三株雞傳染性支氣管炎病毒優(yōu)勢(shì)流行毒株全基因組分析及其致病性

摘 要： 為調(diào)查研究禽傳染性支氣管炎病毒（IBV）的流行及優(yōu)勢(shì)毒株致病特性，本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離的IBV毒株進(jìn)行了遺傳演化研究和致病性研究，旨在了解我國當(dāng)下IBV流行毒株基因型、生物學(xué)特性以及為新疫苗的研制提供借鑒參考。首先對(duì)56株IBV分離毒株S1全長核苷酸序列進(jìn)行遺傳演化分析，從中挑選了MH20、KC和JS96 3株優(yōu)勢(shì)基因型毒株進(jìn)行全基因組測(cè)序分析，然后選取毒力較強(qiáng)的JS96毒株進(jìn)行了SPF雞致病性試驗(yàn)。結(jié)果表明：遺傳演化分析結(jié)果顯示GI-19是我國主要流行毒株，占比約53.57％，同時(shí)變異毒不斷涌現(xiàn)，GVI（新基因型）明顯的流行增多。3株優(yōu)勢(shì)基因型分離毒株的全長基因組與QX-like毒株相似性最高，達(dá)到97%以上，但與國內(nèi)外疫苗株、經(jīng)典毒株的相似性低，僅為77%左右?？乖砦环治鐾瑯颖砻髁朔蛛x株與疫苗毒株、經(jīng)典毒株的B細(xì)胞抗原表位數(shù)量和序列都存在差異。3株分離毒株均可導(dǎo)致SPF雞胚矮化和致死，其中JS96對(duì)1日齡SPF雞的致病率高于15日齡SPF雞，1日齡SPF雞100%死亡率，15日齡SPF雞出現(xiàn)生長顯著遲緩和個(gè)別雞癥狀明顯，發(fā)病雞剖檢均可見“花斑腎”。本研究表明，QX-like基因型IBV毒株是現(xiàn)下IBV的主要流行毒株，對(duì)低日齡雞致病性強(qiáng)，易發(fā)生基因重組，與疫苗毒株、經(jīng)典毒株S蛋白相似性低，適配性較差，急需選擇合適疫苗及研發(fā)新型疫苗，才能控制當(dāng)下IBV疫病流行，減少養(yǎng)禽業(yè)的損失。

關(guān)鍵詞： 禽傳染性支氣管炎病毒；基因測(cè)序；演化與相似性分析；致病性

中圖分類號(hào)： S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號(hào)：0366-6964（2024）05-2109-14

收稿日期：2023-07-13

基金項(xiàng)目：廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2021B0707010009）；廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022B1111040001）；肇慶市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2021C001）；嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室肇慶分中心自主立項(xiàng)項(xiàng)目（P20211154-0301）

作者簡介：熊 挺（1990-），男，江西南昌人，博士，主要從事動(dòng)物傳染病學(xué)研究，E-mail：bearvet@163.com

*通信作者：陳瑞愛，主要從事重要畜禽疾病疫苗研制研究，E-mail：chensa727@vip.126.com

Whole Genome Analysis of Three Predominant Epidemic Strains of Chicken Infectious Bronchitis

Virus and Their Pathogenicity

XIONG" Ting1，2， HE" Xianming1， ZHAO" Xiya1， ZHUANG" Tingting1， HUANG" Meizhen1， LIANG" Shijin1， YU" Chuanzhao1， LIANG" Xuejing1， CHEN" Ruiai1，2*

（1.Zhaoqing Branch Center of Guangdong Provincial Laboratory of Modern Agricultural Science

and Technology， Zhaoqing 526238，" China;

2.College of Veterinary Medicine，

South China Agricultural University， Guangzhou 510642，" China）

Abstract：

The genetic evolution and pathogenicity of isolated infectious bronchitis virus （IBV） strains in the laboratory were studied to investigate the prevalence of IBV and the pathogenic characteristics of dominant strains， and to provide reference for the development of new vaccines.

In this study， the complete S1 nucleotide sequences of 60 strains IBV were analyzed， and three dominant genotypes were selected for whole genome sequencing analysis， named MH20， KC and JS96 strains. JS96 strain with higher virulence was selected for SPF chicken pathogenicity experiment. The results of genetic evolution analysis show that GI-19 is the main epidemic strain in China， accounting for about 53.57% of cases. At the same time， variants were emerging， and GVI （new genotype） was obviously prevalent. The whole genome sequencing showed that the complete genome of the three isolated strains had the highest similarity with QX-like strains （more than 97%）， but the sequence homology with vaccine strains and classical strains was low， only about 77%. Epitope analysis also showed that there were differences in the number and sequence of B cell epitopes among the isolates， vaccine strains and classical strains. The pathogenicity of JS96 in 1-day-old SPF chickens was higher than that in 15-day-old SPF chickens， and the mortality rate of 1-day-old SPF chickens was 100%. Significant growth retardation and obvious symptoms were observed in some 15-day-old SPF chickens. This study shows that QX-like IBV strain is the main epidemic strain of IBV at present， which has strong pathogenicity to young chickens， is prone to I gene recombination， has low similarity with S protein of vaccine strain and classical strain， and has poor adaptability， so it is urgent to select appropriate vaccines and develop new vaccines in order to control the current epidemic of IBV and reduce losses in the poultry industry.

Key words： avian infectious bronchitis virus; sequencing; evolution and homology analysis; pathogenicity

*Corresponding author：" CHEN Ruiai， E-mail： chensa727@vip.126.com

禽傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）屬于γ-冠狀病毒，是一種雞的高度傳染性病毒，主要損害呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)，可造成雛雞死亡以及飼料報(bào)酬率降低，蛋雞產(chǎn)蛋量、品質(zhì)下降等，嚴(yán)重危害著雞養(yǎng)殖業(yè)［1］。IB可分為呼吸型、腎型、生殖型、腸型和腺胃型［2］。1931年SChalk等首次報(bào)道一種新型的雞呼吸道疾病，該病主要侵害雛雞的呼吸道，表現(xiàn)為張口呼吸、咳嗽和氣管啰音等［3］；隨后發(fā)現(xiàn)IB的組織嗜性越來越廣泛，引起感染雞其他癥狀的病例先后被報(bào)道。IB可侵害雞生殖系統(tǒng)，引起卵巢充血、出血，和輸卵管永久性損傷，最終導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)蛋量和蛋品質(zhì)下降［4］；1962年，Cumming等發(fā)現(xiàn)可引起“花斑腎”腎炎的Holt和Gray毒株；1986年又分離出腸型毒株，可造成腸道損傷［5］。我國在1972年首次報(bào)道雞群中存在IB，于1982年發(fā)現(xiàn)腎病變型，1990年代末，我國分離到以雞腺胃腫大為特征的腺胃型IBV毒株［6-7］。目前，IB已在美洲、亞洲、歐洲等的50多個(gè)國家及地區(qū)發(fā)生和流行。

IBV屬于冠狀病毒科冠狀病毒亞科的Gamma冠狀病毒，病毒為有囊膜不分節(jié)段單股正鏈RNA病毒。IBV復(fù)制依賴RNA 聚合酶，然而 RNA 聚合酶缺乏校正能力［1］。因此，病毒的這種復(fù)制機(jī)制使得病毒很容易發(fā)生變異或重組。IBV不同毒株間自然重組可以產(chǎn)生新的毒株，進(jìn)而導(dǎo)致新的基因型或血清型的出現(xiàn)。目前已發(fā)現(xiàn)該病毒的血清型有30 種以上，不同的血清型之間交叉保護(hù)低或無交叉保護(hù)［8］。其中，S1基因的遺傳多樣性非常高，如GVIII-2與其他基因型核苷酸相似性低至52.7%，S1基因是IBV基因分型的靶基因，其演化和變異可能引起IBV抗原漂移、基因型和血清型變化［9］。

高明燕等［10］統(tǒng)計(jì)近年來我國IBV的傳播和流行現(xiàn)狀，結(jié)果表明與疫苗廣泛使用相關(guān)的IBV基因型主要是Mass型（GI-1）和4/91型（GI-13）。上述兩種弱毒活疫苗均出現(xiàn)疫苗再分離的情況［11］，頻繁參與其他流行毒株的重組，已成為IBV的重要基因供體［12］。但Mass型和4/91型疫苗株又與我國流行的各個(gè)基因型毒株演化距離都較遠(yuǎn)，難以給雞群提供足夠的免疫保護(hù)，比如，王露等［13］報(bào)道4/91型疫苗不能抵抗QX型和LDT3型野毒株的感染。QX型或LX4型（GI-19）是我國20多年以來最主要的IBV本土優(yōu)勢(shì)基因型［10］。QX型IBV毒株沒有明顯的時(shí)間和地理分布傾向，不僅在國內(nèi)廣泛流行，還在日本、韓國、俄羅斯以及歐洲各國傳播［9］。牛登云等［14］研究發(fā)現(xiàn)，該型在2018—2019年全國12個(gè)省份的分離毒株中占比79.85%，而且與參考毒株SZ相比，氨基酸變異已經(jīng)超過13%。該型毒株毒力較強(qiáng)，主要侵害雞的腎臟，造成腎組織損傷，尿酸鹽沉積，死亡率高［10］。

我國貿(mào)易與人員來往頻繁，地域環(huán)境差異大，養(yǎng)殖方式不同，畜牧業(yè)發(fā)展水平不一，雞群免疫壓力不一樣等因素導(dǎo)致IBV多基因型并存，疫病防控困難，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害重大［15］。因此分離鑒定臨床流行毒株，對(duì)于IBV疫苗毒株的選擇與研制具有重要的指導(dǎo)意義。本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室從養(yǎng)殖場疑似IB病雞氣管和腎中分離到3株IBV代表毒株進(jìn)行病毒全基因組測(cè)序分析和致病性研究，以其為IBV流行病學(xué)調(diào)查和新疫苗的研制提供借鑒參考。

1 材料與方法

1.1 主要病原與試劑

IBV分離株由實(shí)驗(yàn)室分離保存（病毒分離背景見表1），挑選的3株IBV分離株已用加粗標(biāo)出。SPF雞胚和SPF雞購自廣東溫氏大華農(nóng)生物藥品有限公司。RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（KP118-02）購自天根生物科技有限公司；TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit和PrimeSTAR GXL DNA Polymerase購自TAKARA公司；DNA Marker和RNase-free水購自北京全式經(jīng)生物技術(shù)有限公司。

1.2 2014—2022年禽傳染性支氣管炎病毒分離株演化分析

本實(shí)驗(yàn)室從2014—2022年間于山東、廣東和江蘇等地分離的IBV毒株56株IBV，采用靶向IBV S1全長基因核苷酸序列的特異引物IBV-S1F（AAGACTGAACAAAAGACCGACT）和IBV-S1R（CAAAACCTGCCATAACTAACATA）進(jìn)行PCR擴(kuò)增S1基因，產(chǎn)物送測(cè)序。獲得測(cè)序結(jié)果后，基于S1基因序列對(duì)60株IBV毒株進(jìn)行演化分析。

1.3 3株IBV代表毒株的全基因組測(cè)序分析

1.3.1 3株禽傳染性支氣管炎病毒分離毒株的增殖與鑒定

文獻(xiàn)報(bào)道，IB與禽流感或/和新城疫混合感染病例也時(shí)有發(fā)生。因此采用文獻(xiàn)報(bào)道的引物對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離保存的3株IBV毒株進(jìn)行外源病毒檢測(cè)（表2）。將鑒定后的3株IBV毒株尿囊液用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，按1∶100的比例加入青霉素。將過濾和抗生素處理的上清以0.2 mL·枚-1劑量接種7日齡SPF雞胚尿囊腔，置37℃培養(yǎng)箱孵育3 d，每12 h照胚觀察一次，棄去24 h內(nèi)死亡胚，第3天收尿囊液連續(xù)傳2代。提取第3代次病毒的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用“1.2”中的IBV特異引物進(jìn)行PCR鑒定，并將尿囊液于-80℃保存。

1.3.2 3株禽傳染性支氣管炎病毒分離毒株病毒全基因組測(cè)序與分析

用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取種毒尿囊液總RNA，立即使用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（KP118-02）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，干冰冷鏈送測(cè)序上海探普生物科技有限公司進(jìn)行二代測(cè)序。測(cè)序結(jié)果拼接成病毒全長基因組。并對(duì)IBV分離毒株的S、E、M和N四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白基因序列進(jìn)行Blast分析，并采用MegAlign、MEGA7.0、RDP4和BepiPred 1.0 Server生物信息學(xué)軟件進(jìn)行相似性分析、演化分析、重組分析以及B細(xì)胞線性化抗原表位預(yù)測(cè)。

1.3.3 3株禽傳染性支氣管炎病毒分離毒株病毒對(duì)雞胚的致病性

將病毒液用滅菌PBS進(jìn)行10倍梯度稀釋，從10-1～10-8，將稀釋后的病毒以0.2 mL·枚-1劑量接種7日齡SPF雞胚，每個(gè)稀釋度重復(fù)5枚，觀察記錄雞胚的死亡數(shù)以及病變情況，按Reed-Muench法計(jì)算出病毒的EID50。

1.3.4 JS96代表毒株對(duì)1日齡和15日齡SPF雞致病性

以104 EID50的JS96經(jīng)點(diǎn)眼滴鼻方式接種1日齡SPF雞4只，1只不攻毒作為對(duì)照，觀察SPF雞的發(fā)病情況，剖檢病雞并取內(nèi)臟組織做病理組織切片。將60只15日齡SPF雞隨機(jī)分為2組，分別用104 EID50的JS96和PBS滴鼻和肌注結(jié)合攻毒。各試驗(yàn)組在攻毒后48、96、120和164 h各隨機(jī)取1只雞進(jìn)行放血處死，剖檢觀察腎臟病理變化。剩余雞繼續(xù)飼養(yǎng)7 d后統(tǒng)計(jì)體重差異。

2 結(jié) 果

2.1 56株禽傳染性支氣管炎病毒分離株演化分析

測(cè)序獲得本實(shí)驗(yàn)室2014—2022年分離的56株病毒S1全長基因核苷酸序列?；诓《維1全長基因核苷酸序列，應(yīng)用MEGA7軟件進(jìn)行同源演化分析，演化樹顯示目前我國主要流行毒株包括GI-1、GI-7、GI-13、GI-18、GI-19、GI-22、GI-23、GV1-1和變異毒株。而且，近年來分離的毒株近一半屬于QX-like基因型（GI-19病毒譜系）（圖1），流行最為廣泛，占比達(dá)51.67%，GVI-1次之，因此根據(jù)演化樹位置挑選3株GI-19基因型分離株進(jìn)一步研究。

2.2 3株GI-19 （QX-like）基因型IBV代表毒株種毒的增殖與鑒定

采用表2特異性引物進(jìn)行外源病毒檢測(cè)，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示3株GI-19 （QX-like）基因型IBV代表毒株均只能擴(kuò)增出IBV的特異性檢測(cè)條帶，F(xiàn)AdV-4、H9AIV、H5AIV、ILTV、IBDV、NDV和ALV-A均不能擴(kuò)增出目的條帶（圖2A），因此，可判斷實(shí)驗(yàn)室分離保存的3株IBV毒株不存在FAdV-4、H9AIV、H5AIV、ILTV、IBDV、NDV和ALV-A污染，3株分離毒株純凈度好。將雞胚增殖的尿囊液病毒，在使用之前RT-PCR再次鑒定，圖2B鑒定結(jié)果顯示3株毒株增殖的尿囊液均呈陽性（1～3分別為KC、MH20和JS96），說明3株分離毒株增殖成功。

2.3 3株分離毒株全基因組比較分析

3株分離毒株基因組大小約為27.6 kb，具5′端帽子和3′端PolyA尾結(jié)構(gòu)，其中各種輔助基因分布在5′端1/3區(qū)域的非結(jié)構(gòu)基因內(nèi)（表3），這些輔助基因雖不參與編碼結(jié)構(gòu)蛋白，但對(duì)于調(diào)控病毒復(fù)制以及致病機(jī)制具有重要作用［18］。MH20、KC和JS96 3株分離毒株結(jié)構(gòu)蛋白基因S、E、M和N分別位于20 353—23 850、24 198—24 524、24 496—25 168和25 917—27 146、20 353—23 850、24 198—24 524、24 496—25 168和25 917—27 146、20 344—23 841、24 189—24 515、24 487—25 164和25 913—27 142 nt。S、E、M和N結(jié)構(gòu)蛋白基因全長分別為3 498、327、678、1 230 nt。

2.4 3株分離毒株Furin酶位點(diǎn)分析

Furin酶切位點(diǎn)對(duì)基因型具有一定指征性，對(duì)MH20、KC和JS96 3株分離毒株Furin酶切位點(diǎn)進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)3株IBV在536位氨基酸處具有相同的Furin酶切位點(diǎn)HRRRR，與QX-like基因型毒株具有相似的Furin酶切位點(diǎn)（HRRRR）（圖3），初步判斷此3株分離毒株很可能是QX-like基因型毒株。缺失第二Furin酶切位點(diǎn)，這可能是該3株毒株缺乏與Beaudette相似的細(xì)胞適應(yīng)性的重要原因之一。

2.5 3株分離毒株相似性分析

用Snapgene進(jìn)行病毒全基因組拼接，將3株分離病毒全基因組在NCBI進(jìn)行blast比較分析核苷"" 酸相似性。結(jié)果顯示，MH20、KC和JS96毒株分別與NCBI數(shù)據(jù)庫中YX10（JX840411.1）、CK/CH/LLN/131040（KX252787.1）和CK/CH/LJL/140924（KX302873.1）毒株相似性最高，相似性為99.15%、97.09%和97.83%。S蛋白是誘導(dǎo)中和抗體的主要免疫原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，故對(duì)高變區(qū)S1基因序列進(jìn)行分析，3株毒株與QX-like代表毒株（MN548289.1）比較，未發(fā)現(xiàn)基因插入和缺失現(xiàn)象，以基因點(diǎn)突變導(dǎo)致的差異為主。而S1相似性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，3株毒株之間S1的相似性較高，為95.1%～96.7%，而3株分離毒株與國內(nèi)外疫苗毒株H120、H52以及ArkDPI的S1的相似性，僅為75.9%～78.1%，與經(jīng)典毒株M41和Beaudette的相似性也只有77.2%～77.7%（圖4）。這說明當(dāng)下流行的IBV毒株基因型與現(xiàn)有商品化疫苗的適配性較差。

2.6 3株分離毒株抗原B抗原表位分析

通過在線軟件BepiPred 1.0 Server對(duì)分離毒株與疫苗毒株H120和經(jīng)典毒株M41主要免疫原蛋白S的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示分離毒株（綠色）有31個(gè)抗原表位，與對(duì)照毒株（藍(lán)色）有30個(gè)抗原表位，此外，分離毒株與對(duì)照毒株相比，其S蛋白B細(xì)胞抗原表位除數(shù)量差異外，序列一致性上也存在一定的差異（圖5）。這也一定程度上解釋了流行毒株與疫苗毒株交叉免疫反應(yīng)差的原因。

2.7 3株分離毒株重組分析

通過RDP4生物信息學(xué)軟件，將3株分離毒株與2株疫苗毒株（H120和H52）、經(jīng)典毒株M41以及其他7株同源較高的同基因型毒株進(jìn)行重組事件分析，結(jié)果顯示CK/CH/SD/MH20 2015、CK/CH/GD/KPLH-CZQ 2018和Isolated SD（GenBank： KY421673）分別在4 678—11 032和5 462—9 180處發(fā)生重組（圖6A、B）；CK/CH/JS/TAYH 2018和CK/CH/LJL/140734（GenBank： KX425847）在10 972—11 401處發(fā)生重組（圖6C），它們的親本分別是SD_QX-like （KY421673）、SD_QX-like （KY421673）和CK/CH/LJL/140734（KX425847.1）。這說明IBV容易發(fā)生基因重組事件，基因重組可能是IBV形成新的基因型和血清型重要原因之一。

2.8 3株分離毒株對(duì)SPF雞胚的致病性

MH20、KC和JS96 3株分離毒株均具有雞胚致病性。其中MH20（圖7a）和KC（圖7b）主要引起雞胚矮化；JS96則具有更強(qiáng)的雞胚致病性，不僅可致雞胚矮化還可引起雞胚嚴(yán)重出血（圖7c），三者的EID50分別為106.668、106.468和107.699·mL-1。因此，選取JS96為代表毒株進(jìn)一步研究QX-like流行毒株對(duì)SPF雞的致病性。

2.9 JS96分離毒株對(duì)1和15日齡SPF雞的致病性

以每只滴鼻點(diǎn)眼和肌注結(jié)合攻毒4只1日齡SPF雞，200 μL·只-1（約104 EID50）。結(jié)果顯示：JS96對(duì)于1日齡SPF雞具有致病性，發(fā)病率100%。發(fā)病雞出現(xiàn)精神沉郁、羽毛蓬亂、排白色稀糞等癥狀。剖檢典型病變?yōu)槟I腫大、尿酸鹽沉積，可見“花斑腎”，氣管出血（圖8）。JS96接種1日齡SPF雞，病理組織切片結(jié)果顯示JS96毒株主要對(duì)1日齡SPF雞的氣管、肺和腎造成病理損傷，氣管表現(xiàn)為纖毛和黏膜上皮脫落，肺則呈現(xiàn)氣泡壁淤血、出血，腎的病理變化主要為腎小管變性壞死（圖9）。

以相同劑量滴鼻點(diǎn)眼和肌注結(jié)合接種15日齡SPF雞。結(jié)果顯示JS96對(duì)于15日齡SPF雞仍然具有一定致病性，但發(fā)病率明顯低于1日齡SPF雞，攻毒的35只雞僅個(gè)別雞癥狀明顯，表現(xiàn)為精神沉郁、羽毛蓬亂、嗜睡和離群等癥狀如圖10a紅色箭頭所指雞。發(fā)病癥狀明顯雞在感染后96和120 h剖檢，發(fā)現(xiàn)發(fā)病雞腎腫大、尿酸鹽沉積，可見“花斑腎”，其中感染120 h雞腎比96 h腎更蒼白，尿酸鹽沉積更加嚴(yán)重，質(zhì)脆易碎。這說明JS96感染120 h左右腎病變最為嚴(yán)重（圖10b、c）。JS96感染15日齡SPF雞，除了導(dǎo)致呼吸道損傷外，還可以導(dǎo)致雞群體重下降，將攻毒后，連續(xù)飼養(yǎng)15 d的所有剩下雞稱重，計(jì)算比較雞只平均體重，發(fā)現(xiàn)JS96攻毒組的雞群平均體重顯著低于對(duì)照組雞群（圖10e），這說明IBV不僅可導(dǎo)致雞群發(fā)病，還會(huì)影響雞群生長。

3 討 論

基于2021年最新S1全長的分類系統(tǒng)將IBV分為GI～GVII 7個(gè)基因型，其中GI有27個(gè)病毒譜系（GI-1～GI-27）［19］。本研究對(duì)本實(shí)驗(yàn)室2014—2022年間從江蘇、山東、廣東廣西等地分離的56株IBV毒株進(jìn)行S1測(cè)序演化分析，結(jié)果顯示我國目前主要流行毒株的基因型包括了GI-1、GI-19、GI-22、GI-23、GⅡ-1、GIV-1、GV-1、GV1-1和變異毒株，其中GI-19 （QX）是優(yōu)勢(shì)基因型，占比約53.57％，此外，GVI呈現(xiàn)流行增多，變異毒不斷涌現(xiàn)趨勢(shì)，需要加強(qiáng)關(guān)注和監(jiān)測(cè)。這些數(shù)據(jù)均說明了當(dāng)下GI-19 （QX-like基因型）已是危害我國養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的主要毒株。這也與Ji等［20］對(duì)2016—2018年從華中地區(qū)各個(gè)養(yǎng)雞場獲得的臨床樣本中分離鑒定了56株IBV毒株，分離株的基因型包括GI-13 （4/91）、GI-7 （TW-I）、GI-24 （Mass）、GI-19 （QX）和GI-18 （LDT3-A）），其中GI-19 （QX）是主要基因型的研究報(bào)道是一致的。除我國外，亞歐地區(qū)多個(gè)國家均有GI-19基因型IBV的流行，包括俄羅斯、哈薩克斯坦和伊朗等［21-23］，這說明GI-19基因型IBV流行株具有較強(qiáng)的傳播能力和廣泛的地域性。亟需對(duì)其基因組特點(diǎn)和生物學(xué)特性進(jìn)行分析研究。本研究選取3株GI-19代表毒株進(jìn)行全基因組測(cè)序分析和致病性進(jìn)行研究。全基因組測(cè)序分析顯示3株IBV分離毒株S1全基因序列與GI-19（QX-like）基因型毒株的相似性在95%左右，具有典型的“花斑腎”致病特點(diǎn)。

Furin酶切位點(diǎn)對(duì)IBV基因型具有一定指征性意義。在536位氨基酸處均具有與QX-like基因型毒株相似的Furin酶切位點(diǎn)HRRRR，這說明GI-19（QX-like）具有典型的Furin酶切位點(diǎn)HRRRR，而通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)GI-1、GI-7和GI-22的Furin酶切位點(diǎn)為HRFRR，GI-13的Furin酶切位點(diǎn)為HRSRR，GI-18的Furin酶切位點(diǎn)為HRLRR，GI-23的Furin酶切位點(diǎn)為HRTRR，GVI-1的Furin酶切位點(diǎn)為HRRKR。

重組分析顯示3株GI-19毒株均存在基因重組事件，這說明基因重組是IBV形成新基因型的重要原因。這與S.W.Thor等研究發(fā)現(xiàn)重組位點(diǎn)廣泛分布于IBV整個(gè)基因組，認(rèn)為基因重組是IBV不斷演化的重要分子機(jī)制之一［24］，以及吳翠蘭等［25］報(bào)道的“當(dāng)S1蛋白發(fā)生基因突變、缺失、插入和重組時(shí)會(huì)導(dǎo)致新的血清型和基因型出現(xiàn)和流行”的觀點(diǎn)是一致的。S1基因的遺傳多樣性非常高，其演化和變異是引起IBV抗原漂移以及基因型和血清型變化的主要原因，因此成為IBV基因分型的靶基因［9］。對(duì)高變區(qū)S1基因序列進(jìn)行了分析，顯示3株毒株與國內(nèi)外疫苗毒株（H120、H52、ArkDPI）和經(jīng)典毒株（M41、Beaudette）作對(duì)比，相似性只有77%左右。Ｅ、Ｍ和Ｎ基因與常用國內(nèi)外疫苗株、經(jīng)典株演化遺傳距離稍遠(yuǎn)，不屬于同一演化分支。并且通過軟件預(yù)測(cè)S蛋白的B細(xì)胞抗原表位，結(jié)果顯示3株分離株與疫苗毒株H120、經(jīng)典毒株M41相比，抗原表位的數(shù)量和序列均不一致，存在一定的差異性。這說明了現(xiàn)有的經(jīng)典疫苗株可能已不適用于當(dāng)下GI-19基因型流行毒株。這也是當(dāng)下IBV疫苗免疫失敗或免疫交叉保護(hù)差的重要原因。需選擇合適疫苗及研發(fā)新型疫苗，才能對(duì)IBV疫病進(jìn)行控制。

GI-19（QX-like）基因型傳染性支氣管炎病毒對(duì)不同日齡SPF雞均具有一定的致病性，本研究通過對(duì)1日齡和15日齡SPF致病性比較研究發(fā)現(xiàn)，JS96對(duì)低日齡致病性更強(qiáng)，這與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［26］。仍然以呼吸道癥狀為主，表現(xiàn)為精神沉郁、打噴嚏、流鼻涕、氣管啰音和呼吸困難［27］，此外還會(huì)損傷腎臟［28］，導(dǎo)致尿酸鹽沉積，嚴(yán)重者出現(xiàn)排白色稀糞。本研究發(fā)現(xiàn)IBV通過上呼吸道感染進(jìn)入機(jī)體，可導(dǎo)致氣管黏液分泌亢進(jìn)、纖毛和黏膜上皮脫落和大量炎性細(xì)胞增生浸潤，可能導(dǎo)致病毒血癥而侵染其他組織器官；肺氣泡壁淤血出血和細(xì)支氣管見炎性物質(zhì)的脫落；腎臟腎小管變性壞死。文獻(xiàn)顯示QX-like基因型IBV還可以導(dǎo)致腎臟腎小管上皮脫落、鹽類晶體沉著以及固有層單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤［16］；輸卵管出現(xiàn)特征性擴(kuò)張和血清樣液體積聚，在擴(kuò)張的輸卵管中，可以看到發(fā)育中的褶皺變平和管壁變薄，上皮層或漿膜層下局灶性單核細(xì)胞浸潤［29］，其他組織器官無明顯的病理變化跡象。此外，作者還發(fā)現(xiàn)該基因型IBV還可導(dǎo)致雞群體重下降、生長遲緩。這說明GI-19 （QX-like基因型）IBV引起雞群發(fā)病且生長遲緩，嚴(yán)重危害我國養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展。

鑒于當(dāng)下流行的QX-like毒株毒力強(qiáng)，傳播地域廣泛，主要免疫原蛋白S與現(xiàn)有疫苗株相似度低，B細(xì)胞表位存在差異和出現(xiàn)基因重組事件的現(xiàn)狀。開發(fā)QX-like適配性更好的新疫苗迫在眉睫。本研究僅選取3株GI-19毒株進(jìn)行致病性研究，選取的毒株為2015和2018年分離毒株可能與近3年同基因型流行毒株致病性具有一定差異，后續(xù)研究將選取近3年毒株與2015和2018年毒株進(jìn)行致病性研究，此外，增加其他生物學(xué)特性比較分析，為IBV的精準(zhǔn)防控提供更可靠的參考。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室2014—2022年分離的IBV毒株進(jìn)行了遺傳演化研究和致病性研究。遺傳演化分析表明，我國主要流行毒株呈現(xiàn)多基因型同時(shí)存在，其中GI-19（QX-like基因型）是我國主要優(yōu)勢(shì)流行毒株，占比達(dá)51.67%。GVI-1次之，其流行呈現(xiàn)增多趨勢(shì)，需重視關(guān)注。挑選的3株GI-19（QX-like）優(yōu)勢(shì)基因型IBV毒株與現(xiàn)有的商品疫苗株的主要免疫原蛋白S相似度低，B細(xì)胞表位差異明顯，流行毒株與疫苗株交叉免疫保護(hù)差；3株分離毒株均存在基因重組事件，這說明IBV基因重組易發(fā)生基因重組，基因重組是導(dǎo)致IBV變異的重要原因之一。致病性研究顯示當(dāng)下流行的GI-19（QX-like）毒株毒力較較強(qiáng)，對(duì)1和15日齡的雞均有致病性，主要以花斑腎和輕度呼吸道癥狀為特征，可導(dǎo)致料肉比下降，嚴(yán)重影響?zhàn)B雞生產(chǎn)性能。本研究掌握IBV基本流行情況，從分子層面闡述了流行優(yōu)勢(shì)毒株與現(xiàn)有疫苗適配性差異，亟需開發(fā)QX-like適配性更好的新疫苗。

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（編輯 白永平）