基于代謝組學探究腎陽虛證患者激素代謝的變化研究

摘要：目的 探究腎陽虛證患者與平和質(zhì)人群的尿液代謝物水平差異，分析激素變化情況，為腎陽虛證探索出有價值的生物標志物。方法 共納入8例腎陽虛患者與4例平和質(zhì)人群的尿液進行UPLC代謝組學分析，通過PCA、PLS-DA分析，篩選出有顯著差異的代謝物并結(jié)合代謝通路進行分析。結(jié)果 與對照組相比較，試驗組尿液中11-β-羥基雄酮-3-葡萄糖醛酸、三羥基孕酮、18-羥皮質(zhì)醇、醛固酮18-葡糖苷酸、4-羥基雄烯二酮葡糖苷酸等激素代謝物顯著上升，硫酸雄酮、本膽烷醇酮、16-脫氫黃體酮、5b-孕二醇、氟氫可的松、雌酮、5a-二氫睪酮等顯著下降。結(jié)論 本研究進一步證明了腎陽虛證會導致機體多種激素代謝紊亂，降低氨基酸、脂肪酸等能量代謝，并與細胞內(nèi)吞、晝夜節(jié)律夾帶等通路有關。

關鍵詞：腎陽虛證；代謝組學；代謝通路；生物標志物

中圖分類號：R277.5 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2024）08-0068-06

腎陽虛屬于中醫(yī)理論體系中的重要證候之一，是一種虛寒證候，其病因主要為腎陽虛衰、腎臟溫煦、氣化功能下降等。由稟賦不足、年老體虛、耗損過度、補養(yǎng)不足及氣機阻滯所引起。臨床表現(xiàn)多見面色蒼白、形寒肢冷、腰膝酸痛、下肢軟弱無力、小便不利或小便頻數(shù)、少腹拘急。對于腎陽虛證相關疾病的治療已經(jīng)成為國內(nèi)外醫(yī)學研究的熱點。在以往的代謝通路研究中發(fā)現(xiàn)，該證候主要可能是“下丘腦—垂體—腎上腺皮質(zhì)軸、甲狀腺軸、性腺軸和胸腺軸”等環(huán)節(jié)發(fā)生了不同程度的紊亂所造成的［1］。

對于腎陽虛證相關疾病的病程中，人體各類生物標志物，特別是激素類的研究已經(jīng)日漸深入，例如杜嫦燕等［2］利用經(jīng)方加減治療脾腎陽虛型卵巢早衰并探究相關激素水平變化，周歆等［3］通過對大量文獻的二次研究發(fā)現(xiàn)“補腎陽”中醫(yī)療法治療多種腎陽虛證疾病都與激素調(diào)節(jié)密切相關，但以證候分類進行激素水平變化特點的研究尚有待探索，本研究以腎陽虛患者與平和體質(zhì)成人的尿液為樣本，通過液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用的代謝組學研究，靶向分離與鑒定樣本中各種激素類物質(zhì)，篩選出具有意義的生物標志物，從激素代謝的角度進一步揭示腎陽虛證的證候變化特點與人體激素的關系，為腎陽虛證相關疾病的診斷和治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象的選擇

1.1.1 研究對象 試驗組8例腎陽虛患者及對照組4例平和質(zhì)人群，均自愿簽署知情同意書，并符合方案規(guī)定的相關標準。本試驗方案獲昆明市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2 診斷標準 參照2002年國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的中的“腎陽虛證”診斷標準［4］。主癥：畏寒肢冷，神疲乏力，腰膝酸軟，夜尿頻多，性欲減退。次癥：動則氣促，下肢浮腫，發(fā)槁齒搖。具備以上主癥3項、次癥1項，即可診斷腎陽虛證。

1.1.3 納入標準 患者年齡在35～65歲之間；符合中醫(yī)腎陽虛證診斷標準者及平和體質(zhì)者；自愿簽署知情同意書。

1.1.4 排除標準 患者正處于急性感染期；精神上或法律上的殘疾患者；哺乳、妊娠或正準備妊娠的婦女；過敏體質(zhì)或?qū)Χ喾N藥物有過敏史者；30天內(nèi)參加過其他藥物臨床試驗的患者；腋下體溫>37.5℃；嚴重的心腦血管疾病、肝臟疾病、腎臟疾病、造血系統(tǒng)疾病、先天性心臟病患者等。

1.2 一般資料 試驗組和對照組的患者均來自于本院的門診患者，男女均有。平和質(zhì)組平均年齡（47.20±13.40）歲；腎陽虛證組年齡（48.60±11.30）歲，2組試驗對象年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性（P>0.05）。

1.3 研究方法

1.3.1 主要儀器及試劑 儀器：液相色譜：2777C UPLC system（Waters，UK）；質(zhì)譜儀：Xevo G2-XS QTOF（Waters，UK）。

試劑：HPLC乙腈（Thermo，USA），乙酸銨（Sigma，USA），甲酸（Sigma，USA），甲酸銨（Sigma，USA）。

1.3.2 樣本收集及處理 取-80 ℃低溫保存的尿液樣品，復溫后用從每個樣本中取100 μL混合作為QC樣本，根據(jù)樣本數(shù)目確定QC數(shù)目（樣本數(shù)目的6%為樣本制備插入的QC數(shù)目，至少為6個，取整數(shù)后將QC分裝）。取數(shù)個新的EP管放置于EP管架上，標注標簽，按上機順序?qū)颖九判?，并隨機插入qc樣本；將每個樣品（含QC）各取100 μL左右加入相應新EP管中，加入甲醇300 μL，每個EP管單獨渦旋30 s混勻；靜置1 min，確保體積不均的EP管，如有需重新處理該樣品；置于-20 ℃冰箱2 h；25000 g×4 ℃離心 10 min后取350μL上清置于新的EP管中，25000 g×4 ℃再次離心10 min；將EP管從離心機中取出，按樣品編碼順序?qū)悠贩胖迷陔x心管架上；每個樣品取25 μL置于新的96孔板中，加入225 μL 50%甲醇進行稀釋；剩余樣品交于按條件妥善保存。

1.3.3 液相色譜質(zhì)譜檢測 （1）液相參數(shù)：采用ACQUITY UPLC HSS T3 column（100 mm×2.1 mm，1.8 μM，Waters，UK）進行色譜分離，色譜柱柱溫為40 ℃，流速為0.5 mL·min-1，其中A流動相為水和0.1%甲酸，B流動相為乙腈和0.1%甲酸。對代謝物采用以下梯度進行洗脫：0～1 min，99 %流動相A；1～3 min，1-15%流動相B；3～6 min，15%～50%流動相B；6-9 min則為50%～95%流動相B；9-10 min則為95%流動相B；10.1-12 min則為99%流動相A。每個樣本的上樣體積為10 μL。（2）質(zhì)譜參數(shù)：對從色譜柱上洗脫下來的小分子，利用高分辨串聯(lián)質(zhì)譜Xevo G2-XS QTOF（Waters，UK）分別進行正負離子模式采集。正離子模式下，毛細管電壓和錐孔電壓分別為2 kV和40 V。負離子模式下，毛細管電壓及錐孔電壓分別為2 kV和40 V。采用MSE模式進行centroid數(shù)據(jù)采集，一級掃描范圍為50～1200 Da，掃描時間為0.2 s，對所有母離子按照20到40 eV的能量進行碎裂，采集所有的碎片信息，掃描時間為0.2 s。在數(shù)據(jù)采集過程中，對LE信號每3 s進行實時質(zhì)量校正。同時，每隔10個樣本進行一次混合后質(zhì)控樣本的采集，用于評估在樣本采集過程中儀器狀態(tài)的穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控 QC樣本在樣本檢測前用于平衡“色譜-質(zhì)譜”系統(tǒng)，通過對QC樣本的總離子流色譜圖（TIC）進行重疊以在樣本檢測過程中用于評價質(zhì)譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，對QC樣本進行主成分分析驗證數(shù)據(jù)質(zhì)量以及試驗的重復性。本研究中大部分離子的保留時間與各色譜峰的響應強度基本重疊，表示生物學重復之間差異較小，取樣精確，儀器誤差?。▓D1）。

1.4.2 統(tǒng)計學及數(shù)據(jù)處理 質(zhì)譜下機原始數(shù)據(jù)導入軟件Progenesis QI（version 2.2）進行峰提取，獲得代謝物相關的質(zhì)荷比、保留時間和離子面積等信息。采用QC-RSC（quality control–based robust LOESS signal correction）方法校正，將所有QC樣品中相對標準偏差（RSD）>30 %的離子舍棄（RSD>30 %的離子在實驗過程中波動較大，不納入下游統(tǒng)計學分析），最后進行分析。通過PCA對數(shù)據(jù)進行降維分析，以檢測實驗組間的差異性及組內(nèi)的重復性。在二維圖中，取前兩個主成分 PC1、PC2來表示樣本，空間分布差異越小表示兩個樣本的數(shù)據(jù)越接近。在本研究中，在做PLS-DA模型之前進行了log2轉(zhuǎn)換及采用Pareto scaling的方法對數(shù)據(jù)進行比例調(diào)整（scaling）。最后對差異代謝進行分析篩選，得到各組中排名靠前的差異代謝物，通過火山圖（Volcano plot）直觀顯示差異代謝物的整體分布情況。

本研究中采用t檢驗和變異倍數(shù)分析（fold change analysis，F(xiàn)C analysis）。在統(tǒng)計分析過程中，進一步對統(tǒng)計檢驗產(chǎn)生的p-value進行FDR校正得到q-value。最終結(jié)果以火山圖形式呈現(xiàn)差異倍數(shù)（Fold change）和q-value兩個指標，通常以差異倍數(shù)≥1.2或≤0.8333，q-value值小于0.05作為篩選差異代謝物的條件。

1.4.3 代謝通路功能分析 在生物體內(nèi)，不同代謝物會形成一個相互作用網(wǎng)絡，基于Pathway的分析有助于更進一步了解其參與的通路。KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes 是有關 Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫，通過 Pathway分析能確定代謝物參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導途徑。計算差異代謝物在不同 Pathway 的分布情況，可以對差異代謝物進行歸類，尋找差異代謝物與通路改變的關系。

2 結(jié)果

2.1 主成分分析（PCA） 本研究中PCA分析前對數(shù)據(jù)進行了log2轉(zhuǎn)換和比例調(diào)整（scaling），采用Pareto調(diào)整法（Pareto scaling），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在同一組內(nèi)各樣本在一定范圍內(nèi)相對集中，重復性較好（圖2）。PCA分析發(fā)現(xiàn)，對變異影響最大的因子有45.04 %的貢獻率（PC1），第二大的因子有8.89 %的貢獻率（PC2）。

2.2 偏最小二乘法判別分析（PLS-DA） 在經(jīng)過PCA的探索分析得到判別模型，以識別關鍵的生物標志物或樣本差異；最后通過模型評估和結(jié)果可視化，確定模型的有效性和結(jié)果的清晰度。結(jié)果顯示對照組與試驗組之間分離情況更加完善，可以篩選出2組之間的差異代謝物（圖3）。

2.3 差異代謝物 通過比較2組的代謝譜數(shù)據(jù)差異，結(jié)果顯示（圖4），2組間有大量代謝物存在差異（P<0.05），其中部分代謝物差異顯著（P<0.01）并且差異倍數(shù)較大，試驗組較對照組相比，代謝物上調(diào)的較多。

以RSD ≤ 30 %為條件篩選2組間代謝存在顯著差異（P<0.01）的離子共有4308種（表1），同時篩選出與激素相關的差異代謝物13種，[HJ2.6mm]腎陽虛證患者尿液中的11-β-羥基雄酮-3-葡萄糖醛酸、三羥基孕（甾）酮、18-羥皮質(zhì)醇、2-甲氧基-雌二醇-17b-3-葡萄糖醛酸、醛固酮18-葡糖苷酸、4-羥基雄烯二酮葡糖苷酸等激素代謝物或者其中間產(chǎn)物顯著上升，而硫酸雄酮、本膽烷醇酮、16-脫氫黃體酮、5b-孕二醇、氟氫可的松、雌酮、5a-二氫睪酮等顯著下降（表2），篩選條件為1）VIP ≥ 1；2）fold change ≥1.2或者≤ 0.8333；3）q-value<0.05。

2.4 代謝通路分析結(jié)果 將篩選出的代謝物與數(shù)據(jù)庫中的代謝通路進行比對，計算通路在數(shù)據(jù)集中的富集程度，以評估通路活性狀態(tài)。富集結(jié)果顯示，腎陽虛組與平和組相比共有188個相關的代謝途徑參與了差異代謝物的調(diào)控，主要集中在細胞質(zhì)膜運送物質(zhì)的通路以及對氨基酸、脂肪酸、藥物代謝酶等多種物質(zhì)的代謝通路（表3，Top10）。

3 討論

腎為先天之本，藏精生髓，腎所藏的先天之精來源于父母稟賦，是生命的本源，其功能決定了人體生長，臟腑盛衰的變化。由于各種生理、病理原因?qū)е戮珰獠蛔悖I陽虛衰從而導致激素代謝異常，影響機體相關能量代謝通路與正常的生理功能，表現(xiàn)出畏寒喜暖、腰膝酸軟，腎陽不足難以固攝腎精，精氣外泄則夜尿頻多、小便清長，對于生殖系統(tǒng)的影響表現(xiàn)為陽痿早泄、性欲低下，甚至不孕不育，并伴有神疲乏力、手足厥冷、精神萎靡、頭暈目眩等癥狀［5-6］。

通過對腎陽虛體質(zhì)和平和體質(zhì)人群尿液的代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)2組間有大量的代謝物存在差異，富集到不同功能的通路。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，腎陽虛證與“下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸”功能紊亂相關，通過神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡中樞調(diào)節(jié)最后作用到促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素和促腎上腺皮質(zhì)激素等腎上腺相關激素以及糖皮質(zhì)激素的釋放與代謝［7］，在本研究中同樣觀察到在腎陽虛證患者的尿液代謝物中，氟氫可的松的含量顯著下降，18-羥皮質(zhì)醇含量升高，提示腎陽虛證患者的腎上腺皮質(zhì)功能出現(xiàn)異常。由于腎上腺皮質(zhì)功能受損導致激素代謝與調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂從而表現(xiàn)出腎陽虛證的諸多癥狀，同時由于生理或者病理的可的松類激素分泌過度也同樣容易導致腎陽虛證，并且在能量代謝、脂肪酸、氨基酸等代謝功能上出現(xiàn)異常［8］，當機體的嘌呤代謝、脂肪酸生物合成相關通路受到影響，身體代謝效率低下后，從而導致線粒體能量代謝障礙，由此出現(xiàn)乏力、畏寒、肢冷和精神萎靡等腎陽虛證的典型癥狀［9］，現(xiàn)代醫(yī)學研究也表明，蒽醌類、糖類以及氨基酸等物質(zhì)對改善腎陽虛證有顯著作用，其機制可能與改善能量代謝和逆轉(zhuǎn)氨基酸代謝紊亂，調(diào)控“下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸”生理病理和功能狀態(tài)相關［10］。

綜上，根據(jù)本研究中試驗組和對照組的激素代謝變化，以及相關代謝物的不同，在腎陽虛證的診斷和治療方面，建議可以借助代謝組學的方法，從氨基酸、脂肪酸等能量代謝通路方面入手，將機體微觀水平的變化與中醫(yī)證候的整體觀念相結(jié)合，通過激素代謝水平的異常與癥狀表現(xiàn)，對腎陽虛證的病理變化過程進行綜合闡釋，這樣不僅遵循中醫(yī)溫腎補陽的治法治則，同時也可以從相關的代謝通路出發(fā)，并加以激素調(diào)節(jié)等方式，對腎陽虛證進行全面客觀的診治。

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