產(chǎn)單核細胞李氏桿菌噬菌體的應用研究進展

摘 要： 產(chǎn)單核細胞李氏桿菌是一種常見的食源性致病菌，其致死率高達30％。該菌能夠在高鹽度、高酸度和冷藏溫度等極端條件下存活和增殖，對人畜健康構(gòu)成了重大威脅。然而抗生素的濫用導致藥物殘留和多重耐藥性等問題的出現(xiàn)，從而使得李氏桿菌病的防治異常困難。噬菌體相關生物制劑的發(fā)展為解決以上問題提供了可行方案。本文綜述了李氏桿菌噬菌體在食品保鮮、生物檢測、基因工程等方面的應用，同時還探討了噬菌體與宿主之間的互作機制，旨在為李氏桿菌噬菌體在食品污染防控中提供一定的理論依據(jù)。

關鍵詞： 李氏桿菌；噬菌體；食品污染；生物檢測

中圖分類號： S852.61

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）05-1819-08

收稿日期：2023-09-04

基金項目：國家自然科學基金（32060822；31960726；31560700）；國家重點研發(fā)計劃（2019YFC1605705）

作者簡介：崇 倩（2000-），女，藏族，甘肅永靖人，碩士生，主要從事李氏桿菌噬菌體分離鑒定研究，E-mail： 1801638664@qq.com

*通信作者：茍惠天，主要從事食源性疾病的診斷及防控研究，E-mail： gouht@gsau.edu.cn

Research Progress of Applied Research on Listeria monocytogenes Phage

CHONG" Qian， ZHAO" Xuehui， CAO" Qing， XUE Huiwen， GOU" Huitian*

（College of Veterinary Medicine of Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070，" China）

Abstract："" Listeria monocytogenes being a common foodborne pathogen. Food contaminated with this bacterial can cause listeriosis， with clinical manifestations of sepsis and meningitis， and mortality be up to 30%. Listeria monocytogenes can survive under extreme condition such as high salinity， high acidity， and low temperature， so posing a significant threat to the human and animal health. At present， the main method of preventing and treating this disease is the use of antibiotics. However， the multiple drug resistance making the prevention and treatment of listeriosis extraordinarily difficult. The development of phage and related biological agents provides feasible solutions to solve the above problem. This article reviews the applications of Listeria phages in food preservation， biological detection， genetic engineering， and the interaction between phages and hosts， aiming to provide a theoretical basis for Listeria phages in food pollution prevention and control.

Key words： Listeria monocytogenes; phage; food contamination; biological detection

*Corresponding author：" GOU Huitian， E-mail： gouht@gsau.edu.cn

產(chǎn)單核細胞李氏桿菌（Listeria monocytogenes，LM），是已發(fā)現(xiàn)李氏桿菌屬中對人致病性最強的種［1］，食用經(jīng)LM污染的食品可引起腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等多種疾病，死亡率高達30％［2］。對于李氏桿菌病的防治主要依靠抗生素，長久使用會導致細菌產(chǎn)生耐藥性，因此，在治療細菌性疾病時，迫切需要研發(fā)含有抑菌功能的新型制劑給予支持。以噬菌體為代表的新型生物抗菌制劑因其安全性、特異性、在體內(nèi)不會造成菌群失調(diào)、副作用小、無化學殘留等特點在降低致病菌污染風險、延長食品保質(zhì)期，從而保障食品的質(zhì)量與安全方面具有巨大的潛力，已經(jīng)成為當下的研究熱點。

1 噬菌體感染細菌的機制

依據(jù)侵染細菌機制的不同，可將噬菌體分為裂解性噬菌體（lytic phage）和溶源性噬菌體（lysogenic phage）。裂解性噬菌體首先吸附到細菌表面特異性受體上，將核酸注入宿主細胞，蛋白質(zhì)外殼留在胞外；核酸隨后在胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達，每個細胞中生成上百個新的噬菌體顆粒，噬菌體基因組編碼的裂解酶裂解細胞壁，最終導致細菌細胞壁破裂和噬菌體子代釋放。溶源性噬菌體侵染宿主細菌后，將其基因組 DNA 整合至宿主菌基因組上，并隨宿主菌 DNA復制而復制，在特定的條件下（如紫外線、絲裂霉素C等誘導），噬菌體 DNA與宿主菌 DNA分離，隨后進入裂解循環(huán)，噬菌體進行生物合成與裝備并裂解宿主菌，子代噬菌體顆粒釋放至宿主菌胞外（圖1）。

2 噬菌體-宿主李氏桿菌的相互作用

在自然界中，噬菌體已經(jīng)進化獲得了超越傳統(tǒng)的溶源反應，在一些LM菌株中，存在“comK”的基因，其中含有原噬菌體，這會導致宿主菌失去活性。當LM感染巨噬細胞時，原噬菌體會轉(zhuǎn)變?yōu)榉肿娱_關，促進“comK”基因的表達，從而促進LM在細胞內(nèi)的生長。在這個過程中，原噬菌體不會產(chǎn)生感染性噬菌體或?qū)е录毦芙?，這表明它已經(jīng)適應了宿主的生活方式。研究將這種適應性噬菌體行為稱為“活性溶源”，即噬菌體通過基因組切除來調(diào)控細菌的基因表達，而不觸發(fā)溶源周期［3］。為了更好地理解LM菌株10403S與其原噬菌體f10403S之間的相互作用，該研究分析了噬菌體對誘導裂解循環(huán)的條件的反應、噬菌體基因組以及在溶源性、裂解性和活性溶源性條件下的轉(zhuǎn)錄反應，同時還分析了調(diào)控基因和溶源性基因。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，f10403S獲得了一種非經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄反應，這一發(fā)現(xiàn)鑒定出新的噬菌體編碼因子，并且發(fā)現(xiàn)這些因子促進了活性溶源行為，以及在細菌-噬菌體互作作用中發(fā)揮關鍵作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，例如LlgA轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和DNA復制酶。

伊氏李氏桿菌（Listeria ivanovii，Liv）是李氏桿菌屬中的致病菌種之一，主要感染反芻動物，但也偶爾引起人類腸道感染。最近的研究表明，LM細胞壁相關的糖基共聚物 （WTA） 上的特異性糖基負責噬菌體吸附和保留主要毒力因子InlB。除了作為血清分型的主要抗原決定因素外，WTA還參與一些關鍵的生理功能，包括維持滲透壓、抗生素耐藥性、毒力以及與宿主細胞和噬菌體的相互作用［4］。在LM血清型1/2a中的研究表明，InlB依賴于WTA上的鼠李糖殘基來進行表面保留，這種修飾也可以作為噬菌體受體［5］。由于這些修飾體既是噬菌體結(jié)合的受體，也是表面相關毒力因子InlB的配體，因此，李氏桿菌在維持毒力和產(chǎn)生噬菌體抗性之間面臨著權(quán)衡［4］。由于Liv基因組中也具有InlB的特征，因此確定InlB毒力因子是否也依賴于WTA修飾是有必要的。研究表明，對Liv WSLC 3009基因組的多順反子WTA基因簇中編碼一個假定的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的獨特基因liv1070進行鑒定。超高效液相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，基因組內(nèi)缺失liv1070導致WTA上葡萄糖替代缺失，由于噬菌體不能吸附在細菌表面，這一結(jié)合過程由受體結(jié)合蛋白介導，葡萄糖缺乏突變體對噬菌體感染產(chǎn)生了抗性。與LM類似，liv1070的缺失導致了細菌細胞壁上InlB保留的缺失。liv1070的遺傳互補恢復了其特有的表型，包括葡萄糖修飾、噬菌體吸附和細胞侵襲。綜上所述，噬菌體、細菌和宿主細胞之間的相互作用也存在于Liv中，這表明噬菌體耐藥性和毒性衰減之間的權(quán)衡可能是李氏桿菌屬的一個普遍特征［6］。

隨著非編碼RNAs （ncRNAs）在LM毒力和環(huán)境脅迫中的不同作用越來越清楚，越來越受到人們的關注。ncRNA rliB是CRISPR家族的非典型成員，在一些LM基因組和其他李氏桿菌中被發(fā)現(xiàn)，并可能位于相似的基因組位點上。Tian等［7］通過同源重組構(gòu)建了rliB缺陷突變體（Lm3-22-ΔrliB），研究發(fā)現(xiàn)Lm3-22-ΔrliB對李氏桿菌噬菌體vB-LmoM-SH3-3的敏感性顯著提高，成斑效率提高了128倍。與野生型相比，Lm3-22-ΔrliB的黏附性和侵襲性顯著降低（分別為9.3%和1.33%）。感染4 h后，Lm3-22-ΔrliB在小鼠巨噬細胞（RAW264.7）中的增殖也明顯下降。侵襲相關表面蛋白轉(zhuǎn)錄水平顯示，Lm3-22-ΔrliB中內(nèi)毒素基因lmo0610、lmo0514和肽聚糖結(jié)合蛋白基因lmo1799顯著升高。此外，與噬菌體相互作用后，Lm3-22-ΔrliB細胞中inlA、lmo0610、lmo1799、lmo2085和lmo0514的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，而與噬菌體處理的Lm3-22對照組相比，inlB的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。因此，rliB缺失有效調(diào)節(jié)了李氏桿菌與噬菌體的相互作用，削弱了其侵襲能力，增強了其對噬菌體的敏感性，為噬菌體的生物防治提供了新的理論依據(jù)。

3 李氏桿菌噬菌體改造

經(jīng)過工程化改造的人工噬菌體可以攜帶特定的功能模塊，相較天然噬菌體具有增強殺菌效率、核酸水平的精準干預、轉(zhuǎn)換或擴大宿主譜、降低免疫反應、利用宏基因組挖崛噬菌體資源、多組學揭示噬菌體與宿主互作機制［8］、用于病原菌的檢測以及改造LM噬菌體作為給藥載體等一系列優(yōu)點。

基于生物發(fā)光的報告噬菌體是一種基因工程病毒，可以特異性感染宿主細胞，并轉(zhuǎn)導一種異源熒光素酶基因，其活性可以高靈敏度地檢測到，可以指示活的靶細胞的存在［9］。Meile等［10］用合成生物學進行全基因組組裝和激活，以及 CRISPR-Cas-輔助噬菌體工程，構(gòu)建了一套用于檢測和鑒別李氏桿菌活細胞的報告噬菌體。在這項研究中基于單個噬菌體結(jié)構(gòu)，比較了編碼不同甲殼動物、刺胞動物和細菌熒光素酶的四種報告噬菌體的特性。從這組報告蛋白中，nluc被鑒定為一種理想的納米熒光素酶［11］，引入到廣泛宿主噬菌體A511和血清型1/2a和血清型4b特異性李氏桿菌噬菌體A006和A500的基因組中。基于nluc的廣譜噬菌體A511：：nlucCPS在不到24 h的時間內(nèi)，在25 g人工污染的牛奶、冷盤和生菜中檢測出1 CFU的LM。此外，該報告噬菌體成功在可能被污染的食品樣品中檢測出，而且沒有產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果。A006：：nluc和A500：：nluc能夠進行血清特異性李氏桿菌診斷。此研究中提出的報告噬菌體不僅可以快速檢測出LM，而且還能估計早期食品生產(chǎn)和加工場所分離的李氏桿菌潛在毒力。

噬菌體為診斷、修復和靶向微生物組操作提供了極好的工具，但分離具有廣譜宿主特異性的噬菌體仍然具有挑戰(zhàn)性。李天昊等［12］從屠宰場污水中分離出一株可跨種裂解的LM噬菌體LP8，對其進行生物學特性分析后，聯(lián)合青霉素G鈉治療可以在良好的治療效果的前提下，減少抗微生物藥物使用，為治療李氏桿菌病提供了一個新的途徑。噬菌體編碼的受體結(jié)合蛋白（RBP）介導附著并賦予屬、種甚至血清型水平的特異性［13］。這些蛋白是特定噬菌體靶向分類多樣性的關鍵決定因素，即噬菌體宿主范圍［14］。Dunne等［15］將Gp15鑒定為噬菌體PSA 的RBP，并構(gòu)建了一個包含序列隨機RBP的合成噬菌體文庫，從中分離出突變體，隨后將其整合到具有擴展宿主范圍的合成多價噬菌體中。在1.7 分辨率下確定了Gp15受體結(jié)合羧基末端的晶體結(jié)構(gòu)，并利用生物信息學方法鑒定了針對不同李氏桿菌血清型的RBP。結(jié)構(gòu)導向設計使異種RBP頭部、頸部或肩部結(jié)構(gòu)域的交換能夠產(chǎn)生具有可預測和擴展宿主范圍的嵌合噬菌體。這一方法將促進基于具有可調(diào)宿主特異性的噬菌體生物制劑的開發(fā)。

完整注釋的基因組序列對于治療用噬菌體十分重要。盡管基因遺傳圖譜并不能決定噬菌體的宿主范圍，但可由它分析一些關鍵信息?；蚪M測序可以幫助確定噬菌體DNA的可修飾性，該系統(tǒng)可以對噬菌體能否進行基因水平轉(zhuǎn)移的可能性進行預測［16］。其次，該方法可以有效預測噬菌體是否包含有毒基因。通過對李氏桿菌噬菌體基因組進行基因修飾，理論上可以拓寬噬菌體的裂解譜［17］。

CRISPR-Cas系統(tǒng)為細菌提供適應性免疫，以抵抗入侵的DNA，包括噬菌體和質(zhì)粒［18］。Hupfeld等［19］報道了李氏桿菌屬的第一個功能性CRISPR-Cas系統(tǒng)，LivCRISPR-1是L. ivanovii亞種londoniensis基因組中的II-A型系統(tǒng)，研究者將LivCRISPR-1 Cas9和反式激活crRNA轉(zhuǎn)移到LM中，與crRNA編碼質(zhì)粒一起，這種可編輯干擾系統(tǒng)能夠有效地切割細菌DNA和進入的噬菌體基因組。構(gòu)建了一個基于LivCRISPR-1的可編輯特異性核酸酶系統(tǒng)，該系統(tǒng)也可用于李氏桿菌屬的其他成員。LivCRISPR-1 Cas9蛋白對于李氏桿菌和噬菌體DNA的高效靶向切割，可用于編輯李氏桿菌噬菌體基因組。因此，該研究編輯了一種李氏桿菌噬菌體，可誘導受感染細胞產(chǎn)生和釋放特異性細胞壁水解酶，從而允許在共培養(yǎng)中控制兩種細菌的生長和相互作用。這種方法有助于調(diào)控復雜的細菌環(huán)境，從而有助于深入研究細菌之間的相互作用。

4 噬菌體在李氏桿菌檢測中的應用

通過將噬菌體與納米材料組裝為納米復合探針或者直接使用噬菌體作為探針可用于超敏檢測。據(jù)此，國外NEMIS技術(shù)公司建立AquaSparkTM技術(shù)用于快速監(jiān)測食品接觸表面中的LM，這種技術(shù)利用LM的特異性肌醇1-磷酸基團被AquaSparkTM小分子化學發(fā)光探針標記，這個觸發(fā)基團是由LM表達的毒力因子磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C （PI-PLC）的底物所組成的，加上含有噬菌體雞尾酒的細菌特異性富集肉湯，提高其特異性和靈敏度。可以在24 h內(nèi)檢測到不銹鋼表面低劑量的LM［20］。

Sample6 DETECTTMHT/L是一種基于噬菌體的檢測系統(tǒng)，主要用于檢測環(huán)境樣品中的LM和其他李氏桿菌。使用Sample6專有的BioIlluminationTM技術(shù)，該方法通過特異性噬菌體與李氏桿菌結(jié)合，高通量DETECT HT/L試劑盒能在18 h內(nèi)最多可同時檢測96個環(huán)境樣品或混合綠葉蔬菜基質(zhì)中的李氏桿菌［21］。

Lai等［22］成功研發(fā)了一種將李氏桿菌噬菌體P100和銀納米顆粒結(jié)合到藻酸鹽基質(zhì)中的新型抗菌配方。該方法通過將噬菌體P100（109 PFU·mL-1）添加到藻酸鹽-銀包被中產(chǎn)生協(xié)同效應。在原紙上涂上不同重量的抗菌配方，然后進行紅外干燥，制成生物活性紙。整合到海藻酸鹽基質(zhì)中的噬菌體即使經(jīng)過高溫紅外干燥也能保持穩(wěn)定的特性。當海藻酸鹽濃度范圍為1.0%～1.25%，對應的干燥紙涂層重量為1.8～2.3 g·m-2時，對LM的抗菌活性最有效，使LM數(shù)量減少了5 log CFU·cm-2。噬菌體展示技術(shù)是將多肽基因片段克隆到噬菌體衣殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當位置，融合表達外源肽和衣殼蛋白。融合蛋白通過子代噬菌體的重組顯示在噬菌體表面，經(jīng)過3～5輪吸附洗脫擴增后，從噬菌體肽庫中篩選出特異性外源肽［23］。該方法篩選的肽具有特異性好、穩(wěn)定可靠、結(jié)構(gòu)清晰、容易合成、成本低等優(yōu)點［24］。Li等［25］利用噬菌體展示技術(shù)對大腸桿菌O157：H7、LM和馬耳他布魯氏菌這三種常見人畜共患病原體進行特異性肽篩選，得到了分別能識別這三種病原體的肽E2、L4和B4。合成了三個經(jīng)生物素修飾的肽，并將其偶聯(lián)到鏈霉親和素磁珠（streptavidin magnetic beads，mb）上形成多肽mb，從而富集了上述三種病原體。將3種多克隆抗體偶聯(lián)到不同的量子點熒光表面（QD540、QD580和QD630），構(gòu)建了3個量子點探針。建立了基于多肽-mb和量子點多色熒光標記的檢測方法，可同時檢測大腸桿菌O157：H7、LM和馬耳他布魯氏菌。檢測耗時約100 min，檢出限分別為103、102、102 CFU·mL-1。根據(jù)Meile等［10］的研究，噬菌體的病原識別工具可以根據(jù)其作用方式分為兩類：基于分子的檢測方法和基于相互識別的檢測方法。許多基于核酸的技術(shù)已被應用于LM的檢測，包括常規(guī)PCR、多重PCR、實時/定量PCR （qPCR）、環(huán)介導等溫擴增（LAMP）和全基因組測序分析等。這些分子技術(shù)雖非常敏感和特異，然而它們通常無法區(qū)分活的和滅活的微生物，因而會導致假陽性結(jié)果［26］。因此，需要新型的、快速的、健全的檢測方法對致病菌進行識別。在基于相互識別的檢測方法中，噬菌體尾部及其受體結(jié)合蛋白（RBPS）通過尾部附著位點與細菌表面分子之間的特異性相互作用，對宿主識別起到關鍵作用。研究者從一組李氏桿菌噬菌體中收集了六種蛋白質(zhì)：三種RBP和三種內(nèi)毒素衍生的細胞壁結(jié)構(gòu)域（cell wall-binding domains CBD），目的是開發(fā)一種快速、可靠和客觀的血清分型方法。在該方案中，GFP（綠色熒光蛋白）標記的重組蛋白與LM一起在微孔板上孵育，并在1 h內(nèi)測量結(jié)合探針的熒光，以提供血清特異性指紋圖譜。為了驗證這種新的方案的準確性，測試了60株已知血清型的菌株，其中58株被該方法準確分型。這種方法規(guī)避了基于PCR分型的一些局限性，可以區(qū)分活細菌和滅活細菌以及由點突變引起的不同血清型。為了進一步說明基于噬菌體蛋白檢測和鑒別LM的有效性。研究者們開發(fā)了一種方法來區(qū)分最常見的致病血清型：1/2a和4b，通過連接GFP標記的重組蛋白到磁珠上，以便在熒光顯微鏡下選擇性富集和檢測這些血清型。結(jié)果顯示雖然4b特異性磁珠的結(jié)合親和力明顯低于1/2a，但在混合培養(yǎng)中仍能有效地分離目標血清型細菌。以上結(jié)果表明，高穩(wěn)定性、特異性和重組過表達的易用性使RBP成為抗體的優(yōu)秀替代品和開發(fā)新診斷技術(shù)的理想工具。

5 李氏桿菌噬菌體在食品保鮮中的應用

李氏桿菌存在范圍廣泛，會污染食品加工環(huán)境，并在設備、器皿、地板和下水道的生物膜中存活，通過交叉污染進入食品，因此，消除食品和食品加工環(huán)境中的細菌病原體需要新的方法。在新興技術(shù)中，利用噬菌體作為新型抗菌劑是有效解決方案之一。在 Song等［27］的研究中，HolGH15有可能作為一種新型的抗菌劑，通過噴灑或浸泡的方式在食品生產(chǎn)和儲存過程中對抗李氏桿菌。Chibeu等［28］的研究表明，單一噬菌體制劑能夠減少火雞片和烤牛肉表面的李氏桿菌。與單一噬菌體制劑相比，用多種噬菌體制備的雞尾酒制劑效果更好，既有更廣泛的裂解范圍，又能降低細菌出現(xiàn)耐藥性的風險（表1）。

噬菌體固定化使得具有噬菌體活性的包裝材料應用于食品。由于噬菌體外部結(jié)構(gòu)具有電荷差異，噬菌體可以通過靜電作用固定在包裝表面。Anany等［38］指出固定化的LM噬菌體可以應用于真空或有氣體填充的包裝肉類中，可在保質(zhì)期內(nèi)將LM控制在1×105 CFU·mL-1以下。Radford等［39］將噬菌體固定在聚乳酸（PLA）薄膜的黃原膠涂層上，與農(nóng)產(chǎn)品作用30 min內(nèi)，99.99%噬菌體獲得釋放。具有噬菌體涂層與不具備涂層的PLA相比，細菌的數(shù)量出現(xiàn)明顯下降（表2）。

6 問題與展望

近年來，對李氏桿菌噬菌體的應用研究進展成為當下研究熱點之一，但是，目前對李氏桿菌噬菌體的研究主要集中在分離鑒定及生物學特性分析等初步研究［12］，對李氏桿菌噬菌體與宿主互作機制以及作為生物制劑在臨床應用方面研究較少。噬菌體的高度特異性確保了使用噬菌體的安全性；噬菌體種類繁多，基數(shù)大等，為噬菌體的使用提供了基礎；噬菌體的生物活性可以確保在宿主體內(nèi)的作用效果不會因為時間的推移或者微環(huán)境的改變導致治療效果下降；同時利用噬菌體本身的一些特性，也可以開發(fā)出一系列的新技術(shù)，用于細菌性疾病的食品污染防控和公共衛(wèi)生的改善。雖然，李氏桿菌噬菌體生物制劑作為生物防治手段仍有很長一段路要走。但通過開展李氏桿菌CRISPR-Cas防御系統(tǒng)與噬菌體互作等方面的研究，以進一步完善噬菌體生物學、基因組學、基因傳遞機制以及李氏桿菌屬的致病機制，從而為噬菌體臨床應用提供堅實基礎，相信隨著科學技術(shù)的進步和科研手段的提高，噬菌體將會成為一種綠色、安全、有效的防控細菌性感染的抗生素替代品。

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（編輯 白永平）