黃芪總黃酮對(duì)柯薩奇B3病毒誘導(dǎo)的病毒性心肌炎小鼠TLR4/NF-κB信號(hào)通路和細(xì)胞凋亡的影響

摘要目的：探究黃芪總黃酮（TFA）對(duì)柯薩奇B3病毒（CVB3）誘導(dǎo)的病毒性心肌炎（VMC）小鼠模型Toll樣受體4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路和細(xì)胞凋亡的影響。方法：將40只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、VMC組、VMC＋低劑量TFA組、VMC＋高劑量TFA組，每組10只。VMC組、VMC＋低劑量TFA組、VMC＋高劑量TFA組經(jīng)CVB3誘導(dǎo)建立VMC小鼠模型，VMC＋低劑量TFA組、VMC＋高劑量TFA組分別以15、30 mg/kg TFA灌胃，VMC組、對(duì)照組以等量生理鹽水灌胃。CVB3感染后第11 天超聲檢查小鼠心臟功能，處死小鼠后采用蘇木精-伊紅（HE）染色和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）染色觀察心肌形態(tài)學(xué)變化和凋亡情況，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)心肌組織勻漿液中白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平，蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)心肌組織中TLR4、NF-κB p65（p65）、磷酸化NF-κB p65（p-p65）、切割后半胱氨酸蛋白酶-3（Cleaved-Caspase-3）、切割后半胱氨酸蛋白酶-9（Cleaved-Caspase-9）表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照組比較，VMC組小鼠CVB3 mRNA、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、心肌細(xì)胞凋亡率、心肌組織中IL-6、IL-1β、TNF-α、TLR4、p-p65/p65、Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9相對(duì)表達(dá)量明顯升高，左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與VMC組比較，VMC＋低劑量TFA組和VMC＋高劑量TFA組CVB3 mRNA、LVESD、心肌細(xì)胞凋亡率、心肌組織中IL-6、IL-1β、TNF-α、TLR4、p-p65/p65、Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9相對(duì)表達(dá)量明顯降低，LVEF明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MC＋高劑量TFA組CVB3 mRNA、IL-6、TNF-α水平，細(xì)胞凋亡率，TLR4、p-p65/p65和Cleaved-Caspase-9相對(duì)表達(dá)量明顯低于VMC＋低劑量TFA組，LVEF明顯高于MC＋低劑量TFA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：TFA可減輕CVB3誘導(dǎo)的VMC小鼠心肌病理損傷，減少心肌炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與TLR4/NF-κB信號(hào)通路、Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9表達(dá)的抑制有關(guān)。

關(guān)鍵詞病毒性心肌炎；黃芪總黃酮；炎癥反應(yīng)；細(xì)胞凋亡；Toll樣受體4；核因子κB；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.15.009

柯薩奇B3病毒（CVB3）是一種無包被的微小RNA病毒，可入侵心肌細(xì)胞，誘導(dǎo)病毒性心肌炎（VMC），病理表現(xiàn)為心肌間質(zhì)存在大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有心肌細(xì)胞壞死［1］。臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，VMC可在人群中暴發(fā)流行，并發(fā)生于各個(gè)年齡階段，但在嬰幼兒中具有較高的病死率。雖然多數(shù)VMC病人治療效果良好，但部分會(huì)遺留心功能異常，還有病人病情可進(jìn)展為擴(kuò)張型心肌病，導(dǎo)致不良預(yù)后［2］。黃芪是中醫(yī)中經(jīng)典的補(bǔ)氣生肌藥物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪總黃酮（TFA）作為黃芪主要活性成分，具有抗病毒、抗氧化應(yīng)激、抗心律失常等豐富的生物學(xué)活性［3-4］。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信號(hào)通路在VMC的發(fā)生發(fā)展中有重要作用，可直接介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等，參與心肌病理過程［5］。已有研究顯示，TFA在VMC細(xì)胞及動(dòng)物模型有重要的心肌保護(hù)作用［6-7］。本研究將從TLR4/NF-κB信號(hào)通路角度，進(jìn)一步驗(yàn)證TFA改善VMC的效果及機(jī)制。鑒于此，本研究初步探討TFA對(duì)VMC小鼠TLR4/NF-κB信號(hào)通路和細(xì)胞凋亡的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

雄性BALB/c小鼠40只，8周齡，體質(zhì)量20～24 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供［SCXK（京）2020-0015］。小鼠飼養(yǎng)于20～24 ℃、相對(duì)濕度50%～60%的動(dòng)物房中，晝夜周期為12 h，使用高壓滅菌處理的墊料、飼料及飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。病毒株 CVB3病毒（Nancy株）購(gòu)自中國(guó)國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞共享平臺(tái)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組與處理

將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、VMC組、VMC＋低劑量TFA組、VMC＋高劑量TFA組，每組10只。對(duì)照組注射生理鹽水，其他組小鼠腹腔注射100倍稀釋的CVB3病毒稀釋液0.2 mL，建立VMC小鼠模型，感染72 h后各組隨機(jī)取2只小鼠檢測(cè)心肌組織中CVB3病毒水平，確定造模是否成功［8］。VMC＋低劑量TFA組、VMC＋高劑量TFA組在造模成功后分別以15、30 mg/kg的TFA灌胃，連續(xù)給藥7 d，對(duì)照組和VMC組以等量生理鹽水灌胃。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)心肌組織中CVB3 mRNA水平

感染72 h后各組隨機(jī)取2只小鼠采用頸椎拉脫法處死，取心肌組織，加入Trizol溶液（美國(guó)Inviteogen公司）提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增，CVB3 mRNA正向引物序列為5′-AATCCCTATGGCTGAACG-3′，反向引物序列為5′-GGAGAACACCCTCTTTGC-3′。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共38個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min收集擴(kuò)增產(chǎn)物，采用2－△△Ct法計(jì)算CVB3 mRNA水平。

1.2.3小鼠心臟超聲檢測(cè)

CVB3感染后第11 天進(jìn)行心臟超聲檢查，吸入2%異氟烷麻醉小鼠，經(jīng)高分辨率小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)（型號(hào)為Vcvo2100，加拿大Visualsonics公司）探查，檢測(cè)左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）和左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）。

1.2.4心肌形態(tài)學(xué)變化的觀察

超聲檢測(cè)結(jié)束后處死小鼠，快速取出心臟固定，再制成4 μm石蠟組織切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，脫水、封片后鏡下觀察。

1.2.5脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡

取心肌組織石蠟切片，脫水后添加蛋白酶K室溫孵育30 min，滴加TUNEL反應(yīng)試劑（武漢艾美捷公司）反應(yīng)，然后3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精復(fù)染20 s，脫水、封片后鏡下觀察，并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。

1.2.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)心肌組織勻漿液中炎性因子水平

取心肌組織混入生理鹽水（1∶9比例）勻漿，離心分離上清，參照ELISA測(cè)試盒（南京建成生物技術(shù)公司）檢測(cè)白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平。

1.2.7蛋白免疫印跡法 （Western Blot）檢測(cè)心肌組織中相關(guān)蛋白表達(dá)

取心肌組織，加入放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液（上海碧云天生物技術(shù)公司）提取總蛋白，各組定量取30 μg變性蛋白電泳、電轉(zhuǎn)后，置于5%脫脂牛奶中封閉2 h，分別置于1∶1 000稀釋的TLR4、NF-κB p65（p65）、磷酸化NF-κB p65（p-p65）、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cleaved-Caspase-3）、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9（Cleaved-Caspase-9）和β-actin一抗（美國(guó)Abcam公司）中，4 ℃搖床震蕩過夜，再置于1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）二抗，室溫下?lián)u床震蕩1 h，最后暗室曝光顯示蛋白條帶，掃描蛋白條帶灰度值后計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析比較，進(jìn)一步多重比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組小鼠CVB3 mRNA及心功能指標(biāo)比較

與對(duì)照組比較，VMC組CVB3 mRNA、LVESD明顯升高，LVEF明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與VMC組比較，VMC＋低劑量TFA組和VMC＋高劑量TFA組CVB3 mRNA、LVESD明顯降低，LVEF明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；VMC＋高劑量TFA組CVB3 mRNA明顯低于VMC＋低劑量TFA組，LVEF明顯高于MC＋低劑量TFA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但各組LVEDD比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

2.2各組心肌病理變化比較

對(duì)照組心肌組織結(jié)構(gòu)完整，心肌纖維排列整齊，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；VMC組心肌纖維溶解、成片，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；VMC＋低劑量TFA組和VMC＋高劑量TFA組仍存在部分心肌纖維溶解和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但心肌病變程度較VMC組明顯減輕。詳見圖1。

2.3各組心肌細(xì)胞凋亡比較

與對(duì)照組比較，VMC組心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與VMC組比較，VMC＋低劑量TFA組和VMC＋高劑量TFA組心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），且VMC＋高劑量TFA組心肌細(xì)胞凋亡率低于VMC＋低劑量TFA組（P＜0.05）。詳見圖2、表2。

2.4各組心肌組織IL-6、IL-1β和TNF-α水平比較

與對(duì)照組比較，VMC組心肌組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯升高（P＜0.05）；與VMC組比較，VMC＋低劑量TFA組和VMC＋高劑量TFA組IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯降低（P＜0.05），且VMC＋高劑量TFA組IL-6和TNF-α水平低于VMC＋低劑量TFA組（P＜0.05）。詳見表3。

2.5各組心肌組織TLR4/NF-κB通路和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

與對(duì)照組比較，VMC組心肌組織中TLR4、p-p65/p65、Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）；與VMC組比較，VMC＋低劑量TFA組和VMC＋高劑量TFA組TLR4、p-p65/p65、Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.05），且VMC＋高劑量TFA組TLR4、p-p65/p65和Cleaved-Caspase-9相對(duì)表達(dá)量明顯低于VMC＋低劑量TFA組（P＜0.05）。詳見表4、圖3。

3討論

目前，VMC主要以抗病毒治療為主，再對(duì)癥治療結(jié)合抗心力衰竭以及非類固醇抗炎、免疫抑制治療等，但這些療法特異性差，且存在較大毒副作用，臨床仍需探索開發(fā)安全有效的新型藥物［9］。TFA包含β-谷甾醇、芒柄花素等6種單體化合物，其在心?。?0］、肝臟［11］等組織疾病中發(fā)揮抗氧化作用已有報(bào)道。本研究通過對(duì)VMC小鼠模型進(jìn)行藥物干預(yù)，觀察TFA對(duì)VMC小鼠的影響，結(jié)果表明，TFA可明顯抑制VMC小鼠心肌組織中CVB3，緩解CVB3感染引起心肌病理損傷，改善心功能，與既往研究結(jié)果［12］相符。

CVB3感染后，人體自身免疫系統(tǒng)中TLR4可與配體結(jié)合，通過激活NF-κB信號(hào)通路，啟動(dòng)強(qiáng)效炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡。梁建軍等［13］研究發(fā)現(xiàn)，紅花注射液可通過抑制TLR4、NF-κB表達(dá)，減輕VMC大鼠炎癥反應(yīng)，從而改善心肌組織損傷。Liu等［14］研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖對(duì)CVB3誘導(dǎo)的心肌損傷和炎癥有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB通路有關(guān)。上述研究結(jié)果表明，干預(yù)TLR4/NF-κB通路可能是治療VMC的有效途徑。TFA也具有抗炎作用。周鴻緣等［15］以體外構(gòu)建炎癥細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)TFA可調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號(hào)通路，發(fā)揮抗炎作用。Ma等［16］研究顯示，TFA可通過雙重抑制NF-κB炎癥通路和miR-133表達(dá)，以及部分抑制巨噬細(xì)胞清除受體減輕動(dòng)脈粥樣硬化，還可改善肝臟脂肪變性和脂質(zhì)紊亂，可能作為心血管疾病的新型治療方法。本研究結(jié)果顯示，VMC小鼠心肌組織中TLR4和p-p65/p65過表達(dá)，且炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯升高，TFA干預(yù)后可明顯抑制上述表現(xiàn)，提示TFA可能通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路，減少炎性因子表達(dá)，對(duì)VMC小鼠心肌損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

心肌細(xì)胞在病毒感染過程中，伴隨著非裂解性程序性死亡，即細(xì)胞凋亡。Caspase家族在細(xì)胞凋亡過程中占據(jù)重要地位，上游凋亡信號(hào)刺激Caspase-9、Caspase-10等進(jìn)行異源活化，啟動(dòng)并放大凋亡信號(hào)，并同源活化下游Caspase-3、Caspase-6等，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［17］。本研究經(jīng)TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組僅少量心肌細(xì)胞凋亡，而VMC組存在大量的心肌細(xì)胞凋亡，VMC＋低劑量TFA組和VMC＋高劑量TFA組心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低，提示TFA或可緩解CVB3感染誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步觀察TFA對(duì)VMC小鼠凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)TFA可下調(diào)Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9表達(dá)，這可能是其抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用途徑。

綜上所述，TFA可減輕CVB3誘導(dǎo)的VMC小鼠心肌病理損傷，可能通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路改善心肌炎癥損傷，下調(diào)Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡。但本研究?jī)H局限于從TLR4/NF-κB信號(hào)通路及細(xì)胞凋亡角度觀察，未能檢測(cè)自噬、細(xì)胞焦亡等生物學(xué)行為在TFA保護(hù)VMC心肌損傷中的作用，未來將從自噬、細(xì)胞焦亡的角度展開研究，進(jìn)一步豐富TFA治療VMC的藥理學(xué)作用。

參考文獻(xiàn)：

［1］NIE X，LI H H，WANG J，et al.Expression profiles and potential functions of long non-coding RNAs in the heart of mice with Coxsackie B3 virus-induced myocarditis［J］.Frontiers in Cellular and Infection Microbiology，2021，11：704919.

［2］TSCHPE C，AMMIRATI E，BOZKURT B，et al.Myocarditis and inflammatory cardiomyopathy：current evidence and future directions［J］.Nature Reviews Cardiology，2021，18（3）：169-193.

［3］蘇優(yōu)拉，陳貴林.黃芪中黃酮類成分的研究進(jìn)展［J］.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2021，12（3）：849-857.

［4］WANG Z，LI X L，HONG K F，et al.Total flavonoids of Astragalus ameliorated bile acid metabolism dysfunction in diabetes mellitus［J］.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2021，2021：6675567.

［5］肖文濤，張靜，郭素萍，等.丹參酮ⅡA對(duì)CVB3感染的小鼠原代心肌細(xì)胞氧化損傷及凋亡的影響及其機(jī)制研究［J］.分子診斷與治療雜志，2021，13（9）：1385-1389.

［6］馬奎影，白婷婷，趙強(qiáng)，等.黃芪總黃酮通過網(wǎng)腔鈣結(jié)合蛋白調(diào)控線粒體鈣循環(huán)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)CVB3感染心肌細(xì)胞保護(hù)作用研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2020，31（9）：2065-2067.

［7］劉灝，呼日樂巴特，熊英，等.黃芪總黃酮對(duì)病毒性心肌炎小鼠心律失常與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子的影響［J］.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2018，34（1）：16-18;22.

［8］張思思，謝達(dá)奇，胡文奕，等.基于PI3K/PKB通路研究EGCG對(duì)CVB3感染致病毒性心肌炎小鼠細(xì)胞凋亡的影響［J］.病毒學(xué)報(bào)，2021，37（3）：575-582.

［9］SCHULTHEISS H P，BAUMEIER C，ALESHCHEVA G，et al.Viral myocarditis-from pathophysiology to treatment［J］.Journal of Clinical Medicine，2021，10（22）：5240.

［10］ZHOU X M，XIN Q，WANG Y L，et al.Total flavonoids of Astragalus plays a cardioprotective role in viral myocarditis［J］.Acta Cardiologica Sinica，2016，32（1）：81-88.

［11］AN L，LIN Y F，LI L Y，et al.Integrating network pharmacology and experimental validation to investigate the effects and mechanism of astragalus flavonoids against hepatic fibrosis［J］.Frontiers in Pharmacology，2020，11：618262.

［12］宣麗穎，陶謝鑫，趙雅君，等.黃芪總黃酮對(duì)柯薩奇B3病毒感染乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及Calumenin蛋白和縫隙連接蛋白CX43的作用［J］.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2016，32（1）：51-54.

［13］梁建軍，徐元?jiǎng)伲瑢O守剛，等.紅花注射液對(duì)病毒性心肌炎大鼠心肌組織 Bcl-2和Bax基因表達(dá)的影響［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2021，31（20）：3099-3104.

［14］LIU T L，ZHANG M J，NIU H Y，et al.Astragalus polysaccharide from Astragalus Melittin ameliorates inflammation via suppressing the activation of TLR-4/NF-κB p65 signal pathway and protects mice from CVB3-induced virus myocarditis［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2019，126：179-186.

［15］周鴻緣，張賢，王萌，等.黃芪總黃酮體外抗炎作用及對(duì)MAPKs信號(hào)通路的調(diào)控［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2020，40（12）：2392-2397.

［16］MA C R，ZHANG J，YANG S，et al.Astragalus flavone ameliorates atherosclerosis and hepatic steatosis via inhibiting lipid-disorder and inflammation in ApoE-/- mice［J］.Frontiers in Pharmacology，2020，11：610550.

［17］WANG Q Y，ZHU Q J，YE Q F，et al.STAT3 suppresses cardiomyocytes apoptosis in CVB3-induced myocarditis via survivin［J］.Frontiers in Pharmacology，2020，11：613883.

（收稿日期：2023-11-07）

（本文編輯郭懷?。?/p>