丁酸梭菌對花鱸幼魚生長性能、免疫消化及腸道菌群的影響

摘要：【目的】探究丁酸梭菌（Clostridium butyricum）對花鱸（Lateolabraxmaculatus）幼魚生長性能，消化、免疫和抗氧化能力及腸道菌群的影響，為丁酸梭菌在花鱸魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳曰|幼魚為試驗(yàn)材料設(shè)飼料中丁酸梭菌添加量為0（D0，對照）、0.25%（D1）、0.50%（D2）、1.00%（D3）、2.00%（D4）和4.00%（D5）6組，投喂花鱸幼魚56 d，測定其生長性能、腸道消化酶活性、血清生化和免疫指標(biāo)及腸道形態(tài)指標(biāo)，分析腸道菌群組成?！窘Y(jié)果】丁酸梭菌可顯著降低飼料系數(shù)（Plt;0.05，下同），顯著提高花鱸幼魚的終末平均體質(zhì)量，D3、D4和D5組的增重率及特定生長率均顯著高于D0組。與D0組相比，D4組腸道糜蛋白酶和脂肪酶活性均顯著提高，血清總膽固醇、甘油三酯含量和谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性均顯著降低。D4組溶菌酶、堿性磷酸酶和總一氧化氮合酶活性均顯著高于D0組，D3組酚氧化酶活性顯著高于D0組；與D0組相比，D3和D5組過氧化氫酶活性及總抗氧化能力均顯著提高，D4組超氧化物歧化酶活性顯著提高，丙二醛含量顯著降低。D2、D3和D5組花鱸幼魚腸道肌層厚及絨毛高度均顯著高于D0組。D3組花鱸幼魚腸道菌群OTU數(shù)量和Chaol指數(shù)均顯著高于D0組，各試驗(yàn)組花鱸幼魚腸道菌群Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)均顯著高于D0組；在門分類水平上，丁酸梭菌降低了變形菌門和厚壁菌門相對豐度，提高了放線菌門、浮霉菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、擬桿菌門和芽單胞菌門相對豐度；在屬分類水平上，丁酸梭菌降低了勞爾氏菌屬、腸弧菌屬和弧菌屬有害菌相對豐度，提高了節(jié)桿菌屬和KD4-96_unclassified有益菌相對豐度。【結(jié)論】飼料中添加丁酸梭菌能顯著提高花鱸幼魚生長性能，提高消化、免疫和抗氧化能力，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)組成及其相對豐度，提高腸道菌群多樣性，以2.00%添加量效果最好。

關(guān)鍵詞：丁酸梭菌；花鱸；生長性能；免疫；消化；腸道菌群

中圖分類號：S965.211文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2024）02-0366-12

Effects ofdietary Clostridium butyricum supplementation on growth performance，immunity，digestion and intestinal microbiota ofjuvenile Lateolabraxmaculatus

XU Chuang-wen1-2，JIANG Kui2，YU Wei-3.4，LIN Hei-zhao1.4，WANG Peng-fei1，ZHAO Chao1，LIU Xi-yao2，YANG Keng·2

（'South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratoryof SouthChina Sea Fishery Resources Exploitationamp;Utilization，Ministry ofAgriculture and Rural Affairs/Guangdong Provincial Key Labo- ratory of Fishery Ecology and Environment，Guangzhou，Guangdong 510300，China;2Guangzhou Xinhailisheng Bio-technology Co.，Ltd.，Guangzhou，Guangdong 510300，China;3Sanya Tropical Fisheries Research Institute/Key Labo ratory of Efficient Utilizationand Processing of Marine Fishery Resources of Hainan Province，Sanya，Hainan 572426，China;fShenzhen Base of South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shen-zhen，Guangdong 518121，China）

Abstract：[Objective]This experiment was performed to investigate theeffects of dietary Clostridium butyricum on growth performance，digestion，immunity，antioxidant capacity and intestinal microbiota of juvenile Lateolabraxmacula-tus，and provide atheoretical basis for theapplication of C.butyricum in the culture of L.maculanus.【Method]Juvenile Lmaculatns was used as experiment material.Juvenile L.maculatus had been fed for 56 d with six diets containing 0（D0，control），0.25%（D1），0.50%（D2），1.00%（D3），2.00%（D4）and 4.00%（D5）C.butyricum.The growth performance intestinal digestive enzyme activity，serum biochemical and immune indicators，and intestinal morphology indicators of juvenile L.maculatus were measured，and thecompositionof intestinal microbiota was analyzed.[Result]The dietary C.butyricum could significantly reduce the feed coefficient（Plt;0.05，the same below），significantly improved final mean body weight of L.maculates，the weight gain rate（WGR），and specific growth rate（SGR）in D3，D4 and D5 groups were significantly higher than the D0 group.Compared with DO group，the activities of intestinal chymotrypsin，lipase were significantly increased in D4 group，while the contents of serum total cholesterol and triglyceride and the activities of glutamic oxalacetic transaminase and glutamic-pyruvic transaminase were significantly decreased.The activities of ly-sozyme，alkaline phosphatase and total nitric oxide synthase in D4 group were significantly higher than those in D0 group，and the activities of phenoloxidase in D3 group were significantly higher than thosein D0 group.Compared with D0 group，the catalase activity and total antioxidant capacity in D3 and D5 groups were significantly increased，the super-oxide dismutase activity in D4 group was significantly increased，and the malondialdehyde content was significantly de-creased.The intestinal muscle thickness and villusheight in D2，D3 and D5 groups were significantly higher than those in D0 group.The OTU number and Chaol index of the intestinal microflora of juvenile L.maculahus in D3 group were sig-nificantlyhigher than those in D0 group，and the Simpson index and Shannon index of the intestinal microflora in all test groups were significantly higher than those in D0 group.At the phylum level，C.butyricum reduced the relative abun-dance of Proteobacteria and Firmicutes.The relative abundance of Actinobacteriota，Planctomycetota，Acidobacteriota，Chloroflexi，Bacteroidota and Gemmatimonadota increased.At the genus level，C.butyricum decreased the relative abun-dance of harmful bacteria like Ralstonia，Enterovibrio and Vibrio，and increased the relative abundance of beneficial bac-teria like Arthrobacter and KD4-96_mclassified.[Conclusion]Adding C.butyricum in the dietary can significantly im-prove the growth performance，improve the digestion，immunity and antioxidant capacity of juvenile L.maculatus，regu-late the structure and relative abundance and improve the diversity of intestinal microbiota of juvenileL.maculatts.The best effect is to add 2.00%of Cbutyricum tothe dietary

Key words：Clostridium butyricum;Lateolabraxmaculatus;growth performance;immunity;digestion;intestinal

microbiota

Foundation items：Hainan Province Science and Technology Special Fund（ZDYF2022XDNY349）;Hainan Natural Science Foundation（321QN0942）;CentralPublic-interest Scientific InstitutionBasal ResearchFund，CAFS（2023TD21）;Shenzhen Scienceand Technology Project（JCYJ20230807150859010）

0引言

【研究意義】花鱸（Lateolabrax maculatus）又名七星鱸，主要分布于西北太平洋近岸、我國沿海及各大通海江河；屬于廣鹽廣溫性魚類，具有肉質(zhì)鮮美和生長快速的特點(diǎn)，是沿海地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一（虞為等，2021）。根據(jù)《2022中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》，2021年全國花鱸養(yǎng)殖總量19.91萬t，主要養(yǎng)殖地區(qū)為廣東、福建、浙江和山東（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局等，2022）。目前，由于水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化和用藥不當(dāng)，花鱸養(yǎng)殖過程中的病毒病、細(xì)菌病愈加頻發(fā)和復(fù)雜，導(dǎo)致花鱸出現(xiàn)腸炎、空腸、消化吸收率低等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響其生長性能和成活率 （De et al.，2014），制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展。探尋能改善花鱸腸道健康、促進(jìn)其生長和提高機(jī)體免疫功能的飼料添加劑，對花鱸養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】常青等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.50%和1.00%殼聚糖可顯著促進(jìn)花鱸生長，但不同添加濃度對成活率均無影響。胡曉偉等（2018）將低聚木糖添加至飼料中投喂花鱸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可顯著降低腸道沙門氏菌屬（Salmonella）細(xì)菌和大腸桿菌（Escherichia coli）數(shù)量，顯著增加雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）細(xì)菌數(shù)量。虞為等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加?；撬峥娠@著提高花鱸腸道蛋白酶和脂肪酶活性，并顯著提高溶菌酶活性及免疫球蛋白M和補(bǔ)體4濃度。丁酸梭菌（Clostridium buty-ricum）隸屬芽孢桿菌科（Bacillaceae）梭菌屬（Clos-tridium），丁酸、乙酸和丙酸等短鏈脂肪酸是其主要的代謝產(chǎn)物，通過β氧化作用進(jìn)行能量代謝，是養(yǎng)殖動物修復(fù)和再生腸道上皮細(xì)胞的主要能量來源（Cao et al.，2012;Junghareet al.，2012）。將適量丁酸梭菌添加至飼料中投喂養(yǎng)殖動物，不僅能幫助其保持腸道健康和提高細(xì)胞活力，還能使其提高粘蛋白分泌量，修復(fù)腸道黏膜并改善腸道通透性，恢復(fù)腸道的健康生理功能（Kanai et al.，2015;Tran et al.，2020）。近年來，丁酸梭菌已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，皖（Miichthys miiuy）（宋增福和吳天星，2007）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）（Duan et al.，2017;楊鏗等，2022）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）（樊英等，2019）、斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）（Duan et al.， 2019）、羅非魚（Oreochromis niloticus）（廖慶釗等，2021）、鯉（Cyprinus carpio）（Meng et al.，2021）、卵形鯧參（Trachinotus ovatus）（吳楊等，2022）和珍珠龍膽石斑魚（Epinephelusfuscoguttatus？×E.lanceola-tus d）（Yang et al.，2023）等養(yǎng)殖品種均有報道，相關(guān)研究結(jié)果表明丁酸梭菌能顯著提升養(yǎng)殖動物的生長性能和免疫功能，且能調(diào)節(jié)腸道菌群?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，花鱸飼料中殼聚糖、低聚木糖和?；撬岬忍砑觿?yīng)用已有報道（常青等，2006;胡曉偉等，2018;虞為等，2021），而丁酸梭菌作為一種能改善養(yǎng)殖動物腸道健康的飼料添加劑，其對花鱸的影響鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以花鱸幼魚為試驗(yàn)材料，在飼料中設(shè)不同丁酸梭菌添加量，測定其生長性能、腸道消化酶活性、血清生化和免疫指標(biāo)及腸道形態(tài)指標(biāo)，分析腸道菌群組成。探究丁酸梭菌對花鱸幼魚生長性能、消化、免疫和抗氧化能力及腸道菌群的影響，為丁酸梭菌在花鱸養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1飼料配方

丁酸梭菌菌液（1×109CFU/mL）由廣州市欣海利生生物科技有限公司提供。海水魚膨化配合飼料購自廣東粵海飼料集團(tuán)股份有限公司，作為花鱸基礎(chǔ)飼料，主要原料組成：魚粉、魚油、豆油、豆粕、面粉、硫酸二氫鈣、硫酸鋅、硫酸亞鐵、維生素A、維生素C、維生素D3、維生素E和葉酸等，其營養(yǎng)水平見表1。以不添加丁酸梭菌為對照組（D0），設(shè)試驗(yàn)組飼料丁酸梭菌添加量為0.25%（DI）、0.50%（D2）、1.00%（D3）、2.00%（D4）和4.00%（D5），每組3個平行。分別量取0、12.5、25.0、50.0、100.0和200.0 mL丁酸梭菌菌液置于燒杯，純凈水補(bǔ)足至1 L并攪拌均勻，與5kg基礎(chǔ)飼料充分混合均勻，-20℃密封保存。

1.2試驗(yàn)用魚及飼養(yǎng)管理

花鱸幼魚購自深圳市深海農(nóng)場海洋發(fā)展有限公司，在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳基地展開養(yǎng)殖試驗(yàn)，動物試驗(yàn)由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所動物倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號nhdf 2023-15。將花鱸幼魚置于池塘網(wǎng)箱中暫養(yǎng)1周，每天用基礎(chǔ)飼料飽食投喂2次，試驗(yàn)前禁食24 h，選取大小相近且活力較好的花鱸幼魚25尾（平均體質(zhì)量9.36±0.15 g），置于1.0 m×1.0 m×1.5m網(wǎng)箱內(nèi)養(yǎng)殖，共設(shè)18個網(wǎng)箱。各組每天6：00和17：00飽食投喂相應(yīng)飼料，投喂0.5 h后，收集浮于水面的剩余飼料并烘干稱量，記錄花鱸攝食量、體質(zhì)量和死亡尾數(shù)。養(yǎng)殖試驗(yàn)周期為56 d，水溫為（28.50±2.50）℃，pH為8.00±0.50，溶解氧gt;4.0 mg/L，氨氮lt;0.5 mg/L。

1.3樣品采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后禁食24 h，測量每個網(wǎng)箱內(nèi)全部花鱸體質(zhì)量并統(tǒng)計(jì)尾數(shù)；每個網(wǎng)箱隨機(jī)選取6尾魚，測量體長和體質(zhì)量，用經(jīng)1%肝素鈉潤洗的2 mL注射器尾部靜脈取血，4℃下4000 r/min離心10 min，上清液移至1.5 mL離心管，-80℃保存，用于測定血清生化指標(biāo)和免疫指標(biāo)。采血后進(jìn)行解剖，取內(nèi)臟團(tuán)和肝臟，稱量記錄質(zhì)量，肝臟置于10 mL離心管，-20℃保存；取1份腸道中腸，置于10.0 mL 4%多聚甲醛溶液中常溫保存，用于腸道組織切片制作；另取1份腸道后腸，置于10.0 mL保存液（1%0.5 mol/L EDTA，75%無水乙醇，24%無菌水）中-20℃保存，用于腸道菌群分析；將剩余腸道組織置于10 mL離心管中，-20℃保存，用于測定消化酶活性。

1.4測定指標(biāo)及方法

1.4.1生長性能測定按以下公式計(jì)算增重率（Weight gain rate，WGR）、特定生長率（Specific growth rate，SGR）、成活率（Survival rate，SR）、飼料系數(shù)（Feed conversion ratio，F(xiàn)CR）、肥滿度（Condition factor，CF）、臟體比（Viscerosomatic index，VSI）和肝體比（Hepa-tosomatic index，HSI）：

式中，W，為終末平均體質(zhì)量（g），W?為初始平均體質(zhì)量（g），d為試驗(yàn)天數(shù)，N，為終末尾數(shù)，N?為初始尾數(shù)，F(xiàn)為總攝食量（g），W?為體質(zhì)量（g），L為體長（cm），W為內(nèi)臟團(tuán)質(zhì)量（g），W為肝臟質(zhì)量（g）。

1.4.2腸道消化酶活性測定稱取腸道組織0.5g，置于預(yù)冷的2.0 mL 0.85%生理鹽水中剪碎，按10%（m/v）加入生理鹽水，冰水浴下3000 r/min機(jī)械勻漿 （10 s/次，連續(xù)2次），制成組織勻漿，2500 r/min離心10 min，取上清液，測定糜蛋白酶（Chymotrypsin）、脂肪酶（Lipase）和淀粉酶（Amylase）活性。

1.4.3血清生化和免疫指標(biāo)測定血清生化指標(biāo)總蛋白（TP）、總膽固醇（TCHO）、甘油三酯（TG）、尿酸（UC）含量和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）活性委托廣州新海醫(yī)院檢驗(yàn)中心測定，所用儀器為HITACHI-7180全自動生化分析儀[日立高新技術(shù)（上海）國際貿(mào)易有限公司]。采用南京建成生物工程研究所相應(yīng)試劑盒測定血清溶菌酶（LZM）、酚氧化酶（PO）、總一氧化氮合酶（TNOS）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）含量及總抗氧化能力（TAOC）。

1.4.4腸道組織切片制作及形態(tài)分析腸道組織切片制作、HE染色和顯微攝影委托武漢塞維爾生物科技有限公司進(jìn)行，使用CaseViewer測量腸道絨毛高度和肌層厚度。

1.4.5腸道菌群分析高通量測序分析委托廣州吉瑞基因科技有限公司進(jìn)行，使用引物515F（5'-GT GCCAGCMGCCGCGG-3'）和907R（5'-CCGTCAATT CMTTTRAGTTT-3'）對16S rDNA序列V4～V5區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，利用Ⅲumina Miseq平臺進(jìn)行測序分析，采用QIIME 1.9.1計(jì)算腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2021進(jìn)行整理，使用SPSS19.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），利用Duncan's法進(jìn)行多重比較分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2結(jié)果與分析

2.1生長性能測定結(jié)果

丁酸梭菌對花鱸幼魚生長性能的影響如表2所示。隨著丁酸梭菌添加量的升高，花鱸幼魚終末平均體質(zhì)量、增重率和特定生長率整體均呈先上升后下降的變化趨勢，飼料系數(shù)呈先下降后上升的變化趨勢。D1、D2、D3、D4和D5組終末平均體質(zhì)量均顯著高于D0組（Plt;0.05，下同），其中，D3組終末平均體質(zhì)量（28.07 g）最高，顯著高于D1和D2組；D3、D4和D5組的增重率及特定生長率均顯著高于D0組；D3和D4組飼料系數(shù)（1.33和1.39）均顯著低于DO組；D1、D2、D3和D4組成活率均顯著高于D0組；D4組臟體比（8.20%）最高，顯著高于D0組，各組間的肝體比和肥滿度均無顯著差異（Pgt;0.05，下同）。

2.2腸道消化酶活性測定結(jié)果

由表3可看出，花鱸幼魚腸道糜蛋白酶和脂肪酶活性隨著丁酸梭菌添加量的升高，均呈先上升后下降的變化趨勢，D4組腸道糜蛋白酶活性（0.99 U/mg）最高，顯著高于D0組（0.49 U/mg）;D3組腸道脂肪酶活性（8.02 U/g）最高，且D3和D4組腸道脂肪酶活性均顯著高于D0組；各組間腸道淀粉酶活性無顯著差異。

2.3血清生化指標(biāo)測定結(jié)果

丁酸梭菌對花鱸幼魚血清生化指標(biāo)的影響如表4所示，D1和D2組血清總蛋白含量均顯著高于D0、D3、D4及D5組；D3、D4和D5組總膽固醇含量均顯著低于D0、D1及D2組；D4和D5組血清甘油三酯含量（3.55和3.43 mmol/L）均顯著低于D0、D1及D2組；各組間尿酸含量無顯著差異；D4組谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性（45.00和9.00 U/L）均顯著低于D0、D1及D2組。表明添加適量丁酸梭菌能提高花鱸幼魚血清總蛋白含量，降低總膽固醇、甘油三酯含量和谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性。

2.4血清免疫指標(biāo)測定結(jié)果

如表5所示，隨著飼料中丁酸梭菌添加量的增加，花鱸幼魚血清溶菌酶活性呈先上升后下降的變化趨勢，且D3和D4組溶菌酶活性（73.19和78.61 U/mL）均顯著高于D0組（35.56 U/mL）;D3組血清酚氧化酶活性（0.46 U/mL）顯著高于D0組（0.19U/mL），其他試驗(yàn)組與D0組無顯著差異；D4組堿性磷酸酶活性（34.00 U/mL）顯著高于D0組（23.33 U/mL）;D2和D4組血清總一氧化氮合酶活性（30.65和30.58 U/mL）均顯著高于D0組。表明飼料中添加適量丁酸梭菌能提高花鱸幼魚血清溶菌酶、酚氧化酶、堿性磷酸酶和總一氧化氮合酶活性。

2.5血清抗氧化能力測定結(jié)果

如表6所示，隨著飼料中丁酸梭菌添加量的增加，花鱸幼魚血清超氧化物歧化酶活性呈上升趨勢，且D2（156.12 U/mL）、D3（157.05 U/mL）、D4（162.21 U/mL）和D5組（163.03 U/mL）均顯著高于D0組（147.37U/mL）;D1、D2、D3和D5組過氧化氫酶活性均顯著高于D0組，且D2和D3組均顯著高于D5組，D4與D0組無顯著差異；D4和D5組血清丙二醛含量（8.59和7.63 nmol/L）均顯著低于D0組（10.69nmol/L）;D3和D5組血清總抗氧化能力（75.18和70.26 U/mL）均顯著高于D0組（52.58 U/mL），其余試驗(yàn)組與D0組無顯著差異。表明飼料中添加適量丁酸梭菌能提高花鱸幼魚血清超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性和總抗氧化能力，降低丙二醛含量。

2.6腸道組織形態(tài)分析結(jié)果

花鱸幼魚腸道組織切片如圖1所示，不同丁酸梭菌添加量的花鱸腸道組織形態(tài)無明顯差異，均未發(fā)生明顯病變。對花鱸幼魚腸道組織形態(tài)指標(biāo)的測量結(jié)果如表7所示，D2、D3、D4及D5組的腸道肌層厚度均顯著高于D0和D1組；D2、D3及D5組的腸道絨毛高度均顯著高于D0、D1和D4組。

2.7腸道菌群分析結(jié)果

對花鱸幼魚腸道菌群進(jìn)行Alpha多樣性分析，結(jié)果如表8所示，各組檢測覆蓋度均為1.00;D3組花鱸幼魚腸道OTUs數(shù)量（1041.00）和Chaol指數(shù)（1042.72）均為最高，且均顯著高于D0組，D1、D2、D4和D5組間無顯著差異；各試驗(yàn)組花鱸幼魚腸道菌群Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均顯著高于D0組。

不同丁酸梭菌添加量的花鱸幼魚腸道菌群門分類水平相對豐度如圖2所示，變形菌門（Proteobacte-ria）、放線菌門（Actinobacteriota）、浮霉菌門（Plancto-mycetota）、酸桿菌門（Acidobacteriota）和綠彎菌門（Chloroflexi）等是花鱸幼魚腸道的主要菌門，各組間主要菌門組成基本一致，但相對豐度存在一定差異。各試驗(yàn)組變形菌門和厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度明顯低于D0組（57.94%和8.63%），放線菌門、浮霉菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、擬桿菌門（Bacteroidota）和芽單胞菌門（Gemmatimonadota）相對豐度均顯著高于D0組。各試驗(yàn)組厚壁菌門/擬桿菌門比值（2.78～5.38）明顯低于D0組（12.20）。

不同丁酸梭菌添加量的花鱸幼魚腸道菌群屬分類水平相對豐度如圖3所示，勞爾氏菌屬（Ralstonia）、腸弧菌屬（Enterovibrio）、弧菌屬（Vibrio）、Candidatus_Arthromitus和Vicinamibacteraceae_unclassified等是主要菌屬。其中D0組勞爾氏菌屬相對豐度（17.19%）、腸弧菌屬相對豐度（10.60%）、弧菌屬相對豐度（7.34%）和Candidatus_Arthromitus相對豐度（6.59%）均明顯高于各試驗(yàn)組，各試驗(yàn)組間無明顯差異。而各試驗(yàn)組中Vicinamibacteraceae_unclassified、Gemmatimonadaceae_unclassified、Actinobacteriota_unc-lassified、KD4-96_unclassified、JG30-KF-CM45unclassifed、小梨形菌屬（Pirellula）、節(jié)桿菌屬（Arthro-bacter）和芽球菌屬（Blastococcus）相對豐度均明顯高于D0組。

3討論

3.1丁酸梭菌對花鱸幼魚生長性能的影響

生長性能是反映動物機(jī)體代謝的綜合性指標(biāo)，丁酸梭菌作為飼料添加劑已在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中大量應(yīng)用，相關(guān)研究結(jié)果顯示其能顯著提高生長性能并降低飼料系數(shù)。在珍珠龍膽石斑魚（黃靈等，2016;何瑞鵬等，2017）、銀鯧（Pampus argenteus）（Gao et al.，2016）等養(yǎng)殖動物飼料中添加丁酸梭菌，均能提高生長性能并降低飼料系數(shù)，本研究結(jié)果與之相似。D3、D4和D5組終末平均體質(zhì)量、增重率及特定生長率均顯著高于D0組；D3和D4組飼料系數(shù)均顯著低于D0組。但隨著丁酸梭菌添加量的升高，花鱸幼魚生長性能呈先上升后下降的變化趨勢，綜合來看，2.00%添加量對生長性能的提升效果最好。推測飼料中的丁酸梭菌進(jìn)入花鱸幼魚腸道內(nèi)并定殖，所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物丁酸和丙酸等短鏈脂肪酸為腸道上皮細(xì)胞提供了能量，提升了腸道的消化吸收功能（吳楊等，2022）;但少量或過量的丁酸梭菌均會產(chǎn)生過多代謝產(chǎn)物，抑制機(jī)體相關(guān)生長因子，從而抑制機(jī)體的生長性能。本研究中，與D0組相比，D4組花鱸幼魚腸道糜蛋白酶和脂肪酶活性均顯著提高，隨著丁酸梭菌添加量的升高，糜蛋白酶和脂肪酶活性均呈先上升后下降的變化趨勢，與生長性能變化趨勢一致，腸道消化酶活性反映了丁酸梭菌對花鱸幼魚生長性能的影響，與李維康等（2022）添加丁酸梭菌能提高凡納濱對蝦腸道蛋白酶和脂肪酶活性的研究結(jié)果一致。推測進(jìn)入花鱸幼魚體內(nèi)的丁酸梭菌能分泌大量消化酶和維生素，提高了腸道消化酶活性，提高消化吸收能力，促進(jìn)了機(jī)體生長。

3.2丁酸梭菌對花鱸幼魚血清生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)是反映魚類健康狀態(tài)、營養(yǎng)水平和組織器官機(jī)能狀態(tài)的重要指標(biāo)（韓娜娜和史成銀，2010）。血清總蛋白含量與機(jī)體營養(yǎng)狀況和蛋白質(zhì)代謝水平有關(guān)，總蛋白含量越高，表明蛋白代謝越旺盛。血清總膽固醇和甘油三酯含量反映機(jī)體脂質(zhì)吸收水平和器官功能狀況，含量高則表明外源物質(zhì)對機(jī)體造成了負(fù)擔(dān)。血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性是反映肝臟功能的重要指標(biāo)，其活性與肝臟受損程度呈正相關(guān)，谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性越低，對魚類的生長越有利（Giannini et al.，2003）。葉海斌等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）和丁酸梭菌，虹鱒血清總膽固醇和甘油三酯含量顯著降低；覃美蘭等（2022）研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌能顯著降低吉富羅非魚血清總膽固醇含量，保障脂類代謝正常；王海瑞等（2022）研究發(fā)現(xiàn)，適量丁酸梭菌能顯著降低黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性；本研究中，與D0組相比，D1和D2組血清總蛋白含量均顯著提高，D4組血清總膽固醇、甘油三酯含量和谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性均顯著降低，與上述前人研究結(jié)果一致。表明適量丁酸梭菌能提高花鱸幼魚蛋白質(zhì)合成代謝，促進(jìn)脂質(zhì)吸收，保護(hù)肝臟健康。

3.3丁酸梭菌對花鱸幼魚免疫和抗氧化能力的影響

溶菌酶、酚氧化酶和總一氧化氮合酶等是魚類重要的非特異性免疫酶，溶菌酶的溶菌效應(yīng)是魚體防御細(xì)菌性病害的有效手段，溶菌酶活性的高低可反映魚體免疫力的強(qiáng)弱（虞為等，2021）;堿性磷酸酶活性是衡量機(jī)體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)之一，可用于魚類疾病診斷和生理活動分析（Dalvi et al.，2017）。宋會儀（2007）發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌能提高美國紅魚（Sciae-nops ocellatus）的酚氧化酶和堿性磷酸酶活性；王海瑞等（2022）研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌能顯著提高黃顙魚溶菌酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力；本研究中，D4組溶菌酶、堿性磷酸酶和總一氧化氮合酶活性均顯著高于D0組，D3組酚氧化酶活性顯著高于D0組，與宋會儀（2007）、王海瑞等（2022）研究結(jié)果相符。超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性可反映魚體抗氧化能力和氧自由基的代謝，高活性的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶可抑制氧自由基的形成；丙二醛含量則是脂質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)，反映了魚體活性氧的累積（Liet al.，2009）。飼料中添加丁酸梭菌能提高吉富羅非魚幼魚（覃美蘭等，2022）、羅非魚（李洪琴，2021）、凡納濱對蝦（陽田恬等，2022）和中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）幼蟹（彭佳慧，2023）超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力，降低丙二醛含量。本研究中，與D0組相比，D3和D5組過氧化氫酶活性及總抗氧化能力均顯著提高，D4組超氧化物歧化酶活性顯著提高，丙二醛含量顯著降低，與上述前人研究結(jié)果相似。推測丁酸梭菌代謝分泌的丁酸鹽和氫氣能與自由基相結(jié)合，減少氧化應(yīng)激；同時丁酸梭菌能代謝產(chǎn)生超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等，提高魚體抗氧化酶活性。

3.4丁酸梭菌對花鱸幼魚腸道菌群的影響

本研究中，D2、D3和D5組花鱸幼魚腸道肌層厚度及腸絨毛高度均顯著高于D0組，與Duan等（2017）丁酸梭菌能顯著提高凡納濱對蝦腸道絨毛高度的研究結(jié)果相符。魚類腸道包含復(fù)雜、多樣的動態(tài)微生物群落，相對穩(wěn)定的腸道微生物群落能為魚體提供外源消化酶分解吸收食物，保障正常的消化和吸收功能，促進(jìn)魚體健康生長（Ray et al.，2012）。吳楊等（2022）研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加丁酸梭菌能提高卵形鯧參腸道菌群Chao1和Shannon指數(shù)；本研究中，D3組花鱸幼魚腸道菌群OTU數(shù)量和Chaol指數(shù)均顯著高于D0組，所有試驗(yàn)組花鱸幼魚腸道菌群Simpson和Shannon指數(shù)均顯著高于D0組，表明丁酸梭菌提高了腸道菌群多樣性，與吳楊等（2022）研究結(jié)果相符。魚體受外源餌料或環(huán)境改變刺激時，正常微生物群落紊亂，條件致病菌定殖、爆發(fā)，引起魚體器官病變和腸炎、消化吸收障礙等疾?。╲an Doan et al.，2014）。在門分類水平上，變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和放線菌門是魚類腸道菌群的主要組成，其中變形菌門最為主要（孫永旭等，2019）;變形菌門豐度過高，會打破魚類腸道微生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定，引起腸炎等疾病，也是造成機(jī)體腐敗的主要細(xì)菌門（韓少鋒，2010）。本研究中，丁酸梭菌降低了變形菌門和厚壁菌門相對豐度，提高了放線菌門、浮霉菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、擬桿菌門和芽單胞菌門相對豐度，表明丁酸梭菌抑制了部分有害菌生長，與虹鱒（樊英等，2019）和羅非魚（Liet al.，2019）等其他魚類的研究結(jié)果相似。此外，厚壁菌門/擬桿菌門比值與腸道炎癥和肥胖有關(guān)，比值越高炎癥率越大（Turnbaugh et al.，2006），本研究中各試驗(yàn)組比值均明顯低于DO組，表明丁酸梭菌降低了花鱸幼魚腸道有害菌相對豐度，保護(hù)和改善了腸道健康。

在屬分類水平上，發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）、鯨桿菌屬（Cetobacterium）、梭菌屬和弧菌屬是花鱸腸道的主要優(yōu)勢菌屬（林能鋒等，2021）?；【鷮倌芤痧B(yǎng)殖動物腸炎和白便等疾病，影響機(jī)體生長性能和健康狀況（曹海鵬等，2016）。本研究中，各試驗(yàn)組花鱸腸道勞爾氏菌屬、腸弧菌屬和弧菌屬相對豐度均顯著低于D0組，表明添加丁酸梭菌能降低有害菌相對豐度，與楊鏗等（2022）關(guān)于凡納濱對蝦的研究結(jié)果一致。丁酸梭菌能促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸菌等有益菌繁殖，抑制大腸桿菌（Escherichia coli）等致病菌繁殖，宋增福和吳天星（2007）研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌C?菌株可促進(jìn)晚中腸和后腸雙歧桿菌繁殖，假單胞菌屬成優(yōu)勢屬，同時抑制大腸桿菌生長，顯著降低腸產(chǎn)氣桿菌屬（Enterobacter）、短桿菌屬（Brevibacte-rium）和不動桿菌屬（Acinetobacter）等豐度。朱振祥（2019）研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌能提高鯉腸道擬桿菌屬（Bacteroides）豐度，且二者呈正相關(guān)。農(nóng)斯偉等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌能顯著提高黃雞腸道內(nèi)乳桿菌屬（Lactobacillus）和梭菌屬的有益菌豐度。

節(jié)桿菌屬對甲基對硫磷和草甘膦的降解效果顯著，且部分菌株具有腐殖質(zhì)還原特性，在水產(chǎn)等農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景（李海雷等，2008;葉明等，2009;陳楠等，2013）。綠彎菌門KD4-96細(xì)菌為有益菌，對磷的溶解釋放具有促進(jìn)作用，與總磷呈正相關(guān)（Eo and Park，2016;Chen et al.，2021）。本研究中，丁酸梭菌顯著提高了花鱸腸道提高了節(jié)桿菌屬和KD4-96_unclassified有益菌相對豐度。推測丁酸梭菌進(jìn)入花鱸腸道后，改變了腸道菌群結(jié)構(gòu)，其分泌的代謝產(chǎn)物為有益菌提供能量，促進(jìn)其增殖；破壞有害菌的適宜生存環(huán)境，從而抑制有害菌的繁殖，降低其相對豐度。

4結(jié)論

飼料中添加丁酸梭菌能顯著提高花鱸幼魚生長性能，提高消化、免疫和抗氧化能力，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)組成及其相對豐度，提高腸道菌群多樣性，以2.00%添加量效果最好。

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（責(zé)任編輯 劉可丹）