C8orf4基因編碼蛋白對豬流行性腹瀉病毒體外復(fù)制的抑制效應(yīng)

摘 要： C8orf4，也稱為甲狀腺癌1（thyroid carcinoma 1，TC1），最初是從甲狀腺癌及其周圍正常甲狀腺組織克隆而來，在脊椎動物中普遍表達(dá)，具有跨物種的序列保守性。研究表明，C8orf4在腫瘤中高表達(dá)，參與各種癌細(xì)胞間信息通訊，是一種與癌癥和炎癥有關(guān)的新型調(diào)節(jié)因子，并通過調(diào)節(jié)NF-κB的轉(zhuǎn)錄增強炎癥反應(yīng)，但對病毒的影響知之甚少。為研究C8orf4編碼蛋白對豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）復(fù)制的影響，將PEDV接種于Vero細(xì)胞，通過qRT-PCR和Western blot檢測不同時間點PEDV對C8orf4表達(dá)的影響；設(shè)計并合成表達(dá)C8orf4基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-C8orf44-His和特異性siRNA，通過過表達(dá)和抑制C8orf4表達(dá)，利用qRT-PCR和Western blot檢測C8orf4對PEDV復(fù)制的影響；進(jìn)一步，通過過表達(dá)C8orf4編碼蛋白，明確C8orf4編碼蛋白對PEDV復(fù)制周期各階段的增殖變化。隨著PEDV感染時間的增長，細(xì)胞中C8orf4表達(dá)呈上升趨勢；過表達(dá)C8orf4顯著抑制PEDV復(fù)制，而干擾C8orf4表達(dá)促進(jìn)PEDV復(fù)制，并且C8orf4編碼蛋白主要作用于PEDV復(fù)制周期的生物合成階段。本研究表明C8orf4編碼蛋白具有抑制PEDV復(fù)制的作用，為C8orf4的功能研究提供參考，為抗PEDV復(fù)制機制研究提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： C8orf4；豬流行性腹瀉病毒；抗病毒；復(fù)制

中圖分類號： S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號：0366-6964（2024）05-2100-09

收稿日期：2023-07-23

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2021YFD1801104）；國家自然科學(xué)基金（32272996）

作者簡介：徐 紅（1998-），女，河北邯鄲人，碩士生，主要從事動物腸道冠狀病毒研究，E-mail：1785351662@qq.com

*通信作者：李 彬，主要從事動物腸道病毒研究，Tel：025-84390748，E-mail：libinana@126.com；范寶超，主要從事動物病毒性腹瀉的致病機制及免疫防控研究，E-mail：fanbaochao.0405@163.com

Inhibition Effect of C8orf4 Gene Encoding Protein on in vitro Replication of

Porcine Epidemic Diarrhea Virus

XU" Hong1，2， SHANG" Hongqi2， ZHANG" Xue2， QIAN" Jiali2， WANG" Chuanhong2， SONG" Xu2，

BAO" Meiying2， LIU" Shiyu2， ZHANG" Gege2， GUO" Rongli2， ZHAO" Yongxiang2，

FAN" Baochao2*， LI" Bin1，2*

（1.College of Veterinary Medicine，Hebei Agricultural University， Baoding 071000，" China;

2.Institute of Veterinary Medicine， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014，" China）

Abstract：" C8orf4， also known as thyroid carcinoma 1 （TC1）， was originally cloned from thyroid carcinoma and its surrounding normal thyroid tissue. C8orf4 is universally expressed in vertebrates with sequence conservation across species. Previous studies have shown that C8orf4 is highly expressed in tumors and is involved in various cancer cell communication. It is a novel regulator of cancer and inflammation， and enhances inflammation by regulating NF-κB transcription. However， little is known about the effects of C8orf4 on viruses. This experiment was designed to study the effect of C8orf4 encoding protein on the replication of porcine epidemic diarrhea virus （PEDV）. PEDV was inoculated into Vero cells， and the effect of PEDV on C8orf4 expression was detected by qRT-PCR and Western blot at different time points. The eukaryotic expression vector pcDNA3.1-C8orf4-His and specific siRNA of C8orf4 gene were designed and synthesized. The effect of C8orf4 on PEDV replication was detected by qRT-PCR and Western blot through overexpression and inhibition of C8orf4 expression. Furthermore， the effect of C8orf4 encoding protein on the proliferation of PEDV at each stage of the replication cycle was determined by overexpression of C8orf4 encoding protein. With the extension of virus infection time， the expression of C8orf4 in cells showed an upward trend. Overexpression of C8orf4 significantly inhibited PEDV replication， while interfered with C8orf4 expression to promote PEDV replication， and C8orf4 encoding protein mainly played a role in the biosynthetic phase of PEDV replication cycle. This study proved that C8orf4 encoding protein can inhibit PEDV replication， which provides a reference for the study of the function of C8orf4 and the basis for the study of anti-PEDV replication mechanism.

Key words：" C8orf4; PEDV; anti-virus; replication

*Corresponding authors：LI Bin， E-mail： libinana@126.com; FAN Baochao， E-mail： fanbaochao.0405@163.com

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）屬冠狀病毒屬、α-冠狀病毒科，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒。PEDV基因組大小約28 kb，包括7個開放閱讀框（ORF）：ORF1a、ORF1b和ORF2～ORF6。其中ORF2～ORF6 分別編碼刺突蛋白（S）、非結(jié)構(gòu)蛋白ORF3、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）［1-2］。PEDV可通過糞口傳播引起新生仔豬以急性腹瀉、嘔吐、脫水為特征的高度傳染性腸道疾病，死亡率高達(dá)100%。目前，尚無治療PEDV的特效藥，疫苗接種仍然是預(yù)防和控制PEDV的最有效方法。雖然市場上已有多種商品化疫苗，但效果并不理想。針對PEDV感染，宿主的多種蛋白或因子具有抵抗其感染作用，例如最新發(fā)現(xiàn)的胞苷/尿苷單磷酸激酶2（CMPK2）和前信使核糖核酸加工因子（PRPF19）［3］，但對于PEDV與宿主間的相互作用關(guān)系的了解仍不全面。發(fā)現(xiàn)新的抗病毒復(fù)制宿主因子，對新抗病毒藥物的研發(fā)具有重要的意義。

C8orf4，也稱為甲狀腺癌1（TC1），最初是從甲狀腺癌及其周圍正常甲狀腺組織克隆而來［4-7］，該基因編碼的蛋白是一種促生存蛋白［8］，在脊椎動物中普遍表達(dá)［8］，具有跨物種的序列保守性。研究表明C8orf4編碼蛋白在多種癌癥中高表達(dá)，并與甲狀腺癌［5-6］、肺癌［9-11］、胃癌［12］、結(jié)直腸腺癌［13］等癌癥發(fā)生有關(guān)，C8orf4編碼蛋白具有增強Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)［8，14］，抑制Notch2信號傳導(dǎo)作用［15］，表明其可能參與癌干細(xì)胞自我更新的監(jiān)管［15］；C8orf4編碼蛋白還通過有絲分裂原激活的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）信號通路來促進(jìn)細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)變，在細(xì)胞周期控制以及轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)中起重要作用［16］；C8orf4也是核因子κB（NF-κB）的靶基因，并作為內(nèi)皮炎癥調(diào)節(jié)因子增強NF-κB活性［17］。此外，C8orf4可以通過轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）途徑和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）/腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和成纖維細(xì)胞生長因子受體2（FGFR2）途徑上調(diào)［18］。近期研究發(fā)現(xiàn)C8orf4在新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）、中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）和流感病毒H1N1感染中表達(dá)上升［19］，但是，C8orf4與PEDV感染之間的關(guān)系并不清楚。因此，本研究通過研究C8orf4編碼蛋白對PEDV增殖的影響，為深入研究C8orf4的功能奠定基礎(chǔ)，也為抗病毒藥物設(shè)計提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒、質(zhì)粒

Vero細(xì)胞、PEDV AH2012/12株（GenBank No.：KU646831）、表達(dá)載體pcDNA3.1均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存；表達(dá)C8orf4基因（GenBank No.：NM_001193991.1）的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-C8orf4-His由南京金斯瑞公司合成。

1.2 主要試劑

Trans5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；質(zhì)粒中提試劑盒購自O(shè)mega公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購自Thermo Fisher公司；胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；PEDV-N蛋白鼠單克隆抗體由本實驗室保存；His標(biāo)簽鼠單克隆抗體與GAPDH鼠單克隆抗體均購自Proteintech公司；兔抗C8orf4基因編碼蛋白多抗購自ABclonal公司；RIPA蛋白裂解液和胰酶、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自碧云天生物公司；RNA提取試劑盒Fastpure cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2、5×HiScript Ⅱ qRT SuperMix for qPCR逆轉(zhuǎn)錄酶、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix均購自Vazyme公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)非洲綠猴C8orf4基因序列，設(shè)計擴增其CDS區(qū)域255～575 nt片段的qRT-PCR引物C8orf4-F/R，病毒及內(nèi)參引物PEDV N-F/R和GAPDH-F/R由本實驗室提供；C8orf4的特異性siRNA片段委托Gene Pharma公司設(shè)計并合成。引物及siRNA序列如表1所示。

1.4 PEDV感染對C8orf4表達(dá)的影響

為測定PEDV感染后對C8orf4的影響。將Vero細(xì)胞鋪于24孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，長滿單層后，使用PEDV AH2012/12毒株，以0.1 MOI劑量感染Vero細(xì)胞，并設(shè)置不接種病毒陰性對照組。于接種后6、12和24 h（6、12、24 hpi）分別收取細(xì)胞樣品，用于C8orf4、PEDV N和GAPDH mRNA和編碼蛋白水平的檢測。

1.5 過表達(dá)C8orf4編碼蛋白對PEDV復(fù)制的影響

為測定過表達(dá)C8orf4編碼蛋白對PEDV復(fù)制的影響，待24孔細(xì)胞板中Vero細(xì)胞密度達(dá)70%～80%，采用Lipofectamine 3000分別將pcDNA3.1-C8orf4-His和pcDNA3.1以2 μg·孔-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞，37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h后，使用AH2012/12以0.1 MOI劑量感染細(xì)胞，并設(shè)置pcDNA3.1空載轉(zhuǎn)染組為陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收獲各組細(xì)胞樣品，用于過表達(dá)C8orf4、PEDV N和GAPDH的mRNA和編碼蛋白水平檢測。

1.6 抑制C8orf4表達(dá)對PEDV復(fù)制的影響

由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計并合成C8orf4基因的siRNA（表1）。待24孔細(xì)胞板中Vero細(xì)胞密度達(dá)70%～80%，采用Lipofectamine 3000分別將siC8orf4-1、siC8orf4-2或si-NC，以2×10-5或4×10-5μmol·孔-1劑量轉(zhuǎn)染細(xì)胞，37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h后，收獲各組細(xì)胞樣品，用于C8orf4和GAPDH mRNA和編碼蛋白水平的檢測，篩選出對C8orf4基因抑制效果較好的siRNA。后采用相同的方法進(jìn)行siRNAs轉(zhuǎn)染，使用AH2012/12以0.1 MOI劑量感染細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收獲各組細(xì)胞樣品，用于C8orf4、PEDV N和GAPDH的mRNA和編碼蛋白水平檢測。

1.7 C8orf4編碼蛋白對PEDV復(fù)制周期的影響

前期細(xì)胞鋪板、培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染同“1.5”所描述。

為探究C8orf4編碼蛋白對病毒吸附階段的影響，待細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，PEDV AH2012/12株按照0.5 MOI劑量接種，置于4 ℃作用30 min，使用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞3次后，收取細(xì)胞樣品用于qRT-PCR的測定。

為探究C8orf4編碼蛋白對病毒內(nèi)化階段的影響，待細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，PEDV AH2012/12株按照0.25 MOI劑量接種，置于37 ℃作用1 h，使用無菌PBS清洗細(xì)胞3次后，收取細(xì)胞樣品用于qRT-PCR的測定。

為探究C8orf4編碼蛋白對病毒生物合成階段的影響，待細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，PEDV AH2012/12株按照0.1 MOI劑量接種，后置于37 ℃作用1 h，使用無菌PBS清洗細(xì)胞3次，加入維持液于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后使用無菌PBS清洗細(xì)胞3次，收取細(xì)胞樣品用于qRT-PCR的測定。

1.8 qRT-PCR檢測

細(xì)胞總RNA提取和cDNA合成參照細(xì)胞總RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行，并以cDNA為模板，利用引物C8orf4-F/R、PEDV-N-F/R和GAPDH-F/R，采用染料法qPCR Master Mix試劑檢測C8orf4、PEDV N和GAPDH基因的轉(zhuǎn)錄水平，反應(yīng)體系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上游引物 0.4 μL，下游引物 0.4 μL，cDNA 2 μL，用無菌ddH2O將體系補至20 μL；反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；熔解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。并采用2-ΔΔCt法計算qRT-PCR結(jié)果，利用GraphPad Prism 5軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.9 Western blot檢測

取出24孔細(xì)胞板，每孔加入150 μL蛋白裂解液RIPA（含PMSF），置于4 ℃冰箱裂解15 min，使用細(xì)胞刮板將細(xì)胞刮下，12 000 r·min-1離心5 min，取上清，加入5×Loading buffer，95～100 ℃變性8 min，瞬時離心后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜封閉后分別加入兔抗C8orf4基因編碼蛋白多抗（稀釋度1∶500），小鼠抗PEDV-N蛋白單抗（稀釋度1∶500），小鼠抗His單克隆抗體（1∶5 000）和內(nèi)參抗體GAPDH（稀釋度1∶10 000），置于4 ℃孵育過夜。之后使用PBST緩沖液清洗3次，每次30 min，分別加入HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG（H+L）（稀釋度1∶10 000）和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（稀釋度1∶10 000）室溫孵育1.5 h，用PBST清洗3次，每次30 min，最后在化學(xué)發(fā)光儀上顯色曝光，觀察目的蛋白表達(dá)情況。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行獨立樣本t檢驗分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（x-±sx-）”表示，應(yīng)用GraphPad Prism 6.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。*表示Plt;0.05，**表示Plt;0.01，***表示Plt;0.001，****表示Plt;0.0001。

2 結(jié) 果

2.1 PEDV感染對C8orf4表達(dá)的影響

Vero細(xì)胞接種PEDV（MOI=0.1）后，于6、12和24 hpi分別收取細(xì)胞樣品，檢測C8orf4表達(dá)水平。熒光定量檢測結(jié)果（圖1A）顯示，隨PEDV感染時間的延長，C8orf4 mRNA水平顯著上升；Western blot檢測結(jié)果（圖1B、C）同樣發(fā)現(xiàn)，隨PEDV感染時間的延長，C8orf4編碼蛋白表達(dá)水平顯著上升。上述結(jié)果表明，PEDV感染具有上調(diào)C8orf4表達(dá)的作用。

2.2 過表達(dá)C8orf4編碼蛋白抑制PEDV復(fù)制

采用轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-C8orf4-His過表達(dá)C8orf4編碼蛋白，檢測其對PEDV復(fù)制的影響。通過已建立的PEDV基因拷貝數(shù)檢測方法［20］進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，與空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組相比，過表達(dá)C8orf4編碼蛋白組上清和細(xì)胞中PEDV拷貝數(shù)顯著下降（圖2A）；Western blot結(jié)果顯示，與空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組相比，過表達(dá)C8orf4編碼蛋白組細(xì)胞中PEDV-N蛋白表達(dá)水平顯著下降（圖2B、C）。以上結(jié)果表明過表達(dá)C8orf4編碼蛋白抑制PEDV的復(fù)制。

2.3 干擾C8orf4基因表達(dá)促進(jìn)PEDV的復(fù)制

對C8orf4基因的特異性siC8orf4-1和siC8orf4-2進(jìn)行篩選及最佳劑量摸索。如圖3A～C所示，與siC8orf4-1相比，siC8orf4-2對C8orf4的抑制效果更好，且添加劑量為2×10-5μmol·孔-1時，便抑制了絕大部分C8orf4編碼蛋白的表達(dá)。

隨后，選取siC8orf4-2以2×10-5μmol·孔-1劑量轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后，接種PEDV，于24 hpi收取細(xì)胞樣，進(jìn)行病毒蛋白和基因表達(dá)水平的檢測。結(jié)果顯示，與si-NC組相比，干擾C8orf4表達(dá)后，PEDV-N基因表達(dá)水平顯著升高（圖3D）；Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，干擾C8orf4表達(dá)后，PEDV-N蛋白表達(dá)水平顯著升高（圖3E、F）；以上結(jié)果表明干擾C8orf4表達(dá)可促進(jìn)PEDV的復(fù)制。

綜合上述結(jié)果，C8orf4基因編碼蛋白具有抑制PEDV復(fù)制作用。

2.4 C8orf4編碼蛋白對PEDV復(fù)制周期的影響

為了探索C8orf4編碼蛋白對PEDV復(fù)制周期的影響，通過qRT-PCR檢測C8orf4編碼蛋白過表達(dá)后，病毒在吸附、內(nèi)化、生物合成三個階段的病毒基因組和PEDV-N基因的mRNA水平。結(jié)果顯示（圖4），在病毒的吸附和內(nèi)化階段，過表達(dá)C8orf4編碼蛋白對PEDV基因組RNA水平無顯著影響；但是在病毒后期生物合成階段，過表達(dá)C8orf4編碼蛋白組細(xì)胞中PEDV-N基因mRNA水平顯著降低。這些結(jié)果表明，C8orf4編碼蛋白在PEDV生物合成階段發(fā)揮抑制病毒增殖的功能。

3 討 論

PEDV的持續(xù)變異及廣泛流行，嚴(yán)重威脅全球養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。深入了解PEDV與宿主間的相互作用關(guān)系，將對PEDV致病機制和免疫防控技術(shù)研究提供新的見解和思路。C8orf4作為一種與炎癥有關(guān)的新型調(diào)節(jié)因子，其可通過TGF-β、IL-1β/TNF-α和FGFR2途徑上調(diào)［18］。Nunnari等［19］發(fā)現(xiàn)C8orf4在SARS-CoV-2、MERS-CoV和H1N1感染中表達(dá)上升。在本研究中，作者同樣發(fā)現(xiàn)PEDV感染可顯著上調(diào)C8orf4的表達(dá)，且PEDV感染對TGF-β、IL-1β和TNF-α細(xì)胞因子具有上調(diào)作用［20-21］，病毒感染導(dǎo)致的多種細(xì)胞因子的上調(diào)也許與C8orf4表達(dá)上升相關(guān)。

C8orf4對內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)鍵炎癥基因具有上調(diào)作用［17，22］，C8orf4可通過增強NF-κB核易位和DNA結(jié)合活性，使NF-κB從IκB中釋放并易位細(xì)胞核，以調(diào)節(jié)宿主免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［23-25］，通過調(diào)節(jié)NF-κB轉(zhuǎn)錄來增強關(guān)鍵的炎癥介質(zhì)和炎癥反應(yīng)［17］。針對PEDV，有研究發(fā)現(xiàn)病毒感染會抑制Vero細(xì)胞中TNF-α表達(dá)，并激活NF-κB信號通路［26］，而NF-κB的激活可進(jìn)一步抑制PEDV的復(fù)制［27］。徐新剛等［28］發(fā)現(xiàn)，在感染PEDV的細(xì)胞內(nèi)TRIM56表達(dá)上調(diào)，TRIM56過表達(dá)顯著增加了IRF3和NF-κB P65的磷酸化，增強了IFN-β抗病毒反應(yīng)，TRIM56的過表達(dá)通過正向調(diào)節(jié)TLR3介導(dǎo)的抗病毒信號通路來抑制PEDV復(fù)制。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)PEDV感染會上調(diào)C8orf4的表達(dá)，并且C8orf4編碼蛋白具有抑制病毒復(fù)制能力。因此，作者猜測C8orf4抑制PEDV復(fù)制可能與NF-κB激活有關(guān)，但上調(diào)的C8orf4是否通過對NF-κB的激活，進(jìn)一步發(fā)揮抑制PEDV復(fù)制的作用仍需后續(xù)的研究。

病毒感染宿主細(xì)胞主要包括吸附、內(nèi)化和復(fù)制等環(huán)節(jié)［29］。本研究參考Shan等［30］方法，通過過表達(dá)C8orf4編碼蛋白后接毒，分別檢測病毒感染不同期間的病毒量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)C8orf4編碼蛋白對PEDV的吸附和內(nèi)化無影響，但對病毒的生物合成階段具有顯著的抑制作用。研究已發(fā)現(xiàn)，PEDV可通過p53途徑引起Vero細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，細(xì)胞在G0/G1期的阻滯有利于PEDV的復(fù)制［31］。而C8orf4編碼蛋白可通過調(diào)節(jié)絲裂原激活的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）信號通路來促進(jìn)細(xì)胞周期的G（1）到S相轉(zhuǎn)變，從而在細(xì)胞周期控制以及轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)中起重要作用［17］。C8orf4編碼蛋白對細(xì)胞周期的控制也許是影響PEDV胞內(nèi)生物合成的因素。

4 結(jié) 論

本研究首次研究了C8orf4與PEDV感染間的相互作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PEDV感染顯著上調(diào)C8orf4表達(dá)，而C8orf4編碼蛋白具有抑制PEDV復(fù)制能力，并作用于病毒的生物合成階段。但C8orf4與PEDV復(fù)制間相互作用的內(nèi)在機理仍需深入探究。該研究發(fā)現(xiàn)了一個新的抗PEDV感染的宿主靶點，為進(jìn)一步揭示C8orf4基因編碼蛋白的抗病毒機制奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ KOCHERHANS R， BRIDGEN A， ACKERMANN M， et al. Completion of the porcine epidemic diarrhoea coronavirus （PEDV） genome sequence［J］. Virus Genes， 2001， 23（2）：137-144.

［2］ DUARTE M， GELFI J， LAMBERT P， et al. Genome organization of porcine epidemic diarrhoea virus［J］. Adv Exp Med Biol， 1993， 342：55-60.

［3］ ZHU M J， LV J H， WANG W， et al. CMPK2 is a host restriction factor that inhibits infection of multiple coronaviruses in a cell-intrinsic manner［J］. PLoS Biol， 2023， 21（3）：e3002039.

［4］ ZHOU J Q， KANG X L， XU C J， et al. Construction of decision trees based on gene expression omnibus data to classify bladder cancer and its subtypes［J］. Med Sci Monit， 2021， 27：e929394.

［5］ DE MELO MARTINS P C， JUNIOR O P， HORS C P， et al. C8orf4/TC-1（thyroid cancer-1） gene expression in thyroid cancer and goiter［J］. ORL， 2007， 69（2）：127-130.

［6］ WEI H， PAN L， TAO D Y， et al. Circular RNA circZFR contributes to papillary thyroid cancer cell proliferation and invasion by sponging miR-1261 and facilitating C8orf4 expression［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2018， 503（1）：56-61.

［7］ CHUA E L， YOUNG L， WU W M， et al. Cloning of TC-1 （C8orf4）， a novel gene found to be overexpressed in thyroid cancer［J］. Genomics， 2000， 69（3）：342-347.

［8］ JONES N K， ARAB N T T， EID R， et al. Human thyroid cancer-1 （TC-1） is a vertebrate specific oncogenic protein that protects against copper and pro-apoptotic genes in yeast［J］. Microb Cell， 2015， 2（7）：247-255.

［9］ EVANS I C， BARNES J L， GARNER I M， et al. Epigenetic regulation of cyclooxygenase-2 by C8orf4 in pulmonary fibrosis［J］. Amer J Respir Crit Care Med， 2014， 189：A5571.

［10］ ZHENG Y W， ZHANG L， WANG Y， et al. Thyroid cancer 1 （C8orf4） shows high expression， no mutation and reduced methylation level in lung cancers， and its expression correlates with β-catenin and DNMT1 expression and poor prognosis［J］. Oncotarget， 2017， 8（38）：62880-62890.

［11］ SU K， HUANG L J， LI W H， et al. TC-1 （c8orf4） enhances aggressive biologic behavior in lung cancer through the Wnt/β-catenin pathway［J］. J Surg Res， 2013， 185（1）：255-263.

［12］ KIM B， KOO H， YANG S， et al. TC1（C8orf4） correlates with Wnt/β-catenin target genes and aggressive biological behavior in gastric cancer［J］. Clin Cancer Res， 2006， 12（11）：3541-3548.

［13］ XU H T， LIU Y， LIU S L， et al. TC-1 （C8orf4） expression is correlated with differentiation in ovarian carcinomas and might distinguish metastatic ovarian from metastatic colorectal carcinomas［J］. Virchows Arch， 2013， 462（3）：281-287.

［14］ LAN C， HUAN D W， NIE X C， et al. Association of C8orf4 expression with its methylation status， aberrant β-catenin expression， and the development of cervical squamous cell carcinoma［J］. Medicine （Baltimore）， 2019， 98（31）：e16715.

［15］ ZHU P P， WANG Y Y， DU Y， et al. C8orf4 negatively regulates self-renewal of liver cancer stem cells via suppression of NOTCH2 signalling［J］. Nat Commun， 2015， 6：7122.

［16］ WANG Y D， BIAN G H， LV X Y， et al. TC1 （C8orf4） is involved in ERK1/2 pathway-regulated G G1- to S-phase transition ［J］. BMB Rep， 2008， 41（10）：733-738.

［17］ KIM J， KIM Y， KIM H T， et al. TC1（C8orf4） is a novel endothelial inflammatory regulator enhancing NF-κB activity［J］. J Immunol， 2009， 183（6）：3996-4002.

［18］ FRIEDMAN J B， BRUNSCHWIG E B， PLATZER P， et al. C8orf4 is a transforming growth factor B induced transcript downregulated in metastatic colon cancer［J］. Int J Cancer， 2004， 111（1）：72-75.

［19］ NUNNARI G， SANFILIPPO C， CASTROGIOVANNI P， et al. Network perturbation analysis in human bronchial epithelial cells following SARS-CoV2 infection［J］. Exp Cell Res， 2020， 395（2）：112204.

［20］ FAN B C， PENG Q， SONG S Y， et al. Nonstructural protein 1 of variant PEDV plays a key role in escaping replication restriction by complement C3［J］. J Virol， 2022， 96（18）：e01024-22.

［21］ WANG C Y， YANG S S， HUANG X， et al. TGF-β1 reduces the differentiation of porcine IgA-producing plasma cells by inducing IgM+ B cells apoptosis via Bax/Bcl2-Caspase3 pathway［J］. FASEB J， 2023， 37（10）：e23180.

［22］ PARK J， JUNG Y， KIM J， et al. TC1 （C8orf4） is upregulated by cellular stress and mediates heat shock response［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2007， 360（2）：447-452.

［23］ Israel A. The IKK complex， a central regulator of NF-κB activation［J］. Cold Spring Harb Perspect Biol， 2010， 2（3）：a000158.

［24］ PAHL H L. Activators and target genes of Rel/NF-κB transcription factors［J］. Oncogene， 1999， 18（49）：6853-6866.

［25］ ZHENG H Q， LI C， ZHU X F， et al. miR-615 facilitates porcine epidemic diarrhea virus replication by targeting IRAK1 to inhibit type III interferon expression［J］. Front Microbiol， 2022， 13：1071394.

［26］ KAEWBORISUTH C， KOONPAEW S， SRISUTTHISAMPHAN K， et al. PEDV ORF3 independently regulates IκB kinase β-mediated NF-κB and IFN-β promoter activities［J］. Pathogens， 2020， 9（5）：376.

［27］ ZHENG H Q， XU L， LIU Y Z， et al. MicroRNA-221-5p inhibits porcine epidemic diarrhea virus replication by targeting genomic viral RNA and activating the NF-κB pathway［J］. Int J Mol Sci， 2018， 19（11）：3381.

［28］ XU X G， WANG L X， LIU Y， et al. TRIM56 overexpression restricts porcine epidemic diarrhoea virus replication in Marc-145 cells by enhancing TLR3-TRAF3-mediated IFN-β antiviral response［J］. J Gen Virol， 2022， 103（5）.

［29］ FEHR A R， PERLMAN S. Coronaviruses：an overview of their replication and pathogenesis［J］. Methods Mol Biol， 2015， 1282：1-23.

［30］ SHAN M M， GENTILE M， YEISER J R， et al. Mucus enhances gut homeostasis and oral tolerance by delivering immunoregulatory signals［J］. Science， 2013， 342（6157）：447-453.

［31］ 吳浩陽. PEDV感染對Vero細(xì)胞周期的影響及其機制研究［D］. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2018.

WU H Y. Effect of PEDV infection on Vero cell cycle and its mechanism［D］. Hefei： Anhui Agricultural University， 2018. （in Chinese）

（編輯 白永平）