豬圓環(huán)病毒3型Rep蛋白的原核表達(dá)及酶活性分析

摘 要： Rep蛋白對豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）的復(fù)制具有重要作用。為分析PCV3 Rep蛋白的核酸內(nèi)切酶活性、ATPase活性和解旋酶活性，作者使用鎳親和層析法純化相應(yīng)的重組蛋白，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立Rep蛋白酶活性的測定方法，并探究Rep蛋白關(guān)鍵活性位點(diǎn)。結(jié)果表明，Rep蛋白在體外具有核酸內(nèi)切酶活性、ATPase活性和解旋酶活性。當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?.6 μmol·L-1，Mg2+濃度為1.0 mmol·L-1，37 ℃反應(yīng)75 min時(shí)其ATPase活性達(dá)到最佳。當(dāng)?shù)鞍诐舛葹? μmol·L-1，Mg2+濃度為12.5 mmol·L-1，37 ℃反應(yīng)60 min時(shí)其解旋酶活性達(dá)到最佳。Y89為Rep蛋白核酸內(nèi)切酶活性的關(guān)鍵位點(diǎn)，K173、D210、N250為ATPase活性和解旋酶活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。本研究建立了PCV3 Rep蛋白酶活性分析的方法，初步揭示了該蛋白的主要功能位點(diǎn)，為Rep蛋白的功能研究以及基于Rep蛋白活性的抗病毒藥物研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 豬圓環(huán)病毒3；Rep蛋白；核酸內(nèi)切酶活性；ATPase活性；解旋酶活性

中圖分類號：S852.659.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號：0366-6964（2024）05-2061-11

收稿日期：2023-07-20

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31972658）

作者簡介：韓 陽（1999-），女，安徽天長人，碩士生，主要從事豬圓環(huán)病毒3型蛋白功能的研究，E-mail：hanyang@webmail.hzau.edu.cn

*通信作者：宋云峰，主要從事動物病毒學(xué)以及動物傳染病學(xué)研究，E-mail：syf@mail.hzau.edu.cn

Prokaryotic Expression and Protein Activity of Porcine Circovirus Type 3 Rep

HAN" Yang， GUAN" Shuaiyin， LI" Zhen， ZHOU Saisai， YUAN" Honggen， SONG" Yunfeng*

（College of Veterinary Medicine，Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract：" Rep protein plays an important role in porcine circovirus replication. This study aimed to analyze the endonuclease activity，ATPase activity and helicase activity of porcine circovirus type 3（PCV3）Rep protein. The recombinant proteins were purified by Ni2+ affinity column chromatography. We established an enzymatic activity assay of Rep protein by optimizing the reaction conditions，and the key active site of Rep protein was explored. Our results confirmed that Rep has endonuclease activity、ATPase activity and helicase activity in vitro. Rep protein exhibited optimal ATPase activity in reaction with 1.6 μmol·L-1 Rep and 1 mmol·L-1 Mg2+ at 37 ℃ for 75 min. It exhibited optimal ATPase activity in reaction with 7 μmol·L-1 Rep and 12.5 mmol·L-1 Mg2+ at 37 ℃ for 75 min. Y89 of PCV3 Rep was essential for its endonuclease activity. And K173， D210， N250 sites were essential for its ATPase and helicase activities. In this paper， we developed a method for analysis of the enzyme activity and preliminarily revealed the main functional sites of PCV3 Rep protein，which laid a foundation for the functional study of PCV3 Rep protein and the development of antiviral drugs based on the activity of Rep protein.

Key words： porcine circovirus type 3; Rep; endonuclease activity; ATPase activity; helicase activity

*Corresponding author：" SONG Yunfeng，E-mail：syf@mail.hzau.edu.cn

豬圓環(huán)病毒3型（porcine circovirus type 3，PCV3）屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，于2016年從具有豬皮炎腎病綜合征的患病母豬和其流產(chǎn)胎兒中首次發(fā)現(xiàn)［1］。有研究表明，PCV3感染主要與呼吸系統(tǒng)疾病、生殖系統(tǒng)疾病、胃腸道疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及多系統(tǒng)炎癥有關(guān)［2］。臨床上，PCV3與豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬丁型冠狀病毒（PDCoV）存在混合感染［3-4］。PCV3可在全球范圍內(nèi)傳播，在歐洲［5］、亞洲［6］、北美洲［1］、南美洲［7］均有報(bào)道。我國已有超過20個(gè)省份報(bào)道存在PCV3感染的情況，且陽性率呈不斷上升的趨勢，多以繼發(fā)混合感染為主［8-9］。目前，尚無PCV3的商品化疫苗，導(dǎo)致臨床防控PCV3的難度較大，病毒的蔓延呈逐年上漲趨勢，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了潛在的威脅。

PCV3為單股環(huán)狀DNA病毒，基因組長約2 000 bp，主要包含3個(gè)開放閱讀框（open reading frames，ORFs），其中ORF1是圓環(huán)病毒基因組最保守的區(qū)域，編碼復(fù)制起始的Rep和Rep’蛋白［1］。Rep蛋白的N端包含病毒基因組滾環(huán)復(fù)制過程相關(guān)的標(biāo)志性氨基酸基序即RC-Ⅰ（FTLN）、RC-Ⅱ（HLQ）、RC-Ⅲ（YxxK）。FTLN具有結(jié)構(gòu)作用并可能參與單鏈DNA（ssDNA）的結(jié)合；HLQ的作用是協(xié)調(diào)二價(jià)離子；YxxK具有核酸內(nèi)切酶活性，可在復(fù)制起始區(qū)九核苷酸序列引入一切口并共價(jià)結(jié)合到DNA的5′端［10-11］。有研究證實(shí)，PCV1的Rep蛋白具有核酸內(nèi)切酶活性和ATPase活性，能夠切割并連接病毒ssDNA并在病毒復(fù)制的起始和終止過程中發(fā)揮重要作用［12-13］。在PCV2中Rep蛋白被證實(shí)具有良好的核酸內(nèi)切酶活性、ATPase活性和解旋酶活性［14-16］。而關(guān)于PCV3 Rep蛋白酶活性的研究目前尚未報(bào)道，PCV3與PCV1和PCV2 Rep蛋白的氨基酸相似性均低于50%［17］，這是否會引起PCV3 Rep蛋白活性的差異也尚不清楚。因此，本研究表達(dá)并純化了PCV3 Rep蛋白，通過分析該蛋白核酸內(nèi)切酶活性、ATPase活性和解旋酶活性，以期為PCV3 Rep蛋白功能的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

PCV3陽性病料為本實(shí)驗(yàn)室PCR檢測為陽性并保存。pET-28a載體、pcold-TF載體、TF蛋白由本實(shí)驗(yàn)室保存。DNA提取試劑盒購自上?；萘枭锛夹g(shù)有限公司、2×F8 FastLong PCR MasterMix、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α與BL21（DE3）購自北京擎科生物科技有限公司。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、NdeⅠ、SalⅠ、T4 DNA 連接酶、核酸Marker購自大連寶生物公司，核酸熒光染料購自TOYOBO公司。氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素（Kana）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購自Biosharp公司，瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母浸出物、十二烷基硫酸鈉、咪唑、乙二胺四乙酸（EDTA）等試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，Ni Sepharose 6 Fast Flow購自GE Healthcare。His標(biāo)簽單克隆抗體、鼠源IgG購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 重組質(zhì)粒及其突變體的構(gòu)建及鑒定

以臨床PCV3陽性病料DNA為模板，參考PCV3 KH25/2017毒株（GenBank登錄號：MK934766）的ORF1序列，采用表1中的引物對rep全長基因及截短基因repN（1-101 aa）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：25 μL 2×F8 Mix，上下游引物各2 μL，模板2 μL，19 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 15 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進(jìn)行膠回收。將rep全長基因和pcold-TF載體經(jīng)BamHⅠ、SalⅠ雙酶切后進(jìn)行連接，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pcoldTF-Rep。截短基因repN和pET-28a載體經(jīng)NdeⅠ、BamHⅠ雙酶切后進(jìn)行連接，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-RepN。利用repN基因的上游引物pET28a-RepN-F和突變引物RepN Y89F-R擴(kuò)增repN基因點(diǎn)突變序列，經(jīng)NdeⅠ、BamHⅠ雙酶切后連接到pET-28a載體，命名為pET28a-RepN Y89F。再以pcoldTF-Rep為模板，通過Overlap PCR技術(shù)分別擴(kuò)增rep基因K173A、D210A、N250A突變體全長。將突變的全長片段經(jīng)BamHⅠ、SalⅠ雙酶切后連接到pcold-TF載體上，分別命名為pcoldTF-Rep K173A、pcoldTF-Rep D210A、pcoldTF-Rep N250A。以上質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確后送至北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.3 重組蛋白的原核表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落于含有抗性的LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜。按照1∶100的比例接種菌液到LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)至菌液OD600 nm為0.6～0.8時(shí)加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，于16℃，180 r·min-1搖床上培養(yǎng)16 h。收集菌體超聲破碎，離心后取上清過親和層析柱，250 mmol·L-1咪唑洗脫目的蛋白，使用超濾管濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，以His標(biāo)簽抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，采用Western blot鑒定獲取目的蛋白信號。

1.4 Rep蛋白核酸內(nèi)切酶活性檢測

1.4.1 核酸內(nèi)切酶活性反應(yīng)體系的建立

在北京擎科生物技術(shù)有限公司合成含有PCV3莖環(huán)結(jié)構(gòu)保守的ssDNA底物P15（TAGTATT^ACCCGGCA），切割位點(diǎn)用^表示。蛋白切割底物后，與切割位點(diǎn)后8個(gè)核苷酸的5′磷酸二酯鍵共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致在變性凝膠中電泳遷移率變慢。將RepN蛋白與P15進(jìn)行切割試驗(yàn)，分析核酸內(nèi)切酶活性。反應(yīng)體系中含有20 μmol·L-1蛋白，5 μmol·L-1 P15，20 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 8.0），0.1 mol·L-1 NaCl，2.5 mmol·L-1 MgCl2或MnCl2。37℃孵育30 min后加入5×Loading buffer終止反應(yīng)，95℃煮沸10 min，通過SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)染色觀察切割效果。

1.4.2 底物濃度對核酸內(nèi)切酶活性的影響

將底物P15稀釋至終濃度為：0、1、2、3、4、5、6 μmol·L-1，37℃孵育30 min，SDS-PAGE電泳后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。

1.4.3 時(shí)間對核酸內(nèi)切酶活性的影響

分別在0、15、30、45、60、75、90 min時(shí)向反應(yīng)體系中加入5×Loading buffer終止反應(yīng)，進(jìn)行SDS-PAGE電泳并用考馬斯亮藍(lán)染色。

1.4.4 二價(jià)金屬離子及其濃度對核酸內(nèi)切酶活性的影響

有研究表明，內(nèi)切酶依賴于金屬離子Mg2+，Mn2+的存在，故本試驗(yàn)探究Mg2+或Mn2+的參與對核酸內(nèi)切酶活性的影響，于ssDNA底物之前加入30 mmol·L-1 EDTA以消除二價(jià)金屬離子的干擾。向反應(yīng)體系中分別加入0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5 mmol·L-1的Mg2+或Mn2+，37℃反應(yīng)30 min，SDS-PAGE電泳后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。

1.4.5 底物類型對核酸內(nèi)切酶活性的影響

對底物P15的核苷酸進(jìn)行突變，依次與RepN蛋白進(jìn)行切割反應(yīng)。37℃反應(yīng)30 min，SDS-PAGE電泳后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。

1.4.6 核酸內(nèi)切酶活性位點(diǎn)的探究

對Rep蛋白核酸內(nèi)切酶活性的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行突變，純化突變體蛋白。在切割反應(yīng)體系中分別加入RepN和RepN Y89F蛋白，37℃條件下孵育30 min，SDS-PAGE電泳后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。

1.5 Rep蛋白ATPase活性檢測

1.5.1 ATPase活性反應(yīng)體系的建立

本試驗(yàn)使用Kinase Glo Luminescent Kinase Assay Platform試劑盒測定Rep蛋白的ATPase活性。該試劑盒采用化學(xué)發(fā)光的方法，通過定量激酶反應(yīng)后檢測體系中剩余ATP的含量來反映目的蛋白的活性，所檢測的發(fā)光信號與ATP含量和蛋白活性成負(fù)相關(guān)。反應(yīng)體系如下：20 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 8.0），50 mmol·L-1 NaCl，2 mmol·L-1 MgCl2，100 μmol·L-1 ATP以及1 μmol·L-1的蛋白。

1.5.2 Rep蛋白濃度對ATPase活性的影響

在反應(yīng)體系中加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 μmol·L-1的Rep蛋白和TF標(biāo)簽蛋白，37℃反應(yīng)60 min后，加入等體積的化學(xué)發(fā)光試劑，震蕩混勻，多功能酶標(biāo)儀檢測發(fā)光值。

1.5.3 時(shí)間對ATPase活性的影響

確定最佳蛋白濃度后，將反應(yīng)體系置于37℃分別孵育0、15、30、45、60、75、90 min后檢測化學(xué)發(fā)光值。

1.5.4 二價(jià)金屬離子及其濃度對ATPase活性的影響

向最佳蛋白濃度的反應(yīng)體系中分別加入2 mmol·L-1的二價(jià)金屬離子（Mg2+、Mn2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+），37℃孵育最佳時(shí)間后測定化學(xué)發(fā)光值。

將Mg2+ 梯度稀釋至0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.5、2、3、4、5 mmol·L-1 ，相同條件下測定化學(xué)發(fā)光值。

1.5.5 ATPase活性位點(diǎn)的探究

在ATP水解反應(yīng)體系中分別加入最佳濃度的Rep蛋白，以及突變體蛋白K173A、D210A、N250A，以不加蛋白的樣品為空白對照，37℃孵育最佳時(shí)間，檢測化學(xué)發(fā)光值。

1.6 Rep蛋白解旋酶活性檢測

1.6.1 解旋酶活性反應(yīng)體系的建立

本研究采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer， FRET）的方法檢測蛋白的解旋酶活性。解旋酶底物由上海生工生物工程公司合成（表2），將熒光底物和淬滅底物以1∶1.5比例混合，設(shè)置雙鏈退火程序：95 ℃ 20 min，60 ℃ 10 min，37 ℃ 10 min，20 ℃ 10 min，通過緩慢降溫的方式使其形成雙鏈DNA底物。解旋反應(yīng)體系：200 nmol·L-1熒光底物（F或F′鏈）、240 nmol·L-1 淬滅底物（Q鏈）、3.6 μmol·L-1捕獲鏈（C鏈）、10 mmol·L-1 Mg2+、0.5 mmol·L-1 ATP和5 μmol·L-1蛋白，混勻后用多功能酶標(biāo)儀檢測熒光值。熒光值越高，表明解旋酶活性越好。

1.6.2 Rep蛋白解旋方向的判定

將合成的3′端突出熒光底物F鏈和5′端突出熒光底物F′鏈，分別與Q鏈退火形成雙鏈，于384孔配制解旋反應(yīng)體系，進(jìn)行解旋活性的測定，判斷其解旋活性。

1.6.3 Rep蛋白濃度對解旋酶活性的影響

確定Rep蛋白解旋方向后，選擇相應(yīng)的熒光底物進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。設(shè)置Rep蛋白試驗(yàn)組和TF標(biāo)簽蛋白對照組，進(jìn)行0、1、2、3、4、5、6、7、8 μmol·L-1的蛋白濃度梯度試驗(yàn)，37 ℃孵育60 min，檢測熒光值。

1.6.4 時(shí)間對解旋酶活性的影響

選擇最佳蛋白濃度，配制反應(yīng)體系，37℃條件下進(jìn)行解旋反應(yīng)，每15 min檢測一次熒光值，觀察熒光值變化趨勢。

1.6.5 二價(jià)金屬離子及其濃度對解旋酶活性的影響

在解旋反應(yīng)體系中加入最佳濃度的Rep蛋白，依次與10 mmol·L-1的二價(jià)金屬離子（Mg2+、Mn2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+）于37℃反應(yīng)最佳時(shí)間后檢測熒光值。

將Mg2+ 濃度稀釋至0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20 mmol·L-1 ，相同條件下測定熒光值。

1.6.6 解旋酶活性位點(diǎn)的探究

在最佳解旋反應(yīng)體系下，檢測野生型Rep蛋白與其突變體K173A、D210A、N250A蛋白解旋活性的差異，同時(shí)設(shè)置無蛋白對照組，37℃條件下孵育最佳時(shí)間后檢測熒光值。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒及其突變體的構(gòu)建及鑒定

利用特異性引物擴(kuò)增PCV3 rep全長及其截短基因repN，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，分別可觀察到約891 bp（圖1A）和303 bp（圖1B）的特異性條帶，與預(yù)期片段大小一致。將rep基因構(gòu)建到pcold-TF載體，repN基因構(gòu)建到pET-28a載體。選擇Rep蛋白第173位賴氨酸（Lys）、第210位天冬氨酸（Asp）、第250位天冬酰胺（Asn）進(jìn)行定點(diǎn)突變，以rep基因?yàn)槟０暹M(jìn)行Overlap PCR擴(kuò)增，獲得突變后rep基因全長，大小為891 bp（圖1A）。將三個(gè)突變后的rep基因連接至表達(dá)載體pcold-TF。選擇RepN蛋白第89位酪氨酸（Tyr）進(jìn)行突變，利用引物pET28a-RepN-F和突變引物repN Y89F-R擴(kuò)增截短基因repN點(diǎn)突變序列（圖1B），連接至pET-28a載體。重組質(zhì)粒雙酶切后得到的兩條片段大小均符合預(yù)期（圖1C、D），進(jìn)一步通過測序證實(shí)插入基因的位置、方向以及讀碼框均正確，突變體也均構(gòu)建成功。

2.2 重組蛋白的原核表達(dá)與純化

將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3），對成功表達(dá)在上清的重組蛋白經(jīng)鎳層析柱進(jìn)行純化。利用SDS-PAGE及Western blot檢測純化后的蛋白，結(jié)果顯示，目的蛋白與His標(biāo)簽抗體有良好的結(jié)合性，Rep、Rep K173A、Rep D210A、Rep N250A蛋白大小約為86.6 ku（圖2A、2B），目的蛋白RepN、RepN Y89F大小約為15.9 ku（圖2C、D），均與預(yù)期蛋白大小相符，表明成功純化得到目的蛋白。

2.3 Rep蛋白核酸內(nèi)切酶活性檢測

2.3.1 底物濃度對核酸內(nèi)切酶活性的影響

底物濃度對Rep蛋白核酸內(nèi)切酶活性的影響見圖3A。結(jié)果顯示，隨著底物濃度的增加，形成的共價(jià)化合物增多，其核酸內(nèi)切酶活性升高，說明Rep蛋白以底物濃度依賴的方式進(jìn)行切割。在底物濃度為6 μmol·L-1時(shí)，20 μmol·L-1的Rep蛋白能夠發(fā)揮最佳的核酸內(nèi)切酶活性。

2.3.2 時(shí)間對核酸內(nèi)切酶活性的影響

不同時(shí)間對Rep蛋白核酸內(nèi)切酶活性的影響見圖3B。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Rep在37℃反應(yīng)15min即可完成對底物的切割，之后再增加反應(yīng)時(shí)間對其核酸內(nèi)切酶活性效率影響不明顯。

2.3.3 二價(jià)金屬離子及其濃度對核酸內(nèi)切酶活性的影響

如圖3C、D所示，隨著Mg2+和Mn2+濃度升高，Rep蛋白核酸內(nèi)切酶活性不變。加入離子螯合劑EDTA時(shí)，核酸內(nèi)切酶活性消失，表明Mg2+和Mn2+的存在對Rep蛋白發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性具有決定作用，但濃度對其影響不大。

2.3.4 底物序列對核酸內(nèi)切酶活性的影響

底物序列對Rep蛋白發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性的影響如圖3E所示，Rep蛋白不能切割P15-9，而其余位點(diǎn)不影響Rep蛋白的切割活性。結(jié)果表明Rep蛋白識別的底物序列為5′-TAGTATTAC-3′，其中C9是關(guān)鍵位點(diǎn)。

2.3.5 核酸內(nèi)切酶活性位點(diǎn)的探究

將Rep蛋白和突變體Y89F蛋白進(jìn)行核酸內(nèi)切酶活性驗(yàn)證，如圖3F所示，Y89F突變體不切割底物P15，不具有核酸內(nèi)切酶活性。上述結(jié)果表明Y89位點(diǎn)對Rep蛋白的核酸內(nèi)切酶活性具有重要意義。

2.4 Rep蛋白ATPase活性檢測

2.4.1 Rep蛋白濃度對ATPase活性的影響

Rep蛋白濃度與ATP水解反應(yīng)之間的關(guān)系如圖4A所示，不同濃度的TF蛋白組發(fā)光值均和無蛋白組接近，ATP未被水解。而Rep蛋白組具有較好的ATPase活性，且隨著蛋白濃度升高，ATP的水解量逐漸增加。當(dāng)?shù)鞍诐舛鹊竭_(dá)1.6 μmol·L-1時(shí)，發(fā)光值趨于穩(wěn)定，說明ATP基本水解完全。因此，確定Rep蛋白ATPase活性最佳的蛋白濃度為1.6 μmol·L-1。

2.4.2 時(shí)間對ATPase活性的影響

不同時(shí)間對Rep蛋白ATPase活性的影響見圖3B。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，ATP逐漸水解完全。在0～60 min發(fā)光值下降趨勢明顯，75 min之后趨于穩(wěn)定。因此，選擇75 min作為Rep蛋白ATPase活性測定的最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.4.3 二價(jià)金屬離子及其濃度對ATPase活性的影響

二價(jià)金屬離子對Rep蛋白ATPase 活性的影響如圖4C所示，試驗(yàn)組與不加金屬離子的對照組相比差異顯著。Mg2+、Mn2+、Ca2+對Rep蛋白ATPase活性有促進(jìn)作用，Cu2+和Zn2+對其則產(chǎn)生抑制作用。Rep蛋白對二價(jià)金屬離子的利用率由高到低依次為Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+。

Mg2+是細(xì)胞中ATPase廣泛利用的離子，而ATPase活性也嚴(yán)格依賴Mg2+，作者進(jìn)一步探究Mg2+對Rep蛋白ATPase活性的影響。結(jié)果顯示，Mg2+濃度在0～1.0 mmol·L-1對ATPase活性的促進(jìn)作用增強(qiáng)，且在1.0 mmol·L-1時(shí)促進(jìn)作用達(dá)到峰值。當(dāng)Mg2+濃度高于1.0 mmol·L-1之后開始出現(xiàn)抑制作用（圖4D）。因此，能使Rep蛋白活性達(dá)到最佳的Mg2+反應(yīng)濃度為1.0 mmol·L-1。

2.4.4 ATPase活性位點(diǎn)的探究

為探究Rep蛋白ATPase活性的關(guān)鍵位點(diǎn)，在相同條件下檢測野生型蛋白和突變體蛋白的ATP水解能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入突變體蛋白K173A、D210A、N250A的試驗(yàn)組與未加蛋白的對照組發(fā)光值相近，ATP均未被水解。經(jīng)t檢驗(yàn)分析，Plt;0.000 1，差異顯著，說明突變體蛋白喪失了ATPase活性（圖4E），因此K173A、D210A、N250A為Rep蛋白ATPase活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。

2.5 Rep蛋白解旋酶活性檢測

2.5.1 Rep解旋方向的判定

為研究Rep蛋白是否具有解旋方向性，分別用3′端突出熒光底物和5′端突出熒光底物檢測其解旋活性。上述結(jié)果顯示，Rep蛋白對3′端突出熒光底物具有解旋活性，而對5′端突出熒光底物則不具有解旋活性（圖5A）。TF蛋白作為對照組，對3′和5′端突出熒光底物均不存在解旋活性。由此可判定Rep蛋白具有3′至5′的解旋方向性。

2.5.2 Rep蛋白濃度對解旋酶活性的影響

Rep蛋白濃度對解旋酶活性的影響如圖5B所示。TF蛋白組的熒光值較低，與未加蛋白時(shí)數(shù)值相近，且隨著濃度升高，其熒光值幾乎不變，說明TF蛋白不具有解旋活性。Rep蛋白解旋反應(yīng)速率隨蛋白濃度增加而增強(qiáng)，在蛋白濃度達(dá)到7 μmol·L-1后其解旋活性增長緩慢，故確定最佳蛋白濃度為7 μmol·L-1。

2.5.3 時(shí)間對解旋酶活性的影響

在解旋反應(yīng)體系中加入ATP起始反應(yīng)，在0～90 min每間隔15 min檢測一次熒光值，繪制解旋反應(yīng)時(shí)間曲線。結(jié)果如圖5C所示，在前60 min內(nèi)，熒光值增長較快，60 min后熒光值趨于穩(wěn)定。因此，確定Rep蛋白解旋酶活性測定的最佳反應(yīng)時(shí)間為60 min。

2.5.4 二價(jià)金屬離子及其濃度對解旋酶活性的影響

以3′端突出為解旋底物，研究二價(jià)金屬離子對于解旋酶活性的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖5D所示，Mg2+、Mn2+、Ca2+、Zn2+組的熒光值顯著高于無金屬離子組，Cu2+組與無金屬離子組差異不顯著。整體而言，Ca2+、Zn2+對Rep蛋白解旋活性存在微弱的促進(jìn)作用，Mg2+、Mn2+對Rep蛋白的解旋活性促進(jìn)效果明顯，并且在加入Mg2+時(shí)Rep蛋白解旋能力最強(qiáng)。

為進(jìn)一步確認(rèn)Mg2+對Rep蛋白的解旋功能的影響，作者設(shè)置了Mg2+濃度梯度。結(jié)果顯示，Rep蛋白在Mg2+濃度為12.5 mmol·L-1時(shí)，其解旋酶活性達(dá)到最高，繼續(xù)增加Mg2+濃度則對其解旋酶活性產(chǎn)生一定的抑制作用（圖5E）。

2.5.5 解旋酶活性位點(diǎn)的探究

在解旋反應(yīng)體系中分別加入7 μmol·L-1的Rep蛋白和突變體蛋白K173A、D210A、N250A，于37℃條件下反應(yīng)60 min。結(jié)果如圖5F所示，與野生型蛋白相比，三種突變蛋白的解旋活性均顯著性降低，表明K173、D210、N250是Rep蛋白的關(guān)鍵活性位點(diǎn)。

3 討 論

Rep蛋白是參與病毒滾環(huán)復(fù)制的關(guān)鍵蛋白，通過識別并切割病毒基因組的莖環(huán)結(jié)構(gòu)起始病毒的復(fù)制，其N端是一個(gè)內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)ssDNA的切割和連接；中心是一個(gè)低聚結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)六聚體化；在C端是一個(gè)ATP酶結(jié)構(gòu)域，通過水解ATP供能，解開雙鏈DNA（dsDNA）［18］。Mankertz和Hillenbrand［19］發(fā)現(xiàn)PCV1 Rep蛋白保守基序中的位點(diǎn)發(fā)生突變可有效抑制病毒的復(fù)制。在PCV2中，Rep蛋白與宿主蛋白PARP1相互作用促進(jìn)了病毒基因組的復(fù)制，當(dāng)該蛋白因自然突變導(dǎo)致C端截短后能夠降低病毒的復(fù)制和感染性［20-21］。PCV3 Rep蛋白通過上調(diào)IFN-β和IFN-γ的表達(dá)，調(diào)控宿主先天免疫反應(yīng)［22］?？梢奟ep蛋白在病毒復(fù)制和免疫逃逸中發(fā)揮重要作用，但目前對于PCV3 Rep蛋白的研究相對有限。本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)制備獲得了可溶性的PCV3 Rep重組蛋白，并在體外驗(yàn)證了核酸內(nèi)切酶活性、ATPase活性和解旋酶活性，為抗病毒藥物的篩選提供了理想靶標(biāo)。

連凱琪等［23］使用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的PCV3 Rep蛋白主要以包涵體形式存在，不利于蛋白純化。本研究通過截短獲得了可溶性的Rep蛋白N端蛋白（1—101 aa），使用TF（trigger factor）標(biāo)簽獲得了可溶性的Rep全長蛋白，降低了蛋白的純化難度。TF是一種原核的核糖體結(jié)合伴侶蛋白，能夠促進(jìn)新生肽鏈的共翻譯折疊，具有良好的促溶效果［24-25］?？紤]到標(biāo)簽蛋白較大，對目的蛋白的活性研究可能存在影響，本試驗(yàn)設(shè)置了TF蛋白對照組，檢測并驗(yàn)證了TF標(biāo)簽蛋白不具有ATPase活性和解旋酶活性。

PCV1和PCV2 Rep蛋白在金屬離子的存在下具有良好的核酸內(nèi)切酶活性，在復(fù)制起始區(qū)處具有切割及連接作用［12-15］。本試驗(yàn)使用帶TF標(biāo)簽的Rep全長蛋白未檢測到明顯的核酸內(nèi)切酶活性，因此截短了Rep N端蛋白進(jìn)行核酸內(nèi)切酶活性分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCV3 Rep蛋白在體外也具有核酸內(nèi)切酶活性，表明該蛋白能作為滾環(huán)復(fù)制的啟動蛋白發(fā)揮作用并參與PCV3基因組的復(fù)制起始。核酸內(nèi)切酶活性嚴(yán)格依賴金屬離子的存在，PCV2 Rep蛋白在Mn2+的作用下活性最佳，然而在PCV3和PCV1 Rep蛋白中Mg2+和Mn2+對該活性的影響差異不大［13-14］。在PCV1和PCV2中均證實(shí)了Rep蛋白通過RC-III基序中酪氨酸羥基的親核攻擊作用完成對復(fù)制起始區(qū)九聚核苷酸序列［5′-（T/A）AGTATTAC-3′］的切割［12，18］。本研究構(gòu)建了PCV3 RepN Y89F突變體，第89位酪氨酸突變后核酸內(nèi)切酶活性喪失，這證實(shí)PCV3 Rep蛋白RC-III中的酪氨酸是核酸內(nèi)切酶活性的關(guān)鍵殘基。

解旋酶（helicase）是一種能夠水解雙鏈DNA和RNA底物的蛋白酶，同時(shí)也是核酸依賴的ATP水解酶［26］。Shu等［27］發(fā)現(xiàn)鹽酸胍能夠抑制埃博拉病毒VP35蛋白的NTPase活性和解旋酶活性，從而抑制埃博拉病毒（Ebola virus，EV）的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。本實(shí)驗(yàn)室前期篩選了NS3解旋酶抑制劑，有效抑制了日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）的復(fù)制［28］，證明解旋酶對病毒復(fù)制有重要作用。周旋［29］發(fā)現(xiàn)PCV2 Rep蛋白在體外具有ATPase活性和解旋酶活性，其ATPase活性的最佳金屬離子為2.5 mmol·L-1的Mg2+，解旋酶活性的最佳金屬離子為15 mmol·L-1的Mn2+。本試驗(yàn)通過優(yōu)化條件發(fā)現(xiàn)，PCV3 Rep蛋白在蛋白濃度為1.6 μmol·L-1，Mg2+濃度為1 mmol·L-1，37℃反應(yīng)75 min時(shí)其ATPase活性達(dá)到最佳。進(jìn)一步檢測PCV3 Rep蛋白的解旋活性，結(jié)果顯示Rep蛋白能夠以dsDNA為底物進(jìn)行3′端至5′端的解旋反應(yīng)，其最適蛋白濃度為7 μmol·L-1，最佳金屬離子為12.5 mmol·L-1的Mg2+，最適反應(yīng)時(shí)間為60 min。對比發(fā)現(xiàn)PCV3 Rep蛋白與PCV2 Rep蛋白的解旋方向是一致的，但最佳反應(yīng)條件存在差異［28］。本研究在探究Mg2+濃度對蛋白ATPase活性和解旋酶活性的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)過高的Mg2+濃度會在一定程度上抑制Rep蛋白的活性，這一結(jié)果與王小童［30］對呼吸道合胞病毒P蛋白解旋活性的測定以及Shu等［27］對埃博拉病毒VP35蛋白ATPase活性測定的趨勢相似，說明Mg2+需要在合適的濃度范圍下才能最好的發(fā)揮作用。Tarasova等［18］研究證明，PCV2 Rep突變體的ATPase活性和解旋酶活性，相比野生型Rep均明顯減弱。本試驗(yàn)通過序列比對，將PCV3 Rep的以上位點(diǎn)進(jìn)行突變，得到K173A、D210A、N250A突變體蛋白，并對其酶活性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，PCV3 Rep突變體的ATPase活性和解旋酶活性也均受到抑制，這表明PCV2和PCV3 Rep蛋白的氨基酸同源性雖然較低，但是關(guān)鍵酶活位點(diǎn)是保守的［17-18］。因此，作者推測PCV3 Rep蛋白能夠?yàn)橐种苿┑暮Y選提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究表達(dá)并純化出PCV3 Rep蛋白，首次驗(yàn)證了PCV3 Rep蛋白的核酸內(nèi)切酶活性、ATPase活性和解旋酶活性，建立了Rep蛋白酶活性的方法并且找到了對應(yīng)酶活性的關(guān)鍵位點(diǎn)，為PCV3復(fù)制機(jī)制提供了參考，為抗病毒藥物的研發(fā)提供了靶標(biāo)。

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（編輯 白永平）