固相柱凈化-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定辣椒紅色素中的蘇丹紅

摘要 ［目的］建立一種高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）同時測定辣椒紅色素中4種蘇丹紅染料的方法。［方法］辣椒紅色素樣品經(jīng)正己烷提取，分子印跡柱凈化，高效液相色譜柱ZORABX SB-Aq C18（3.0 mm×100 mm，3.5 μm）分離，乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫，ESI+電噴霧掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下對辣椒紅色素中蘇丹紅進(jìn)行測定，外標(biāo)法定量。［結(jié)果］4種蘇丹紅染料在10～200 ng/mL均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限為5 μg/kg，定量限為10 μg/kg，加標(biāo)量為10、20、50 μg/kg（n=6）時，平均回收率為71.0%～119.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.53%～6.18%。［結(jié)論］該方法適用于辣椒紅色素中4種蘇丹紅染料的定性定量分析。

關(guān)鍵詞 辣椒紅色素；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）；蘇丹紅

中圖分類號 TS207 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）17-0185-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.17.043

Determination of Sudan Red in Capsicum Pigment by HPLC-MS/MS

ZHANG Jin-lei， LU Li-liang， CHEN Yong-fa et al

（Analysis and Testing Center， Xinjiang Academy of Agriculture and Reclamation Science， Shihezi， Xinjiang 832000）

Abstract ［Objective］A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS） method was developed for the simultaneous determination of four Sudan red dyes in capsicum red pigment.［Method］ The capsaicin pigment samples were extracted by n-hexane， purified by a special molecular imprinting column for Sudan red， separated by RP-HPLC on ZORABX SB-Aq C18 （3.0 mm×100 mm， 3.5 μm）， water gradient elution of acetonitrile -0.1% formic acid， ESI+ electrospray scanning. Sudan red in capsicum pigment was determined by multiple reaction monitoring （MRM） and quantified by external standard method. ［Result］The four Sudan red dyes showed a good linear relationship in the concentration range of 10.0-200 ng/mL， the detection limit was 5 μg/kg， and the quantification limit was 10 μg/kg. The average recovery was 71.0%-119.0% and the relative standard deviation was 1.53%-6.18% when the scalars were 10 μg/kg， 20 μg/kg and 50 μg/kg （n=6）. ［Conclusion］This method is suitable for the qualitative and quantitative analysis of four Sudan red dyes in chili red pigment.

Key words Capsicum pigment;HPLC-MS/MS;Sudan red

作者簡介 張金磊（1991—），男，江蘇南通人，助理實(shí)驗(yàn)師，從事食品質(zhì)量安全檢測研究。通信作者，高級實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事食品質(zhì)量安全檢測研究。

收稿日期 2023-10-16

蘇丹紅屬于偶氮類化工染色劑，主要用于溶劑、油、蠟和汽油的增色以及鞋、皮革等的增光。蘇丹紅有Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號3種變體，它們均為I號的化學(xué)衍生物［1］。毒理學(xué)研究表明，蘇丹紅具有致突變性和致癌性，已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為三類致癌物之一，禁止作為色素添加劑在食品和飼料中使用［2-3］。

辣椒紅色素是一類天然植物提取物著色劑，普遍存在于成熟的紅辣椒的果皮中，屬于類胡蘿卜素，具有色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、無毒、無害等優(yōu)點(diǎn)，作為天然食品添加劑，被廣泛用于食品、藥品和化妝品等的著色。隨著工業(yè)的快速發(fā)展，蘇丹紅會富集并存在于空氣、土壤等環(huán)境中，在辣椒成長過程中會帶入；另一方面，為了提高辣椒及制品的色澤，一些不法分子也會將蘇丹紅添加到辣椒中。辣椒中的蘇丹紅經(jīng)食物鏈的傳遞，最終進(jìn)入人體危害人們的健康，由蘇丹紅引起的食品安全問題也受到越來越多的關(guān)注［4-8］。辣椒紅色素主要有辣椒紅素、辣椒玉紅素、R-胡蘿卜素、黃體素及多種天然色素等脂溶性物質(zhì)組成，基質(zhì)較為復(fù)雜。蘇丹紅與辣椒紅色素同為脂溶性物質(zhì)，傳統(tǒng)的液-液萃取及固相柱分離、凈化效果難以滿足辣椒紅色素中蘇丹紅的檢測要求，因此，樣品的提取、凈化成為辣椒紅色素中蘇丹紅殘留分析的關(guān)鍵。

目前對蘇丹紅的檢測分析主要采用乙腈、丙酮、正己烷提取，固相萃取柱（氧化鋁層析柱、MAX柱、分子印跡柱等）凈化，高效液相色譜法［9-12］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）［13-15］、免疫法［16-17］、薄層色譜法［18-19］ 、電化學(xué)分析法［20-21］等檢測。免疫法只能測單一組分，不滿足多殘留同時檢測，并且容易出現(xiàn)假陽性。電化學(xué)分析法和薄層色譜法的選擇性能力較弱，靈敏度較低，定性能力差。高效液相色譜法的靈敏度相對較低，并且抗干擾能力差。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、抗干擾能力好、定性定量較為準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。目前辣椒紅色素中蘇丹紅的提取、凈化和測定均存在一定的不足，發(fā)展一種準(zhǔn)確度和靈敏度高的檢測方法對辣椒紅色素中蘇丹紅的監(jiān)管具有重要意義，采用分子印跡柱凈化結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定辣椒紅色素中4種蘇丹紅鮮有報(bào)道。該研究在參考國內(nèi)外測定方法的基礎(chǔ)上，探討了不同的試劑及固相小柱對蘇丹紅提取、凈化效果的影響，獲得了一種快速、高效、靈敏、準(zhǔn)確的辣椒紅色素中蘇丹紅的檢測方法，為日常監(jiān)管辣椒紅色素的質(zhì)量安全提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與試材

甲醇、乙腈、乙酸銨、甲酸，均為HPLC級，德國CNW公司；蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ，純度大于98.9%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；超純水；辣椒紅色素，石河子紅安公司，-20 ℃下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器設(shè)備

液質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent 1200-6460），美國Agilent公司；漩渦混合器（MS3 basic），德國IKA公司；高速冷凍離心機(jī)（Sigma 3-30k），德國Sigma公司；超聲波清洗器（KQ-600DE型），昆山市超聲儀器有限公司；超純水儀（IQ7000），美國MilliQ公司。

1.3 HPLC-MS/MS檢測條件

色譜柱為ZORABX SB-Aq C18（3.0 mm×100 mm，3.5 μm）；柱溫30 ℃；流動相為0.1%甲酸水-乙腈；進(jìn)樣量5 μL；流速0.6 mL/min；梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI）；電離方式為ESI+；檢測模式為MRM；噴嘴電壓500 V；干燥器溫度325 ℃；干燥器流速10 L/min；霧化器壓力310.26 kPa；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速12 L/min。毛細(xì)管電壓3 500 V。質(zhì)譜采集參數(shù)見表2。

1.5 樣品前處理

稱取試樣1.00 g（精確至0.01 g），置于50 mL離心管中，加入3 mL 正己烷，渦旋振蕩2 min，超聲提取10 min，以10 000 r/min離心5 min，取上清液于10 mL玻璃離心管中，殘?jiān)蟹謩e再加入3 mL正己烷，重復(fù)提取2次，合并提取液，40 ℃水浴氮吹至5 mL左右，待凈化。

將提取液全部通過活化好的MIP-SDH分子印跡柱（使用前依次用5 mL二氯甲烷和5 mL正己烷活化），5 mL正己烷淋洗，4 mL二氯甲烷洗脫并收集，40 ℃水浴氮吹至近干，1 mL乙腈溶解，超聲20 s，過GHP濾膜，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。

1.6 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

吸取一定體積的蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.5”方法操作，氮吹至近干，1 mL乙腈溶解，超聲20 s，過GHP濾膜，配制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，4種蘇丹紅多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖如圖1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜和色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化。

在電噴霧電離和多反應(yīng)監(jiān)測模式下，對200 ng/mL蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)溶液流動注射泵連續(xù)進(jìn)樣，通過對洗脫溶劑溫度、毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。選擇穩(wěn)定性好、豐度高和干擾小的2個碎片離子作為蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ定性離子和定量離子，并以豐度最強(qiáng)、響應(yīng)值最高的離子對作為定量離子對。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化。

比較水-乙腈、水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-甲醇和5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）-乙腈5種流動相體系對蘇丹紅響應(yīng)值的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動相為0.1%甲酸水-乙腈體系時，蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的響應(yīng)值較高，因此該試驗(yàn)最終選擇0.1%甲酸水-乙腈作為檢測辣椒紅色素中蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的流動相體系。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化。

該試驗(yàn)研究了乙腈、丙酮、乙腈+丙酮（6+4）、正己烷+丙酮（1+1）和正己烷這5種溶劑對4種蘇丹紅的提取效果，結(jié)果如圖2所示。以丙酮為提取溶劑時，蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ的回收率均小于60%；而乙腈、乙腈+丙酮（6+4）和正己烷+丙酮（1+1）為提取溶劑時，蘇丹紅Ⅳ的回收率均為60%左右；而采用正己烷提取時，4種蘇丹紅的回收率均為90%左右，回收率最高，故該試驗(yàn)采用正己烷作為提取溶劑。

2.2.2 凈化條件的優(yōu)化。

該試驗(yàn)比較了不同固相萃取柱（EMR、MAX、Alumina-N、MIP-SDH）及QuEChERS凈化方法對凈化效果的影響，結(jié)果如圖3所示。提取液經(jīng)EMR、MAX和Alumina-N這3種固相萃取柱凈化后，蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ的回收率均小于70%；QuEChERS凈化時，蘇丹紅Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的回收率為60%左右；而當(dāng)采用MIP-SDH凈化提取液時，4種蘇丹紅的回收率均大于90%。因此，該試驗(yàn)采用MIP-SDH固相萃取柱進(jìn)行凈化。

根據(jù)蘇丹紅和辣椒紅色素的理化性質(zhì)，該研究采用正己烷為淋洗溶劑，二氯甲烷為洗脫劑，進(jìn)行洗脫條件優(yōu)化，依次用5、6、7、8和9 mL正己烷淋洗小柱，5 mL二氯甲烷洗脫，試驗(yàn)結(jié)果見圖4。當(dāng)淋洗液體積為5 mL時，4種蘇丹紅均沒有被洗脫下來，而當(dāng)淋洗液體積為6 mL時，蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ會有部分被洗脫下來；隨著淋洗體積的增加，更多的蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ會被洗脫下來。因此，該試驗(yàn)選擇5 mL正己烷作為淋洗液。

在前處理過程不變的條件下，研究了二氯甲烷用量對洗脫效果的影響，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)二氯甲烷用量為2 mL時，4種蘇丹紅的回收率均小于40%；當(dāng)二氯甲烷用量增加至4 mL時，4種蘇丹紅的回收率均大于90%，繼續(xù)增加二氯甲烷的用量，4種蘇丹紅的回收率增加不明顯。因此，該試驗(yàn)選擇4 mL二氯甲烷作為洗脫液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系和檢出限。

通過向辣椒紅色素基質(zhì)中添加蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品，按照“1.6”方法配制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化的前處理和儀器條件下，對4種蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行了測定，以定量離子峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明（表3），4種蘇丹紅在10～200 ng/mL呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2≥0.998 9）。在信噪比S/N為3時，4種蘇丹紅的檢出限均為5 μg/kg；在信噪比S/N為10時，定量限均為10 μg/kg。這表明該方法線性關(guān)系良好、靈敏度高。

2.3.2 回收率和精密度。

任意選取一份辣椒紅色素樣品，按照該研究的方法進(jìn)行3個濃度水平添加并測定回收率，每個水平重復(fù)測定6次，試驗(yàn)結(jié)果見表4，辣椒紅色素中4種蘇丹紅的平均回收率為71.0%～119.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.53%～6.18%，說明該方法回收率和精密度良好。

2.3.3 實(shí)際樣品測定。

利用該方法檢測了新疆某公司不同生產(chǎn)批次的辣椒紅色素樣品，共計(jì)有50批次樣品，其中有一批次樣品檢出蘇丹紅Ⅲ，檢出量為25 μg/kg（圖6），其余均未檢出。

3 結(jié)論

采用SB-Aq色譜柱分離，優(yōu)化了儀器和前處理?xiàng)l件，通過優(yōu)化提取溶劑、提取溶劑體積和凈化條件等因素，提高了辣椒紅色素中4種蘇丹紅的提取效率。方法學(xué)驗(yàn)證和實(shí)際樣品測定結(jié)果表明，該方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、分析速度快的特點(diǎn)，適于辣椒紅色素中4種蘇丹紅的定性定量檢測。

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