CD46基因在家畜抗病育種中的應(yīng)用研究進(jìn)展

摘 要： 補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白46（complement regulator protein，CD46）在大多數(shù)哺乳動(dòng)物的細(xì)胞上廣泛表達(dá)。除了具有補(bǔ)體失活、調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化和生育能力等多種生理功能之外，CD46也可以作為多種細(xì)菌和病毒的受體，尤其對(duì)牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）和經(jīng)典豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）的附著起重要作用。利用基因編輯技術(shù)特異修飾CD46成功生產(chǎn)出抗BVDV活牛犢，證明該基因可以作為抗病育種的候選基因。本文主要對(duì)CD46蛋白在家畜病毒感染中的作用以及在抗病育種中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞： CD46；牛病毒性腹瀉病毒；抗病育種

中圖分類號(hào)：S813.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號(hào)：0366-6964（2024）05-1866-09

收稿日期：2023-11-27

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022YFD1302201）；陜西省畜牧專項(xiàng)（20221086；20230978）；內(nèi)蒙古自治區(qū)揭榜掛帥項(xiàng)目（2022JBGUS0025）

作者簡(jiǎn)介：李劍南（1997-），女，重慶人，博士生，主要從事牛擴(kuò)展多能干細(xì)胞研究，E-mail：lijiannan@nwafu.edu.cn

*通信作者：華進(jìn)聯(lián)，主要從事動(dòng)物干細(xì)胞與生殖細(xì)胞發(fā)育分化調(diào)控的研究，E-mail：jinlianhua@nwsuaf.edu.cn

Progress on the Application of CD46 in Breeding of Livestock for Disease Resistance

LI" Jiannan， YUAN" Liming， HUA" Jinlian*

（Shaanxi Centre of Stem Cells Engineering amp; Technology， College of Veterinary Medicine，

Northwest Aamp;F University， Yangling 712100，" China）

Abstract：" Complement regulatory protein 46 （CD46） is widely expressed in most mammalian cells. In addition to its various physiological functions such as complement inactivation， regulation of T cell activation and fertility， CD46 can also serve as a receptor for various bacteria and viruses. It is especially important for the attachment of bovine viral diarrhea virus （BVDV） and classical swine fever virus （CSFV）. The use of gene editing technology to specifically modify CD46 has successfully produced live calve that can resist BVDV infections， proving that this gene can be used as a candidate gene for disease resistance breeding. This article mainly reviews the role of CD46 protein in livestock virus infection and its application in disease resistance breeding.

Key words： CD46; bovine viral diarrhea virus; disease resistance breeding

*Corresponding author：HUA Jinlian， E-mail：jinlianhua@nwsuaf.edu.cn

病毒必需依賴于宿主細(xì)胞進(jìn)行自我復(fù)制和增殖。病毒增殖過(guò)程分為吸附、穿入、脫殼、生物合成、裝配與釋放5個(gè)階段。如果在病毒吸附宿主細(xì)胞這一階段發(fā)生障礙，則可顯著影響病毒的增殖，且細(xì)胞內(nèi)部的線粒體等細(xì)胞器不會(huì)受到損害。補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白46（complement regulator protein，CD46），在人類上也常被稱為膜輔因子蛋白（membrane cofactor protein，MCP）［1］，是補(bǔ)體活化的調(diào)節(jié)因子。由于CD46是多種細(xì)菌和病毒的受體，所以也被稱為病原體磁鐵［2-3］。這些病原體包括11種人類病原體（6種細(xì)菌和5種病毒），以及黃病毒科，瘟病毒屬的一些成員，如牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）、經(jīng)典豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）和非典型豬瘟病毒（atypical porcine pestivirus，APPV）等［1］。

牛病毒性腹瀉是威脅牛群健康的重要傳染病之一。近期有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)CRISPRs/Cas9基因編輯技術(shù)改變牛CD46的BVDV結(jié)合域在個(gè)體水平具有抗BVDV的作用［4］。因此，研究CD46對(duì)加快抗病育種，提高畜牧業(yè)生產(chǎn)效益具有重要意義。本文主要綜述了CD46的基因結(jié)構(gòu)及其與家畜病毒性疾病感染的關(guān)系，為家畜抗病育種相關(guān)工作研究提供新思路。

1 CD46基因

1986年，Seya等［5］在人單核細(xì)胞樣細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)一種可以切割補(bǔ)體因子C3b和C4b的膜蛋白，其在防止自體補(bǔ)體活化方面起著重要作用，將其命名為MCP。MCP是補(bǔ)體激活調(diào)節(jié)因子（regulators of complement activation，RCA）家族中的跨膜蛋白［6-7］。補(bǔ)體系統(tǒng)是一組由20多種血清蛋白組成的系統(tǒng)，它們?cè)诒┞队谕鈦?lái)抗原時(shí)被激活，在早期針對(duì)病原體啟動(dòng)快速、局部和嚴(yán)格調(diào)節(jié)的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，即先天免疫反應(yīng)［8］。在病毒感染的初始階段，補(bǔ)體可能通過(guò)多種機(jī)制干擾病毒的增殖，包括改變病毒受體的空間位阻以阻止病毒附著、融合和進(jìn)入宿主細(xì)胞。無(wú)論是否存在抗體，C3b和/或C4b蛋白水解片段的調(diào)理作用可以產(chǎn)生炎癥和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，以及誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞聚集、裂解和清除病毒［9］。補(bǔ)體的不適當(dāng)激活可能對(duì)正常宿主細(xì)胞或組織造成潛在損害，因此受到膜結(jié)合蛋白CD35、CD46、CD55和CD59等RCA的嚴(yán)格調(diào)節(jié)，它們參與補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)各個(gè)階段的生理控制［8］。

CD46存在于哺乳動(dòng)物所有的有核細(xì)胞上，除了在補(bǔ)體調(diào)節(jié)中的作用外，CD46還與T細(xì)胞活化、細(xì)胞代謝、增殖和自噬有關(guān)。已被證明CD46功能缺陷會(huì)導(dǎo)致非典型溶血性尿毒癥綜合征等其他疾病，而CD46表達(dá)的上調(diào)在所有癌癥中都有發(fā)現(xiàn)，但上調(diào)程度不同［3］。CD46由4個(gè)補(bǔ)體調(diào)控蛋白（complement control protein，CCP）結(jié)構(gòu)域（也稱短共識(shí)重復(fù)序列（short consensus repeats，SCRs））組成，記為CCP1～CCP4（或SCR1～SCR4），它們具有不同的功能。補(bǔ)體因子C3b和C4b在CCP2、CCP3和CCP4位點(diǎn)結(jié)合［10］。CD46的生理配體主要與細(xì)胞膜近端CCP3和CCP4相互作用，而病原體主要與細(xì)胞膜遠(yuǎn)端CCP1和CCP2相互作用［11］。

根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的數(shù)據(jù)顯示，CD46基因在染色體的位置及mRNA長(zhǎng)度在不同物種中存在差異（表1）。以牛為例，CD46基因位于16號(hào)染色體上，mRNA長(zhǎng)度為3 402 bp，蛋白質(zhì)編碼區(qū)序列（coding sequence，CDS）位于1～1 098 bp。據(jù)研究報(bào)道，在不同物種中，以CD46為受體的病毒及其與CD46的結(jié)合位點(diǎn)也有差異（表1）。

使用Mega7構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，以牛CD46的蛋白質(zhì)序列為根，以人、小鼠、大鼠、牛、豬和綿羊的CD46蛋白序列為外群，進(jìn)行同源性比較。結(jié)果顯示，牛、綿羊和豬的同源性較近，其中牛與綿羊的同源性最高，與小鼠和大鼠的同源性最低（圖1）。使用DNAMAN的Alignment功能將人、小鼠、大鼠、牛、豬和綿羊CD46的CDS及其編碼的氨基酸序列以兩兩比對(duì)的方式進(jìn)行同源性分析。在CDS上，大鼠和小鼠的同源性最高（86.34%），牛和綿羊的同源性次之（83.87%），小鼠和綿羊的同源性最低（51.39%）。在蛋白質(zhì)水平上，大鼠和小鼠的同源性最高（77.93%），牛和綿羊的同源性次之（71.11%），小鼠和牛的同源性最低（37.64%）（圖2）。由此看出，不同物種間CD46基因的同源性存在一定差異。說(shuō)明哺乳動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中不同物種的CD46基因和蛋白出現(xiàn)了較大的差異。

2 家畜病毒與CD46蛋白相互作用研究

病毒通過(guò)與細(xì)胞受體的相互作用來(lái)識(shí)別易感細(xì)胞是成功感染的先決條件［26］。作為病毒的細(xì)胞受體，必須滿足可以與病毒結(jié)合和介導(dǎo)病毒入侵這兩個(gè)要求［27］。多種物質(zhì)可以作為病毒受體，例如碳水化合物、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，通常有多種受體參與病毒進(jìn)入。迄今為止，已有大量研究證明，黃病毒科（Pestivirus）瘟病毒屬（Flaviviridae）病毒的E2囊膜蛋白與宿主細(xì)胞CD46膜蛋白有相互作用。如BVDV進(jìn)入宿主細(xì)胞的主要方式是通過(guò)E2結(jié)合CD46并介導(dǎo)網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞作用［23，26，28-29］。其他瘟病毒屬的成員如CSFV、APPV和類似HoBi的瘟病毒（HoBi-like pestiviruses，HoBiPeV）也被證明進(jìn)入宿主細(xì)胞的過(guò)程與CD46有關(guān)［22，30］。

2.1 BVDV與CD46蛋白的相互作用

BVDV的宿主動(dòng)物種類繁多，包括牛、山羊、綿羊、豬、馬、鹿和駱駝等［31］，其可以造成牛群繁殖力下降，犢牛、羔羊或仔豬的死亡，豬瘟疫苗免疫失敗［32］，給全球養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。BVDV可以感染多種組織，有研究發(fā)現(xiàn)牛黏膜上皮組織、中樞神經(jīng)系統(tǒng)［33-34］、骨髓、外周血、淋巴組織［35］和生殖道［36］的細(xì)胞都能感染BVDV。在感染的晚期，BVDV幾乎存在于所有器官和組織中［37］，這表明該病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞使用了CD46等普遍存在的受體。

2004年，Maurer等［23］用單克隆抗體技術(shù)首次檢測(cè)出牛CD46參與BVDV的吸附和進(jìn)入。他還發(fā)現(xiàn)，人HeLaCD46和鼠LCD46細(xì)胞系可以被BVDV吸附，但病毒無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞。這一結(jié)果可能與CD46的蛋白結(jié)構(gòu)有關(guān)，牛和人/鼠的氨基酸序列同源性較低，人/鼠的CD46蛋白無(wú)法介導(dǎo)BVDV病毒入侵。還有研究發(fā)現(xiàn)，多種BVDV分離株接種CD46敲除MDBK細(xì)胞系后的感染率明顯降低［38］。隨后Krey等［24］發(fā)現(xiàn)，牛的CD46蛋白CCP1結(jié)構(gòu)域中反向平行的β鏈上的兩個(gè)短肽（E66QIV69和G82QVLAL87）對(duì)BVDV結(jié)合和感染至關(guān)重要。將GQVLAL替換為ALPTFS或者將EQIV和GQVLAL這兩個(gè)短肽序列交換，都會(huì)導(dǎo)致牛CD46無(wú)法吸附BVDV，并且如果在豬的CD46 CCP1中添加這兩種牛的短肽，會(huì)使得豬對(duì)BVDV的易感性增加30倍。豬和綿羊?qū)VDV的易感性遠(yuǎn)低于牛，但仍然易感。根據(jù)NCBI上的蛋白質(zhì)序列，豬和綿羊的CD46蛋白都不含EQIV短肽，但綿羊含有GQVLAL這一短肽，說(shuō)明BVDV相較于牛，不容易吸附于豬和綿羊的細(xì)胞，但也許可以通過(guò)吸附其他細(xì)胞受體或者CD46的其他結(jié)構(gòu)域進(jìn)入宿主細(xì)胞。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們對(duì)牛CD46蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有了更直觀的了解，包括各種不同形式的卷曲、轉(zhuǎn)向以及與BVDV結(jié)合位點(diǎn)等情況。2006年，Krey等［24］在人CD46 CCP1和CCP2晶體結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，用瑞士模型對(duì)牛CD46進(jìn)行建模（圖3A）。Aitkenhead等［7］揭示了牛CD46細(xì)胞外區(qū)域的X射線晶體結(jié)構(gòu)（圖3B）。還有研究者用AlphaFold2對(duì)野生型牛CD46細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（G82QVLAL87）進(jìn)行了預(yù)測(cè)（圖3C）［4］。

已知BVDV進(jìn)入宿主細(xì)胞主要有3個(gè)階段。首先是Erns與硫酸乙酰肝素（heparan sulphates，HS）發(fā)生互作［39］，然后E2與CD46結(jié)合，通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，最后在酸性環(huán)境下，內(nèi)吞囊泡和宿主細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)融合，病毒釋放到宿主細(xì)胞質(zhì)中［40］。雖然諸多研究證明CD46是BVDV的細(xì)胞受體，但并未解析它在病毒附著和進(jìn)入過(guò)程中的確切功能。Riedel等［41］使用熒光基團(tuán)-E2標(biāo)記的BVDV顆粒和熒光基團(tuán)-CD46誘導(dǎo)表達(dá)的SK6細(xì)胞系，進(jìn)行了活細(xì)胞成像試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)在添加病毒后20 min，表達(dá)熒光基團(tuán)標(biāo)記的牛CD46在SK6細(xì)胞表面存在定向和擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。與未接種BVDV相比，接種BVDV后細(xì)胞膜上的CD46蛋白定向運(yùn)動(dòng)的速度顯著增加。表明牛CD46的存在影響病毒定向轉(zhuǎn)運(yùn)的速度。如果E2未與CD46結(jié)合，則BVDV難以進(jìn)入細(xì)胞。

2.2 其他瘟病毒與CD46蛋白的相互作用

CSFV是唯一一種選擇性感染豬的瘟病毒，會(huì)導(dǎo)致豬流行性出血熱，具有高度傳染性，對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成威脅，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織確定為法定報(bào)告疾?。?2］。豬CD46是否是CSFV的重要細(xì)胞受體存在爭(zhēng)議。有研究表明，用豬CD46單克隆抗體將PK15和從家豬外周血收集的單核細(xì)胞的CD46受體阻斷后，CSFV的感染陽(yáng)性率只有30%（未處理組感染率接近100%），表明豬CD46是CSFV的重要細(xì)胞受體［20］。另一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，用干擾性小RNA分子將PK15的CD46干擾后，可以顯著抑制CSFV的復(fù)制；并且免疫共沉淀試驗(yàn)證實(shí)CD46與CSFV的E2存在相互作用，激光共聚焦試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD46和E2蛋白在細(xì)胞膜上存在共定位現(xiàn)象；微量熱泳動(dòng)檢測(cè)結(jié)果證明CD46與E2蛋白具有較強(qiáng)的親和力，證明CD46蛋白通過(guò)與E2蛋白相互作用介導(dǎo) CSFV 在細(xì)胞表面的吸附［43］。與此相反的是，另一項(xiàng)研究使用CRISPR/CAS9技術(shù)，在豬CD46 CCP1結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)了引導(dǎo)RNA，獲得豬CD46敲除的SPEV和PK15細(xì)胞系，但敲除細(xì)胞系的CSFV感染率與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異［22］。該作者認(rèn)為豬CD46不是進(jìn)入宿主細(xì)胞的重要決定因素。以上兩個(gè)研究結(jié)果提示，豬CD46在CSFV入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程中起了一定作用，但CSFV與豬CD46的結(jié)合位點(diǎn)可能不在CCP1。APPV與仔豬的健康有關(guān)，在全世界的豬群中高度流行［44］。豬CD46敲除的PK15和SPEV細(xì)胞系感染試驗(yàn)證明豬CD46是APPV的主要受體［22］。

HoBiPeV是2004年首次從一批來(lái)自巴西的胎牛血清中分離出來(lái)［45］，之后在幾個(gè)國(guó)家的健康牛和患病牛中也檢測(cè)到了該病毒。臨床癥狀與BVDV引起的牛病毒性腹瀉病相似，該病毒后來(lái)被歸為Pestivirus H［46］。有研究發(fā)現(xiàn)，牛CD46是HoBiPeV的主要細(xì)胞進(jìn)入因子，CD46敲除的MDBK細(xì)胞系中HoBiPeV感染陽(yáng)性率低于1%［30］。

邊境病病毒（border disease virus，BDV）主要感染綿羊和山羊，牛［47］和豬［48］也易感，不同物種間可以相互傳播。2013至2015年，中國(guó)相繼從山羊群［49］、綿羊群［50］和仔豬［51］中分離出BDV，但沒(méi)有從牛上分離出BDV的報(bào)道?？赡苡捎贐DV感染牛后的臨床病程與BVDV感染的臨床病程相似［47］，有些BDV感染被當(dāng)作BVDV感染處理。國(guó)外出現(xiàn)多個(gè)經(jīng)ELISA檢測(cè)呈BVDV陽(yáng)性，但RT-PCR鑒定為BDV的病例［52］。由于幾乎所有的BDV分離株在細(xì)胞培養(yǎng)中都是非細(xì)胞致病性的［53］，鮮見(jiàn)急性病程，多為流產(chǎn)、不孕、生產(chǎn)弱羔等生產(chǎn)性疾病，也有公牛持續(xù)感染BDV后發(fā)生睪丸變性和萎縮［52］。還有研究表明，豬感染BDV后4～14 d內(nèi)出現(xiàn)病毒血癥，但沒(méi)有出現(xiàn)臨床癥狀和病理變化。值得注意的是，BDV的感染會(huì)使豬對(duì)CSFV疫苗接種的抗體反應(yīng)下調(diào)。初次接種疫苗后CSFV抗體特異性和中和抗體滴度均為陰性，即使在加強(qiáng)疫苗接種后，這兩個(gè)指標(biāo)仍然顯著低于未感染BDV組［51］。如今對(duì)該病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的機(jī)制研究較少，用NCBI比對(duì)BVDV和BDV E2蛋白的氨基酸序列，同源性為54%，有極大可能BDV的宿主受體也是CD46，值得進(jìn)一步研究。

3 CD46基因在抗病育種中的研究

BVDV對(duì)牛群危害巨大，且目前針對(duì)BVDV的疫苗免疫達(dá)不到理想效果。由于該病毒各型之間存在抗原性差異，即使機(jī)體針對(duì)某個(gè)基因型的疫苗產(chǎn)生了抗體，也不能抵御其他基因型病毒的侵染。目前，我國(guó)流行的BVDV和CSFV野毒株在E2抗原基因上均存在較大的變異現(xiàn)象，E2蛋白結(jié)構(gòu)的改變尤其是在抗原表位上的改變，都可使病毒逃脫抗體對(duì)其的清除，是防治持續(xù)性感染的主要困難之一［54］。前人的研究表明，牛CD46是多種BVDV毒株的細(xì)胞受體，包括一些臨床分離的未經(jīng)細(xì)胞水平檢驗(yàn)的毒株［24，55］。由此可見(jiàn)，通過(guò)基因編輯CD46產(chǎn)生具有抗BVDV性狀的牛具有良好的前景。

2023年，Workman等［4］使用CRISPR介導(dǎo)的同源性定向修復(fù)和體細(xì)胞核移植技術(shù)產(chǎn)生1頭抗BVDV的活犢牛。該牛CD46基因的BVDV結(jié)合結(jié)構(gòu)域中有6個(gè)氨基酸被替換（G82QVLAL87替換為A82LPTFS87）。研究稱該牛能正常存活至少20個(gè)月，首次證明了牛CD46基因中A82LPTFS87的替代可能不會(huì)對(duì)出生前或出生后的發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響。

他們對(duì)該犢牛進(jìn)行了全基因組測(cè)序，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)脫靶。而后從該犢牛分離皮膚成纖維細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，進(jìn)行了11個(gè)BVDV毒株的體外攻毒試驗(yàn)。各個(gè)毒株對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞的感染效率平均降低了96%（范圍88%～99%），對(duì)淋巴細(xì)胞的易感性平均降低了96%（范圍84%～100%），單核細(xì)胞對(duì)BVDV的易感性顯著降低，RNA水平平均減少163倍（范圍7～446倍）［4］。之后該團(tuán)隊(duì)在該牛10月齡的時(shí)候進(jìn)行了BVDV自然感染試驗(yàn)。使其以及1頭野生型CD46荷斯坦牛與1頭自然持續(xù)感染BVDV（基因型1b）的犢牛共處7 d。兩只試驗(yàn)牛都出現(xiàn)了發(fā)燒和外周血白細(xì)胞減少的癥狀，但只有野生型牛表現(xiàn)出咳嗽、鼻炎和鼻孔周圍發(fā)紅等其他感染跡象。通過(guò)全血RT-qPCR測(cè)量，在野生型牛中檢測(cè)到BVDV病毒血癥，并持續(xù)28 d，但BVDV的RNA僅有3 d能在CD46編輯牛的全血中檢測(cè)到，并且病毒RNA載量峰值顯著降低。此外，從CD46編輯牛中分離的外周血單核細(xì)胞在整個(gè)過(guò)程中未感染BVDV，而來(lái)自野生型牛的外周血單核細(xì)胞在12 d內(nèi)為BVDV RNA檢測(cè)陽(yáng)性［4］。該團(tuán)隊(duì)從體外和體內(nèi)都證明了CD46基因G82QVLAL87的替換可以有效抵御BVDV的侵染。

值得注意的是，和其他病毒一樣，BVDV具有多個(gè)宿主細(xì)胞受體。除CD46以外，還有HS［39］，低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）［56］和ADAM17［26］。有研究發(fā)現(xiàn)，雖然用CRISPR/Cas9 核糖核蛋白復(fù)合物介導(dǎo)的編輯方法獲得的CD46（E66QIV69和G82QVLAL87）敲除MDBK細(xì)胞系能抵抗BVDV的初次感染，但進(jìn)一步傳代后，感染率顯著上升，將BVDV測(cè)序發(fā)現(xiàn)，病毒基因組發(fā)生改變，通過(guò)增加與HS的結(jié)合來(lái)補(bǔ)償不能與CD46受體結(jié)合［38］。除此之外，雖然BVDV主要通過(guò)E1-E2二聚體結(jié)合細(xì)胞受體CD46并介導(dǎo)網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞作用的方式入侵宿主細(xì)胞，但有研究證明在CD46受體被中和的情況下，BVDV可以通過(guò)直接細(xì)胞間傳播的方式從感染細(xì)胞進(jìn)入未感染細(xì)胞［57］。雖然現(xiàn)在通過(guò)編輯CD46生產(chǎn)的第一頭抗BVDV牛已經(jīng)出生，且初步檢測(cè)證明在細(xì)胞水平具有抗多種BVDV的效果，個(gè)體水平具有抵抗來(lái)自持續(xù)感染BVDV牛傳播的非細(xì)胞病變毒株的能力。但仍需要更長(zhǎng)時(shí)間的觀察以及更多方式的檢驗(yàn)。檢驗(yàn)后代是否仍具有抗BVDV的能力？個(gè)體對(duì)細(xì)胞病變型BVDV的易感性如何？已知CD46在精子的頂體外膜表達(dá)［58］，A82LPTFS87的替代是否會(huì)對(duì)授精有負(fù)面影響？

已經(jīng)清楚BVDV能侵染牛單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制，影響天然免疫和特異性免疫，嚴(yán)重阻礙機(jī)體對(duì)病毒的清除［59-60］。如果E66QIV69和G82QVLAL87的敲除或替換可以有效阻礙BVDV吸附并進(jìn)入普通細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，將在機(jī)體病毒載量不會(huì)有大量增加的同時(shí)，極大的有利于免疫細(xì)胞對(duì)病毒的清除。

4 總結(jié)與展望

首先，CD46是一個(gè)可以選擇的抗瘟病毒育種的重要靶標(biāo)，多種瘟病毒間可以多物種交叉感染，且CD46是一個(gè)共有的受體蛋白，修飾一個(gè)基因可以達(dá)到抵抗多種疫病的作用。但是CD46具有多種重要的生理功能，進(jìn)行隨機(jī)敲除可能產(chǎn)生生理缺陷，不能獲得健康的動(dòng)物個(gè)體。其次，病原體主要與CD46的CCP1和CCP2相互作用，基于現(xiàn)在可以從分子水平上對(duì)某單個(gè)或多個(gè)氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)修飾的基因編輯技術(shù)，如果發(fā)現(xiàn)病毒的特定結(jié)合域，就可以在不影響CD46基因其他功能的情況下生產(chǎn)具有特定抗病性能的家畜。但目前僅牛CD46蛋白BVDV的精準(zhǔn)結(jié)合位點(diǎn)已被解析，由于種間CD46蛋白結(jié)構(gòu)具有一定差異，BVDV的豬和綿羊CD46精準(zhǔn)靶點(diǎn)，以及其他瘟病毒在各物種CD46的特定結(jié)合區(qū)域尚有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。最后，病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的途徑多，機(jī)制復(fù)雜，且變異能力強(qiáng)，瘟病毒的受體蛋白有待進(jìn)一步研究與驗(yàn)證。通過(guò)多基因編輯改變宿主細(xì)胞上多個(gè)瘟病毒受體蛋白的結(jié)構(gòu)也許是一種可以選擇的方式，進(jìn)一步結(jié)合高通量篩選評(píng)估，篩選能有效編輯的干細(xì)胞株，結(jié)合細(xì)胞核移植技術(shù)，定向培育能高繁殖率抗病的優(yōu)質(zhì)種家畜，加快精準(zhǔn)育種進(jìn)程。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ LISZEWSKI M K，ATKINSON J P.Complement regulator CD46：genetic variants and disease associations［J］.Hum Genomics， 2015，9（1）：7.

［2］ CATTANEO R.Four viruses，two bacteria，and one receptor：membrane cofactor protein （CD46） as pathogens’ magnet［J］.J Virol，2004，78（9）：4385-4388.

［3］ LISZEWSKI M K，ATKINSON J P.Membrane cofactor protein （MCP;CD46）：deficiency states and pathogen connections［J］. Curr Opin Immunol，2021，72：126-134.

［4］ WORKMAN A M，HEATON M P，VANDER LEY B L，et al.First gene-edited calf with reduced susceptibility to a major viral pathogen［J］.PNAS Nexus，2023，2（5）：pgad125.

［5］ SEYA T，TURNER J R，ATKINSON J P.Purification and characterization of a membrane protein （gp45-70） that is a cofactor for cleavage of C3b and C4b［J］.J Exp Med，1986，163（4）：837-855.

［6］ LISZEWSKI M K，POST T W，ATKINSON J P.Membrane cofactor protein （MCP or CD46）：newest member of the regulators of complement activation gene cluster［J］.Annu Rev Immunol，1991，9：431-455.

［7］ AITKENHEAD H，STUART D I，EL OMARI K.Structure of bovine CD46 ectodomain［J］.Viruses，2023，15（7）：1424.

［8］ BISWAS M，JOHNSON J B，KUMAR S R P，et al.Incorporation of host complement regulatory proteins into newcastle disease virus enhances complement evasion［J］.J Virol，2012，86（23）：12708-12716.

［9］ BLUE C E，SPILLER O B，BLACKBOURN D J.The relevance of complement to virus biology［J］.Virology， 2004， 319（2）：176-184.

［10］ IWATA K，SEYA T，YANAGI Y，et al.Diversity of sites for measles virus binding and for inactivation of complement C3b and C4b on membrane cofactor protein CD46［J］.J Biol Chem，1995，270（25）：15148-15152.

［11］ PERSSON B D，SCHMITZ N B，SANTIAGO C，et al.Structure of the extracellular portion of CD46 provides insights into its interactions with complement proteins and pathogens［J］.PLoS Pathog，2010，6（9）：e1001122.

［12］ NANICHE D，VARIOR-KRISHNAN G，CERVONI F，et al.Human membrane cofactor protein （CD46） acts as a cellular receptor for measles virus［J］.J Virol，1993，67（10）：6025-6032.

［13］ MANCHESTER M，VALSAMAKIS A，KAUFMAN R，et al.Measles virus and C3 binding sites are distinct on membrane cofactor protein （CD46）［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1995，92（13）：2303-2307.

［14］ SANTORO F，KENNEDY P E，LOCATELLI G，et al.CD46 is a cellular receptor for human herpesvirus 6［J］.Cell，1999， 99（7）：817-827.

［15］ MORI Y，SEYA T，HUANG H L，et al.Human Herpesvirus 6 variant A but not variant B induces fusion from without in a variety of human cells through a Human Herpesvirus 6 entry receptor，CD46［J］.J Virol，2002，76（13）：6750-6761.

［16］ PARSONS A J，STEIN K R，ATANASOFF K E，et al.The CD46 ectodomain participates in human cytomegalovirus infection of epithelial cells［J］.J Gen Virol，2023，104（9）：001892.

［17］ HEMSATH J R，LIACI A M，RUBIN J D，et al.Ex vivo and in vivo CD46 receptor utilization by species D human adenovirus serotype 26 （HAdV26）［J］.J Virol，2022，96（3）：e0082621.

［18］ EFFANTIN G，HOGRAINDLEUR M A，F(xiàn)ENEL D，et al.Toward the understanding of DSG2 and CD46 interaction with HAdV-11 fiber，a super-complex analysis［J］.J Virol，2023，97（11）：e0091023.

［19］ SEGERMAN A，ATKINSON J P，MARTTILA M，et al.Adenovirus type 11 uses CD46 as a cellular receptor［J］.J Virol，2003， 77（17）：9183-9191.

［20］ DRGER C，BEER M，BLOME S.Porcine complement regulatory protein CD46 and heparan sulfates are the major factors for classical swine fever virus attachment in vitro［J］.Arch Virol，2015，160（3）：739-746.

［21］ LAMOTHE-REYES Y，F(xiàn)IGUEROA M，SNCHEZ O.Host cell factors involved in classical swine fever virus entry［J］.Vet Res，2023，54（21）：115.

［22］ CAGATAY G N，ANTOS A，SUCKSTORFF O，et al.Porcine complement regulatory protein CD46 is a major receptor for atypical porcine pestivirus but not for classical swine fever virus［J］.J Virol，2021，95（9）：e02186-20.

［23］ MAURER K，KREY T，MOENNIG V，et al.CD46 is a cellular receptor for bovine viral diarrhea virus［J］.J Virol，2004，78（4）： 1792-1799.

［24］ KREY T，HIMMELREICH A，HEIMANN M，et al.Function of bovine CD46 as a cellular receptor for bovine viral diarrhea virus is determined by complement control protein 1［J］.J Virol，2006，80（8）：3912-3922.

［25］ ZEZAFOUN H，DECREUX A，DESMECHT D.Genetic and splice variations of Bos taurus CD46 shift cell permissivity to BVDV，the bovine pestivirus［J］.Vet Microbiol，2011，152（3-4）：315-327.

［26］ QI S H，WO L，SUN C，et al.Host cell receptors implicated in the cellular tropism of BVDV［J］.Viruses，2022，14（10）：2302.

［27］ TARDIEU M，EPSTEIN R L，WEINER H L.Interaction of viruses with cell surface receptors［J］.Int Rev Cytol，1982，80： 27-61.

［28］ LIANG D L，SAINZ I F，ANSARI I H，et al.The envelope glycoprotein E2 is a determinant of cell culture tropism in ruminant pestiviruses［J］.J Gen Virol，2003，84（5）：1269-1274.

［29］ BORCA M V，HOLINKA L G，RAMIREZ-MEDINA E，et al.Identification of structural glycoprotein E2 domain critical to mediate replication of Classical Swine Fever Virus in SK6 cells［J］.Virology，2019，526：38-44.

［30］ LEVERINGHAUS E，CAGATAY G，HARDT J，et al.Different impact of bovine complement regulatory protein 46 （CD46bov） as a cellular receptor for members of the species Pestivirus H and Pestivirus G［J］.Emerg Microbes Infect，2022，11（1）：60-72.

［31］ 趙玉賓.新疆南疆地區(qū)馬鹿感染BVDV流行病學(xué)調(diào)查［D］.阿拉爾：塔里木大學(xué)，2021.

ZHAO Y B.Epidemiological investigation of BVDV infection in red deer in southern Xinjiang［D］.Alaer：Tarim University， 2021.（in Chinese）

［32］ 鄒 宏，夏應(yīng)菊，李 玲，等.豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法的建立和初步應(yīng)用［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2023，54（10）：4422-4427.

ZOU H，XIA Y J，LI L，et al.Establishment and preliminary application of a dual real-time RT-PCR assay for CSFV and BVDV［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2023，54（10）：4422-4427.（in Chinese）

［33］ HEWICKER-TRAUTWEIN M，TRAUTWEIN G，MOENNIG V，et al.Infection of ovine fetal brain cell cultures with cytopathogenic and non-cytopathogenic bovine viral diarrhoea virus［J］.Vet Microbiol，1992，33（1-4）：239-248.

［34］ GALLINA L，KOCH M C，GENTILE A，et al.Bovine viral diarrhoea virus 1b infection associated with congenital tremor and hypomyelination in Holstein calves［J］.Vet Microbiol，2021，256：109047.

［35］ MARSHALL D J，MOXLEY R A，KELLING C L.Distribution of virus and viral antigen in specific pathogen-free calves following inoculation with noncytopathic bovine viral diarrhea virus［J］.Vet Pathol，1996，33（36）：311-318.

［36］ FRAY M D，MANN G E，CLARKE M C，et al.Bovine viral diarrhoea virus：its effects on ovarian function in the cow［J］.Vet Microbiol，2000，77（1-2）：185-194.

［37］ LIEBLER-TENORIO E M，GREISER-WILKE I，POHLENZ J F.Organ and tissue distribution of the antigen of the cytopathogenic bovine virus diarrhea virus in the early and advanced phase of experimental mucosal disease［J］.Arch Virol，1997， 142（8）：1613-1634.

［38］ SZILLAT K P，KOETHE S，WERNIKE K，et al.A CRISPR/Cas9 generated bovine CD46-knockout cell line-A tool to elucidate the adaptability of bovine viral diarrhea viruses （BVDV）［J］.Viruses，2020，12（8）：859.

［39］ IQBAL M，F(xiàn)LICK-SMITH H，MCCAULEY J W.Interactions of bovine viral diarrhoea virus glycoprotein E（rns） with cell surface glycosaminoglycans［J］.J Gen Virol，2000，81（2）：451-459.

［40］ LECOT S，BELOUZARD S，DUBUISSON J，et al.Bovine viral diarrhea virus entry is dependent on clathrin-mediated endocytosis［J］.J Virol，2005，79（16）：10826-10829.

［41］ RIEDEL C，CHEN H W，REICHART U，et al.Real time analysis of bovine viral diarrhea virus （BVDV） infection and its dependence on bovine CD46［J］.Viruses，2020，12（1）：116.

［42］ MOENNIG V.Introduction to classical swine fever：virus，disease and control policy［J］.Vet Microbiol，2000，73（2-3）：93-102.

［43］ 王文靜.CD46蛋白介導(dǎo)豬瘟病毒感染的機(jī)制研究［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2019.

WANG W J.The mechanism of porcine CD46 protein in classical swine fever virus infection［D］.Yangling：Northwest Aamp;F University，2019.（in Chinese）

［44］ POSTEL A，BECHER P，HAAS L，et al.The newly discovered \"atypical porcine pestivirus\" （APPV）：An old player in the \"shaking piglets\" disease complex？［J］.Tierarztl Prax Ausg G Grosstiere Nutztiere，2018，46（4）：261-270.（in German）

［45］ SCHIRRMEIER H，STREBELOW G，DEPNER K，et al.Genetic and antigenic characterization of an atypical pestivirus isolate，a putative member of a novel pestivirus species［J］.J Gen Virol，2004，85（12）：3647-3652.

［46］ SMITH D B，MEYERS G，BUKH J，et al.Proposed revision to the taxonomy of the genus Pestivirus，family Flaviviridae［J］.J Gen Virol，2017，98（8）：2106-2112.

［47］ BRAUN U，HILBE M，PETERHANS E，et al.Border disease in cattle［J］.Vet J，2019，246：12-20.

［48］ CABEZN O，VELARDE R，ROSELL R，et al.Experimental infection of lambs with Border disease virus isolated from a Pyrenean chamois［J］.Vet Rec，2010，167（16）：619-621.

［49］ LI W，MAO L，ZHAO Y，et al.Detection of border disease virus （BDV） in goat herds suffering diarrhea in eastern China［J］. Virol J， 2013，10（50）：80.

［50］ MAO L，LIU X，LI W L，et al.Characterization of one sheep border disease virus in China［J］.Virol J，2015，12：15.

［51］ MAO L，LI W L，LIU X，et al.Chinese border disease virus strain JSLS12-01 infects piglets and down-regulates the antibody responses of classical swine fever virus C strain vaccination［J］.Vaccine，2015，33（32）：3918-3922.

［52］ MCFADDEN A M J，TISDALL D J，HILL F I，et al.The first case of a bull persistently infected with Border disease virus in New Zealand［J］.N Z Vet J，2012，60（5）：290-296.

［53］ NETTLETON P F，GILRAY J A，RUSSO P，et al.Border disease of sheep and goats［J］.Vet Res，1998，29（3-4）：327-340.

［54］ 任 艷.牛病毒性腹瀉病毒囊膜蛋白E2與牛胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制研究［D］.石河子：石河子大學(xué)，2010.

REN Y.Molecular mechanism of Bovine viral diarrhea virus envelope protein E2 interact with bovine trophoblast cells［D］. Shihezi：Shihezi University，2010.（in Chinese）

［55］ SCHELP C，GREISER-WILKE I，WOLF G，et al.Identification of cell membrane proteins linked to susceptibility to bovine viral diarrhoea virus infection［J］.Arch Virol，1995，140（11）：1997-2009.

［56］ AGNELLO V，ABEL G，ELFAHAL M，et al.Hepatitis C virus and other flaviviridae viruses enter cells via low density lipoprotein receptor［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1999，96（22）：12766-12771.

［57］ MERWAISS F，CZIBENER C，ALVAREZ D E.Cell-to-cell transmission is the main mechanism supporting bovine viral diarrhea virus spread in cell culture［J］.J Virol，2019，93（3）：e01776-18.

［58］ JANKOVICOVA J，ANTALIKOVA J，SIMON M，et al.Comparative fluorescence analysis of the bovine sperm using IVA-520 （anti-CD46 antibody） and lectins：probable localisation of CD46 on bovine sperm membrane［J］.Gen Physiol Biophys，2011，30：S70-S76.

［59］ RAJPUT M K，DARWEESH M F，PARK K，et al.The effect of bovine viral diarrhea virus （BVDV） strains on bovine monocyte-derived dendritic cells （Mo-DC） phenotype and capacity to produce BVDV［J］.Virol J，2014，11：44.

［60］ LEE S R，NANDURI B，PHARR G T，et al.Bovine viral diarrhea virus infection affects the expression of proteins related to professional antigen presentation in bovine monocytes［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1794（1）：14-22.

（編輯 郭云雁）