莢膜B型多殺性巴氏桿菌外膜囊泡生物學(xué)特性分析與免疫效果評(píng)價(jià)

摘 要： 旨在探究莢膜B型多殺性巴氏桿菌外膜囊泡（outer membrane vesicles， OMVs）的生物學(xué)特性及免疫保護(hù)效果。本研究利用超高速離心和密度梯度離心方法提取莢膜B型多殺性巴氏桿菌的OMVs，通過(guò)透射電子顯微鏡（transmission electron microscope， TEM）觀察OMVs的形態(tài)及大小，采用SDS-PAGE、LC-MS/MS分析OMVs主要蛋白，以蛋白定量試劑測(cè)定其蛋白濃度以及鱟試劑法測(cè)定其內(nèi)毒素含量，然后以新西蘭白兔為動(dòng)物模型，開(kāi)展免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，莢膜B型多殺性巴氏桿菌的OMVs呈完整規(guī)則的球形結(jié)構(gòu)，平均粒徑108.3 nm，其中的蛋白質(zhì)主要集中在33、40、53 ku處，內(nèi)毒素含量為3.31×106 EU·mL－1，用制備的OMVs以50 μg·只-1免疫新西蘭白兔2次后，免疫兔血清抗體效價(jià)可達(dá)1∶405 600，外周血淋巴細(xì)胞IFN-γ和IL-4轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，對(duì)莢膜B型多殺性巴氏桿菌攻擊的保護(hù)效率為75%。綜上表明，莢膜B型多殺性巴氏桿菌的外膜囊泡具有良好的免疫保護(hù)效果，有作為候選疫苗的潛質(zhì)，本研究為外膜囊泡疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 多殺性巴氏桿菌；外膜囊泡；生物學(xué)特性；疫苗

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號(hào)：0366-6964（2024）05-2168-08

收稿日期：2023-08-03

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD1800300）

作者簡(jiǎn)介：高 潔（1997-），女，內(nèi)蒙古烏蘭察布人，碩士，主要從事動(dòng)物疫病防控研究， E-mail： gj821196400@163.com

*通信作者：張 慧，主要從事重大動(dòng)物疫病防控技術(shù)研究，E-mail： zhanghui@cahec.cn；穆 楊，主要從事動(dòng)物疫病病原感染與致病機(jī)制和疾病診斷與病原檢測(cè)新技術(shù)研究，E-mail： muyang@nwafu.edu.cn

Biological Characteristics and Immune Effect Evaluation of Outer Membrane Vesicles of

Capsular Type B Pasteurella multocida

GAO" Jie1， LI" Xiaocheng2， MU" Yang1*， ZHANG" Hui2*， WEI" Rong2， LI" Jie3

（1.Department of Preventive Veterinary Medicine， College of Veterinary Medicine，

Northwest Aamp;F University， Yangling 712100，" China;

2.China Animal Health and Epidemiology Center， Qingdao 266032，" China;

3.The Spirit Jinyu Biological Pharmaceutical Co.， Ltd， Huhhot 010111，" China）

Abstract： In order to explore the biological characteristics and immune effect of outer membrane vesicles （OMVs） of capsular type B Pasteurella multocida. Outer membrane vesicles were extracted by ultra-high speed and density gradient centrifuge methods. The shape and size of the outer membrane vesicles were observed by transmission electron microscope （TEM）， the proteins of OMVs were analyzed by SDS-PAGE and LC-MS/MS， the protein concentration was determined by the BCA method， and the endotoxin content was determined by limulus lysate test. Antibody titers and immune protection test were proceeded in New Zealand white rabbits. The results showed that OMVs had a regular spherical structure， the average particle size was 108.3 nm. OMVs contained a variety of protein bands， the protein bands were mainly 33，40，53 ku. The endotoxin content was 3.31×106 EU·mL-1. The serum antibody titer of immunized New Zealand white rabbits was 1∶405 600 when the injection dose was 50 μg per rabbit. The transcription levels of IFN-γ and IL-4 in peripheral blood lymphocytes increased. The immune protection efficiency against capsular tybe B Pasteurella maltocida was 75%. In conclusion， the OMVs of capsular type B Pasteurella multocida have good immunoprotective effcet and has the potential to be an candidate vaccine. This study lay the foundation for the research of OMVs vaccines.

Key words： Pasteurella multocida; outer membrane vesicles; biological characteristics; vaccine

*Corresponding authors： ZHANG Hui，E-mail： zhanghui@cahec.cn；MU Yang，E-mail：muyang@nwafu.edu.cn

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida， Pm）是一種革蘭陰性菌，Pm由路易斯·巴斯德于1880年首次從禽霍亂病例中分離獲得并以其名字命名［1］。該菌廣泛分布于世界各地。在不同種動(dòng)物間可以相互傳染，也可以感染人，人感染Pm大多因動(dòng)物咬傷所致。Pm能感染家禽、豬、牛、羊等多種動(dòng)物，其中，牛、羊感染多殺性巴氏桿菌通常表現(xiàn)為出血性敗血癥，家禽感染可引起禽霍亂，豬感染可引起豬肺疫，成為危害畜牧行業(yè)的重要病原之一。

目前，預(yù)防由多殺性巴氏桿菌引起的出血性敗血癥主要依靠滅活疫苗，該疫苗能夠?qū)Χ鄽⑿园褪蠗U菌感染產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)效果，但與此同時(shí)與之相對(duì)應(yīng)的副作用也隨之產(chǎn)生。首先，高濃度的滅活疫苗帶來(lái)高含量的細(xì)菌內(nèi)毒素，在注射的同時(shí)極易引起免疫牛肌肉抽搐，甚至休克、死亡；其次，滅活疫苗的使用會(huì)降低肉類(lèi)的品質(zhì)，嚴(yán)重影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值［2］。至于弱毒疫苗，雖然其在多殺性巴氏桿菌不同血清型之間具有交叉免疫保護(hù)作用，但到目前為止，對(duì)弱毒疫苗的基礎(chǔ)性研究仍處于盲區(qū)，人們不能正確劃分保護(hù)力與毒力之間準(zhǔn)確的分界點(diǎn)，弱毒疫苗是否會(huì)引起多殺性巴氏桿菌病新的暴發(fā)［3-4］，至今仍備受質(zhì)疑。

外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）是由細(xì)菌外膜衍生而來(lái)的球形納米結(jié)構(gòu)。研究表明，OMVs表面包含LPS、外膜蛋白和受體等，內(nèi)部含有大量的周質(zhì)蛋白、酶和核酸等［5-6］，可特異性激活宿主免疫系統(tǒng)，同時(shí)其表面攜帶的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）成分還可激活機(jī)體天然免疫。因此，OMVs是一種很有前景的候選疫苗和佐劑［7-8］。本研究采用超高速離心和密度梯度離心方法提取莢膜B型多殺性巴氏桿菌的外膜囊泡，旨在分析其生物學(xué)特性及免疫保護(hù)效果，為巴氏桿菌病新型疫苗研發(fā)奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、菌株與試劑

新西蘭白兔購(gòu)自北京百爾康納特實(shí)驗(yàn)兔繁育生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；莢膜B型多殺性巴氏桿菌CVCC 44502株及CVCC 44702株、多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗由金宇保靈生物藥品有限公司提供；Optiprep密度梯度分離液購(gòu)自上海山進(jìn)生物科技有限公司；蛋白定量試劑購(gòu)自賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）；內(nèi)毒素檢測(cè)試劑購(gòu)自Genescript公司；TAE溶液和兔外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物有限公司；山羊抗兔IgG-HRP二抗購(gòu)自Sigma公司；TSA、TSB培養(yǎng)基購(gòu)自BD公司。

1.2 外膜囊泡的提取及純化

將莢膜B群多殺性巴氏桿菌CVCC 44502株在1 L培養(yǎng)基中培養(yǎng)22～24 h到達(dá)穩(wěn)定期。菌液10 000 r·min－1，4 ℃，離心10 min，取上清，0.45 μm濾膜過(guò)濾。將過(guò)濾得到的無(wú)菌液用截留分子量為100 ku的切向流超濾裝置濃縮，最終得到200 mL濃縮液；將濃縮液42 000 r·min－1，4℃，離心2 h，棄上清，PBS重懸沉淀，重復(fù)超高速離心，用PBS重懸沉淀。此為粗提OMVs。

取上述粗提OMVs溶液2 mL置于超高速離心管底部，并將40%、35%、30%、25%、20%、15% Optiprep溶液依次鋪管中，35 000 r·min－1，4℃，離心16 h。通過(guò)SDS-PAGE確定OMVs所處密度層，收集該層成分，PBS稀釋后用100 ku蛋白濃縮管濃縮，0.22 μm濾膜過(guò)濾，分裝于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 OMVs透射電鏡形態(tài)學(xué)觀察及粒徑分析

將分散均勻的OMVs溶液適當(dāng)稀釋?zhuān)?0 μL稀釋液滴在銅網(wǎng)上，吸附30 min后，用濾紙吸干；然后滴加10 μL的1％磷鎢酸染色3～5 min，濾紙吸干并過(guò)夜風(fēng)干。透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察OMVs的大小及形態(tài)。取凍存的OMVs解凍，對(duì)樣本用PBS進(jìn)行100倍稀釋?zhuān)苯硬捎眉{米顆粒跟蹤分析技術(shù)檢測(cè)分析其粒徑大?。?］。

1.4 測(cè)定OMVs蛋白濃度

根據(jù)蛋白定量試劑說(shuō)明書(shū)，用梯度稀釋的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品建立蛋白濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，取20 μL OMVs樣品，加入200 μL BCA工作液，重復(fù)3孔。37 ℃孵育30 min，在562 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算OMVs樣品的蛋白濃度。

1.5 鱟試劑法檢測(cè)OMVs的內(nèi)毒素含量

將內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)⑴c復(fù)溶好的鱟試劑混合，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制，將樣品進(jìn)行107稀釋后采用鱟試劑法測(cè)定OMVs樣品中的內(nèi)毒素含量。

1.6 OMVs中核酸檢測(cè)

吸取純化好的OMVs 100 μL，沸水浴10 min，冷卻后10 000 r·min－1離心10 min，吸取上清后，分光光度計(jì)檢測(cè)DNA含量。上清液加入5×Loading buffer混勻，120 V，1%瓊脂糖凝膠電泳30 min，紫外光下檢測(cè)有無(wú)核酸條帶。

1.7 OMVs中蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)

吸取純化好的OMVs 50 μL，與2×蛋白上樣緩沖液等體積混合后煮沸10 min，取10 μL進(jìn)行12％SDS-PAGE，電泳時(shí)先80 V電泳20 min，再100 V電泳30 min，考馬斯亮藍(lán)染色后觀察。

1.8 蛋白質(zhì)譜分析

將提取純化的外膜囊泡送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行LC-MS/MS，分析OMVs蛋白質(zhì)組成，并進(jìn)一步進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。鑒定出樣品中的蛋白質(zhì)，在Uniprot（https：//www.uniprot.org/）進(jìn)行檢索獲取蛋白具體信息進(jìn)行分析。

1.9 OMVs免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)

將試驗(yàn)兔分成4組，每組4只，分組及免疫情況見(jiàn)表1。OMVs疫苗組和多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗組均免疫2次，中間間隔21 d。將牛莢膜B型多殺性巴氏桿菌CVCC 44702株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用PBS稀釋計(jì)數(shù)后，參照《中國(guó)獸藥典》（2020年版），于第2次免疫后21 d，以2 CFU·只－1劑量肌肉注射所有試驗(yàn)兔進(jìn)行攻菌。攻菌后每天觀察2次，記錄試驗(yàn)兔死亡數(shù)量，連續(xù)記錄1周。試驗(yàn)時(shí)分別于免疫前、首次免疫后21 d、第2次免疫后21 d對(duì)試驗(yàn)兔進(jìn)行耳緣靜脈采血，分離血清，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 間接ELISA方法檢測(cè)血清抗體效價(jià)

用實(shí)驗(yàn)室已建立的OMVs間接ELISA方法測(cè)定血清抗體效價(jià)。具體操作如下，將多殺性巴氏桿菌OMVs稀釋至0.23 μg·mL－1，100 μL·孔－1包被于96孔酶標(biāo)板中，4 ℃孵育過(guò)夜；次日洗板后用含5% BSA的PBST封閉2 h；之后依次加入1∶2 000稀釋的血清樣本和1∶5 000稀釋的山羊抗兔IgG-HRP二抗，置37 ℃溫箱孵育，反應(yīng)1 h，洗滌后在酶標(biāo)板中加入TMB顯色液，每孔100 μL，避光反應(yīng)10 min。終止顯色反應(yīng)后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的吸光度值（OD450 nm）。比較血清樣本（S）與陰性對(duì)照血清（N）在波長(zhǎng)為450 nm處吸光度的比值（S/N），以S/N≥2.1判定為陽(yáng)性，以S/N≥2.1的最高血清稀釋倍數(shù)作為每份血清樣本的抗體效價(jià)。

1.11 外周血淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子含量檢測(cè)

分別在免疫前、第1次免疫后21 d以及第2次免疫后21 d采集抗凝血，離心棄去血漿并裂解紅細(xì)胞，洗滌后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分離淋巴細(xì)胞層，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107個(gè)·mL－1，TRIzol法提取細(xì)胞RNA。參考文獻(xiàn)［10-11］進(jìn)行細(xì)胞因子檢測(cè)引物合成。染料法熒光定量PCR測(cè)定每組新西蘭兔淋巴細(xì)胞中相應(yīng)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平，采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 OMVs形態(tài)及粒徑分析

透射電鏡觀察結(jié)果顯示，大多數(shù)OMVs呈完整、規(guī)則的球形結(jié)構(gòu)（圖1）。粒徑分析結(jié)果顯示，提取的OMVs平均粒徑在108.3 nm，符合經(jīng)典外膜囊泡粒徑20～200 nm的大小，濃度為1.6×1010 particles·mL－1（圖1）。

2.2 OMVs蛋白濃度檢測(cè)

根據(jù)蛋白定量試劑說(shuō)明書(shū)操作步驟得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程：y=0.789 2x-0.082 7，R2=0.997 5；在562 nm波長(zhǎng)測(cè)定樣品吸光度分別為0.215、0.228、0.207。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程得到OMVs蛋白濃度為（8.882×10－2±0.007）mg·mL－1，提取的外膜囊泡共有5 mL，則1 L菌液共獲得4.41×10－1 mg純化的OMVs。

2.3 OMVs中內(nèi)毒素濃度檢測(cè)

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)得的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到回歸方程為L(zhǎng)gTg=2.825 8-0.247 0LgC，相關(guān)系數(shù)為r=0.998 0。根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算獲得提取純化的OMVs樣品中內(nèi)毒素含量為3.31×106 EU·mL－1。

2.4 OMVs中核酸檢測(cè)

對(duì)OMVs樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，紫外光下觀察可見(jiàn)彌散性抹帶，無(wú)特定大小條帶。微量分光光度計(jì)檢測(cè)顯示DNA濃度為29.55 ng·μL－1（圖2）。

2.5 SDS-PAGE分析

對(duì)純化的OMVs進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖3所示。純化的OMVs中蛋白成分主要集中在30%～35% Optiprep中，包含多種不同大小的蛋白質(zhì)，蛋白分子大小分布在25～130 ku之間，主要集中在33、40、53 ku處。

2.6 純化 OMVs 中蛋白的質(zhì)譜分析

質(zhì)譜分析共鑒定到232種蛋白和2 263個(gè)肽段。為進(jìn)一步確定從 OMVs 鑒定到的232種蛋白質(zhì)的功能，對(duì)這些蛋白進(jìn)行了GO功能注釋?zhuān)诸?lèi)結(jié)果如圖4所示。其中，在參與生物學(xué)過(guò)程的蛋白中，102種蛋白參與細(xì)胞過(guò)程（Cellular process），72種"" 蛋白參與代謝過(guò)程（Metabolic process），40種蛋白參與定位（Localization），34種蛋白參與刺激反應(yīng)（Response to stimulus），少數(shù)蛋白參與了生物調(diào)節(jié)（Biological regulation）、生長(zhǎng)（Growth）、多生物過(guò)程（Multi-organism process）等；在參與分子功能過(guò)程的蛋白中，有77種蛋白具有結(jié)合（Binding）功能，44種蛋白具有催化活性（Catalytic activity），29種蛋白具有結(jié)構(gòu)分子活性（Structural molecule activity），還有少量蛋白具有轉(zhuǎn)運(yùn)活性（Transporter activity）、分子調(diào)控（molecular function regulator）功能、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性（Transcription regulator activity）等；在參與細(xì)胞組成過(guò)程的蛋白中，125種蛋白參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)體（Cellular anatomical entity）組成、56種蛋白參與細(xì)胞內(nèi)（Intracellular）組成、54種蛋白參與蛋白復(fù)合物組成，少數(shù)參與其他細(xì)胞組成過(guò)程。在鑒定的蛋白中，包含具有免疫活性的細(xì)菌外膜蛋白OMP A、OMP H［12］。

2.7 血清抗體效價(jià)檢測(cè)

在免疫前、第1次免疫后21 d和第2次免疫21 d后，分別收集免疫組和對(duì)照組新西蘭白兔血清，采用ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)。結(jié)果見(jiàn)圖5。50 μg OMVs疫苗組一免后平均抗體效價(jià)達(dá)1∶51 200，二免后達(dá)1∶405 600。25 μg OMVs疫苗組二免后平均抗體效價(jià)為1∶102 400，多殺性巴氏桿菌滅活免疫組二免后平均抗體效價(jià)為1∶811 200，50 μg OMVs疫苗組和多殺性巴氏桿菌滅活免疫組抗體水平增長(zhǎng)幅度均高于25 μg OMVs疫苗組。PBS對(duì)照組抗體均為陰性。

2.8 外周血淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平

提取分離到的淋巴細(xì)胞RNA，采用熒光定量PCR測(cè)定相應(yīng)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果如圖6所示。免疫組IFN-γ和IL-4的含量較對(duì)照組轉(zhuǎn)錄水平均顯著升高。

2.9 免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)

免疫前后及攻毒后12 h內(nèi)，動(dòng)物無(wú)異常表現(xiàn)；攻毒后24～72h內(nèi)，部分試驗(yàn)兔出現(xiàn)萎靡不振、精神沉郁、被毛粗亂、停止進(jìn)食等癥狀，且試驗(yàn)兔出現(xiàn)死亡；攻毒后72 h，50 μg OMVs疫苗組和多殺性巴氏桿菌滅活疫苗組的保護(hù)率均為75%，25 μg OMVs疫苗組保護(hù)率為25%，PBS對(duì)照組試驗(yàn)兔全部死亡。結(jié)果見(jiàn)表2。OMVs疫苗的保護(hù)效果符合《中國(guó)獸藥典》（2020年版）針對(duì)多殺性巴氏桿菌疫苗保護(hù)效果的規(guī)定。

3 討 論

本研究利用超高速離心法結(jié)合 Optiprep 密度梯度離心法成功提取了多殺性巴氏桿菌外膜囊泡。透射電子顯微鏡觀察顯示，獲得的外膜囊泡為大小不等（粒徑范圍在20～200 nm）的雙層膜球狀結(jié)構(gòu)；利用納米顆粒跟蹤分析確定純化的外膜囊泡平均粒徑為108.3 nm，濃度為1.6×1010 particles·mL－1。SDS-PAGE 分析顯示 OMVs 包含多種不同大小的蛋白質(zhì)，蛋白分子大小在 25～130 ku 之間，主要集中在 33、40、53 ku 處。BCA法測(cè)得外膜囊泡的蛋白濃度為（8.882×10－2±0.007）mg·mL－1，鱟劑試驗(yàn)測(cè)定其中的內(nèi)毒素含量為3.31×106 EU·mL－1。

本研究在前期提取OMVs的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，有很多外在條件會(huì)影響外膜囊泡的提取效率，且在純化過(guò)程中，會(huì)損失大量的外膜囊泡。由于外膜囊泡是革蘭陰性菌在生長(zhǎng)過(guò)程自然分泌的，當(dāng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基類(lèi)型或者化學(xué)刺激發(fā)生改變時(shí)，細(xì)菌分泌的外膜囊泡的形態(tài)、數(shù)量、蛋白組成以及功能都會(huì)發(fā)生改變［13］，因此，為保證提取的外膜囊泡狀態(tài)穩(wěn)定，本研究首先測(cè)定了細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，參考文獻(xiàn)［7］報(bào)道的在細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期與穩(wěn)定期交界時(shí)期（對(duì)數(shù)期后期）提取外膜囊泡，并嚴(yán)格控制接菌數(shù)量、培養(yǎng)時(shí)間以及培養(yǎng)條件，且在每次提取后，通過(guò)透射電子顯微鏡觀察外膜囊泡形態(tài)特征，以獲得相同穩(wěn)定的外膜囊泡。

脂多糖是內(nèi)毒素的重要組成部分。目前，降低外膜囊泡中內(nèi)毒素的方法主要是在超高速離心回收OMVs時(shí)在重懸緩沖液中加入去污劑脫氧膽酸鈉，通過(guò)孵育、離心等方式獲得去內(nèi)毒素OMVs，但這種做法通常會(huì)洗去外膜囊泡中的部分蛋白，造成外膜囊泡的免疫原性降低。另外，通過(guò)基因敲除或修飾LPS結(jié)構(gòu)，降低LPS對(duì)外膜囊泡的影響也是一種很好的辦法。本研究提取的外膜囊泡雖內(nèi)毒素含量較高，但在本實(shí)驗(yàn)室先前研究基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，一定濃度以下，皮下注射到小鼠體內(nèi)，并沒(méi)有產(chǎn)生不良效果，所以本研究未對(duì)提取純化的OMVs進(jìn)行降低內(nèi)毒素的處理。

本研究對(duì)外膜囊泡進(jìn)行了蛋白組學(xué)分析，GO功能注釋可知本研究提取純化的外膜囊泡中包含的蛋白質(zhì)主要參與細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程、定位功能、結(jié)合功能、催化活性功能、結(jié)構(gòu)分子活性功能以及細(xì)胞構(gòu)成等。OMVs中包含了參與細(xì)菌生命活動(dòng)的多種蛋白，細(xì)菌外膜蛋白如OMP A、OMP H也在其中，進(jìn)一步說(shuō)明外膜囊泡與細(xì)菌外膜的相關(guān)性，具有潛在的免疫保護(hù)作用。

從血清抗體水平的結(jié)果可以看出，疫苗免疫后，各免疫組新西蘭白兔血清抗體水平均有大幅升高，其中50 μg OMVs疫苗組和多殺性巴氏桿菌滅活疫苗免疫組抗體水平升高顯著，50 μg OMVs疫苗組二免后達(dá)1∶405 600。有研究報(bào)道在小鼠模型，OMVs免疫刺激小鼠產(chǎn)生的抗體可以為小鼠提供針對(duì)多殺性巴氏桿菌感染的保護(hù)作用［14］。本研究利用莢膜B型多殺性巴氏桿菌CVCC 44702作為攻菌株，50 μg OMVs疫苗組和多殺性巴氏桿菌滅活疫苗免疫組的保護(hù)效果均為75%，符合《中國(guó)獸藥典》（2020年版）針對(duì)多殺性巴氏桿菌疫苗保護(hù)效果的規(guī)定。

以上結(jié)果表明，基于OMVs的多殺性巴氏桿菌病疫苗能提供較好的同源攻毒保護(hù)效果及高的抗體水平，表明OMVs具有良好的安全性及免疫效果，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié) 論

本研究提取純化了莢膜B型多殺性巴氏桿菌外膜囊泡，分析其粒徑大小等生物學(xué)特性，免疫新西蘭白兔后，產(chǎn)生與全菌滅活疫苗相當(dāng)?shù)目贵w水平和攻毒保護(hù)效果，說(shuō)明本研究提取的外膜囊泡具有良好的免疫原性，為今后莢膜B型多殺性巴氏桿菌疫苗研究提供了理論依據(jù)。

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（編輯 范子娟）