱解毒、止痛等效果，可用于治療頑癬［2］?，F(xiàn)代研究表明，青錢柳葉具有清熱解毒、降血脂、降血糖和降血壓等作用，可用于治療高血壓和糖尿病等疾病［3-4］。

青錢柳以葉入藥，有研究報(bào)道，青錢柳葉產(chǎn)地不同，其適宜的采收期也存在差異［5］。中藥材因其生長(zhǎng)環(huán)境不同，其代謝物在種類和含量具有差異，藥材的采收期可直接影響藥材的品質(zhì)形成?，F(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)其黃酮類、多糖類、三萜類、酚酸類以及無(wú)機(jī)成分進(jìn)行研究較多［6-8］，而對(duì)其揮發(fā)性成分研究較少。該試驗(yàn)采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)，用甲醇超聲、甲醇加熱回流、乙醇超聲、乙醇加熱回流、乙酸乙酯超聲和正己烷超聲6種提取方法分別對(duì)13批不同采摘期青錢柳葉中的揮發(fā)性成分進(jìn)行提取，再結(jié)合N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）衍生化，綜合探究青錢柳葉的揮發(fā)性成分組成，以期為青錢柳的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

安捷倫7890B-7000D氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；MassHunter工作站；NIST17.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)；XPR2型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；GeneVac miVAC DUO型真空離心濃縮儀（德祥科技有限公司）；ZWYR-2000D恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.2 耗材與材料

青錢柳葉，編號(hào)S1～S13，采摘日期分別為2023年4月15日、5月1日、5月15日、6月1日、6月15日、7月1日、7月15日、8月1日、8月15日、9月1日、9月15日、10月15日、11月1日）；乙酸乙酯、正己烷，質(zhì)譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇，質(zhì)譜純，德國(guó)默克有限公司；乙醇，色譜純，上海麥克林生化科技有限公司；無(wú)水硫酸鈉，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；BSTFA ［含1%三甲基氯硅烷（TMCS）］衍生化試劑，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；屈臣氏純凈水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 揮發(fā)性成分提取液制備。

取青錢柳葉適量，用中藥打粉機(jī)粉碎。稱取粉末各約10 g，平行制備6組，每組加入50 mL提取溶劑，稱重，其中第1組為甲醇超聲（A組）、第2組乙醇超聲（B組）、第3組為甲醇加熱回流（C組）、第4組為乙醇加熱回流（D組）、第5組為乙酸乙酯超聲（E組）、第6組為正己烷超聲（F組）處理，超聲或加熱回流1 h，放冷，稱重，補(bǔ)足重量，取上清，于12 000 r/min離心10 min后，無(wú)水硫酸鈉除水，即得提取液樣本。

1.3.2

提取物衍生化溶液制備。取“1.3.1”項(xiàng)下制備的提取液1 mL，上清液在真空離心濃縮儀中30 ℃條件下?lián)]干溶劑。加入20 μL甲氧胺吡啶溶液（40 mg/mL），混勻后60 ℃恒溫?fù)u床反應(yīng)30 min，接著加入100 μL的BSTFA（含1% TMCS）衍生化試劑，60 ℃恒溫?fù)u床硅烷化反應(yīng)60 min，最后將樣本于12 000 r/min離心20 min后取上清液，即得提取物衍生化溶液。

1.3.3 氣相色譜條件。采用安捷倫HP-5 MS（30 m×250 μm×0.25 μm）石英毛細(xì)管柱分析；起始溫度80 ℃，維持2 min，以5 ℃/min速度升至160 ℃，維持10 min，以4 ℃/min速度升至200 ℃，維持10 min，再以10 ℃/min速度升至280 ℃，維持4 min；進(jìn)樣口溫度240 ℃；進(jìn)樣體積1 μL；分流比30∶1；載氣為高純氦氣；恒定流量模式，流速1 mL/min。

1.3.4 質(zhì)譜條件。采用電子轟擊離子源；傳輸線溫度240 ℃；離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；離子能量70 eV；全掃描模式，掃描范圍50～500 amu；碰撞氣1.5 mL/min；溶劑延遲5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化和直接進(jìn)樣分析比較

取“1.3.1”項(xiàng)下樣本直接進(jìn)行GC-MS分析，考察6種提取方法直接進(jìn)樣分析的差異，對(duì)采集的色譜圖進(jìn)行色譜峰提取。甲醇超聲法、乙醇超聲法、甲醇加熱回流法、乙醇加熱回流法、乙酸乙酯超聲法和正己烷超聲法提取的典型色譜峰分別為19、15、18、18、16和21個(gè)。6種提取法鑒定的物質(zhì)主要是十六烷酸和亞麻酸，色譜峰拖尾嚴(yán)重，其他物質(zhì)的含量較低。6種提取法樣本經(jīng)過(guò)“1.3.2”項(xiàng)下衍生化處理后進(jìn)行GC-MS分析，典型色譜峰分別為38、31、43、45、62和24個(gè)，除正己烷超聲法外，其他5種提取法樣本經(jīng)BSTFA衍生化后提取的色譜峰均增加了1倍以上，揭示了BSTFA衍生化法能更全面探究青錢柳葉中揮發(fā)性物質(zhì)的組成，其中乙酸乙酯超聲法是揮發(fā)性物質(zhì)鑒定的最優(yōu)提取方法。不同提取法的典型GC-MS分析結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 青錢柳揮發(fā)性成分GC-MS鑒定

按“1.3.3”和“1.3.4”項(xiàng)下條件檢測(cè)乙酸乙酯超聲-BSTFA衍生化法提取的樣本，使用安捷倫MassHunter軟件檢索NIST 17標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)，同時(shí)參考已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)佐證，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行鑒定［9］。采用面積歸一化法計(jì)算各化學(xué)物質(zhì)的百分含量，研究結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，青錢柳葉樣本揮發(fā)性成分共鑒定出25種物質(zhì)，占提取的62個(gè)色譜峰總面積的91.65%，表明大部分物質(zhì)均被鑒定。乙酸乙酯超聲-BSTFA衍生化法鑒定的主要成分有亞麻酸（31.70%）、棕櫚酸（15.67%）、D-呋喃果糖（10.69%）、丙三醇（8.72%）、葉綠醇（7.49%）、甘露糖（3.30%）和硬脂酸（2.84%）等，亞麻酸、棕櫚酸和硬脂酸的總含量為50.21%。還包括一些小分子有機(jī)酸（琥珀酸、蘋果酸和3-羥基丙酸等）、醇類物質(zhì)（1，2，3-丁三醇、L-蘇丁醇）、單糖類物質(zhì)（甘油單乙酸酯D-核糖、D-呋喃果糖、D-阿拉伯吡喃糖和D-核糖等）。

2.3 6種提取方法的揮發(fā)性成分對(duì)比

參照“1.3”項(xiàng)下的方法制備供試品（每個(gè)樣本平行制備3份），同時(shí)制備質(zhì)控（QC）樣本，經(jīng)過(guò)GC-MS檢測(cè)。對(duì)采集的原始文件進(jìn)行積分處理，結(jié)合前期的定性結(jié)果，獲得各批次樣本中主要成分的色譜峰面積。

對(duì)獲得的二維數(shù)據(jù)矩陣（化合物名稱和峰面積）進(jìn)行一定流程處理，通過(guò)多元變量統(tǒng)計(jì)分析方法，探究不同采摘期物質(zhì)含量差異，具體流程如下：采用MetaboAnalyst 6.0軟件（https：//new.metaboanalyst.ca/）依次進(jìn)行歸一化（normalization by sum）、數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化［log transformation（base 10）］和中心化（mean centering）處理，先建立PLS-DA（偏最小二乘法判別分析）模型，見(jiàn)圖2A。從圖2A可以看出，13批次樣本可以明顯分成2個(gè)區(qū)域，其中S10～S13聚集在一個(gè)區(qū)域，S1～S9分布在另一個(gè)區(qū)域，表明S10～S13和S1～S9批次樣本存在一定的差異。

將批次S1～S9重新定義為第1組，批次S10～S13為第2組，建立OPLS-DA（正交偏最小二乘法判別分析）模型，見(jiàn)圖2B，200次置換檢驗(yàn)結(jié)果顯示R2=0.935（P<0.01），Q2=0.858（P<0.01），表明建立的OPLS-DA模型不存在過(guò)度擬合，模型可靠。通過(guò)OPLS-DA分析得到VIP值（variable importance in the projection，變量投影重要性），再根據(jù)t檢驗(yàn)計(jì)算得到P值判斷評(píng)價(jià)質(zhì)量差異的標(biāo)志物。初步篩選出亞麻酸、甘露糖、2-羥基-4-甲基戊酸、D-核糖、3-亞甲基-1，4-丁二醇、D-來(lái)蘇糖、D-蘇糖、D-阿拉伯吡喃糖和核糖酸-1，4-內(nèi)酯共9個(gè)物質(zhì)為差異物質(zhì)。與S1～S9批次樣本（春夏季樣本）相比，S10～S13批次樣本（秋季樣本）中亞麻酸和核糖酸-1，4-內(nèi)酯的相對(duì)含量降低（P<0.05），甘露糖、2-羥基-4-甲基戊酸、D-核糖、3-亞甲基-1，4-丁二醇、D-來(lái)蘇糖、D-蘇糖和D-阿拉伯吡喃糖的相對(duì)含量增高（P<0.05），見(jiàn)圖3。結(jié)合前期相對(duì)定量結(jié)果，亞麻酸是青錢柳葉中揮發(fā)性成分的主要物質(zhì)，亞麻酸的含量可以有效反映其采摘期時(shí)間，4—8月采摘的青錢柳葉亞麻酸含量較9月份之后采摘的青錢柳葉高約50%。

3 總結(jié)與討論

在研究初期，考察了甲醇超聲、乙醇超聲、甲醇加熱回流、乙醇加熱回流、乙酸乙酯超聲和正己烷超聲6種提取方法，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯超聲法是最優(yōu)的提取方法。提取物經(jīng)過(guò)BSTFA衍生化后，色譜峰數(shù)量明顯增加，表明BSTFA衍生化法能更全面探究青錢柳葉中揮發(fā)性物質(zhì)的組成。

該研究共鑒定出25種物質(zhì)，青錢柳葉中揮發(fā)性物質(zhì)主要是亞麻酸，含量為31.70%。同時(shí)還含有棕櫚酸、D-呋喃果糖、丙三醇、葉綠醇和硬脂酸，含量為2.84%～15.67%。脂肪酸總含量為50.21%，主要包括亞麻酸、棕櫚酸和硬脂酸。

現(xiàn)代藥理學(xué)表明，亞麻酸是一種多烯類不飽和脂肪酸，具有降血脂、降血壓、抑制炎癥、抗血小板聚集、防止血栓形成等功效［10］。棕櫚酸是人體內(nèi)的一種重要的飽和脂肪酸，具有消炎殺菌、保護(hù)心血管、抗氧化、維持腸道健康、保護(hù)皮膚等作用［11］。呋喃果糖具有抗氧化、抗炎、降血脂等作用［12］。葉綠醇是含有多支鏈的脂肪醇，屬于鏈狀雙萜類物質(zhì)，具有鎮(zhèn)痛、抗衰老和抗氧化等作用［13］。硬脂酸具有抗氧化、維持皮膚彈性、提高免疫力和軟化血管的作用［14］。青錢柳葉中所含的揮發(fā)性成分種類較為豐富，其含有的揮發(fā)性成分具有降血脂、降血壓、抗炎等藥理作用，該研究為青錢柳揮發(fā)性物質(zhì)提供了研究基礎(chǔ)。

有關(guān)青錢柳葉采摘期的研究，鄭敏等［15］測(cè)定春季和秋季4個(gè)種源青錢柳葉中總黃酮和粗多糖含量，春季和秋季間青錢柳葉中總黃酮和粗多糖含量存在顯著差異（P<0.05），不同種源之間的含量存在極顯著差異（P<0.01）。林偉達(dá)［16］采用LC-MS技術(shù)，分析了青錢柳幼嫩葉片和成熟葉片之間的代謝物變化，發(fā)現(xiàn)幼嫩葉片適宜作為制作青錢柳茶的原材料，成熟葉片適宜作為工業(yè)生產(chǎn)上提取各類代謝物的原材料。吳琳琳等［17］通過(guò)HPLC技術(shù)，測(cè)定10個(gè)采收期青錢柳葉中綠原酸、異槲皮苷、槲皮素的山奈酚含量，綠原酸和異槲皮苷的含量在7月初最高，但是槲皮素和山奈酚的含量分別在8月末和9月初最高。夏和元等［18］研究不同采摘期青錢柳葉中黃酮、三萜、多糖含量與體外抗氧化和降血糖活性，確定以6、7月份采摘綠色青錢柳葉為最佳。

該研究首次采用GC-MS結(jié)合BSTFA衍生化技術(shù)，研究13個(gè)采摘期青錢柳葉中揮發(fā)性物質(zhì)的含量差異。通過(guò)多元變量統(tǒng)計(jì)分析和t檢驗(yàn)，批次S10～S13和S1～S9樣本之間存在一定的差異，S10～S13和S1～S9批次之間篩選出核糖酸-1，4-內(nèi)酯、亞麻酸和甘露糖等差異代謝物。春夏季和秋季采摘的青錢柳葉揮發(fā)性物質(zhì)存在一定差異，春夏季采摘的青錢柳葉不飽和脂肪酸（亞麻酸）含量較高，秋季單糖類物質(zhì)（甘露糖、D-核糖、D-來(lái)蘇糖、D-蘇糖和D-阿拉伯吡喃糖）含量明顯增高，該研究為青錢柳葉開(kāi)發(fā)相關(guān)產(chǎn)品提供了理論依據(jù)。

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