蘆筍SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化及驗證

摘" " 要：以蘆筍幼葉為材料，采用單因素與L16（43）正交試驗相結(jié)合的方法，對影響蘆筍SSR-PCR反應(yīng)的3個因素（2×Taq Master Mix，模板DNA，引物）進行優(yōu)化，并以此為基礎(chǔ)通過退火溫度和循環(huán)次數(shù)試驗篩選引物最佳退火溫度和循環(huán)次數(shù)。結(jié)果表明，蘆筍基因組DNA的SSR-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系為：10 μL反應(yīng)體系中，50 ng·μL-1 DNA模板0.125 μL，10 μmol·L-1 上下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR Mix 3 μL，滅菌ddH2O 5.875 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，循環(huán)25次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。經(jīng)5對引物組合和5個不同蘆筍品種DNA擴增驗證，該體系穩(wěn)定可靠，可用于蘆筍遺傳多樣性分析、種子純度鑒定、分子標記輔助育種及重要農(nóng)藝性狀的圖位克隆等工作。

關(guān)鍵詞：蘆筍；SSR-PCR反應(yīng)體系；正交設(shè)計

中圖分類號：S644.6 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）07-100-07

Optimization and validation of SSR-PCR reaction system for Asparagus officinalis L.

BAI Yang， YI Zehui

（College of Horticulture， Shanxi Agricultual University， Taiyuan 030031， Shanxi， China）

Abstract： Based on DNA of asparagus young leaves， a single factor screening test combined with a L16（43） orthogonal design method was employed to optimize the factors of 2×Taq Master Mix， template DNA， and primer combination applied for SSR-PCR and followed by gradient annealing temperature test and gradient cycle times test to screening the optimum annealing temperature and cycle numbers. The results showed that the optimal SSR-PCR system for asparagus included 50 ng·μL-1 DNA template 0.125 μL， 10 μmol·L-1 primers 0.5 μL， 2×Taq PCR Mix 3 μL， sterilized ddH2O 5.875 μL， with a total reaction volume of 10 μL. The PCR amplification procedure for asparagus was： 94 ℃ pre-denaturation for 4 min， 94 ℃ denaturation for 30 s， 60 ℃ annealing 30 s， 72 ℃ renaturation for 35 s， 25 cycles， 72 ℃ extension for 10 min， 4 ℃ for storage. This reaction system was proved to be stable and reliable by PCR amplification with 5 pairs of primer combinations and DNA templates of five different asparagus cultivars. The optimized SSR-PCR reaction system could be satisfactorily used for genetic diversity analysis， seed purity identification， marker-assisted breeding and map-based cloning of important agronomic traits of asparagus.

Key words： Asparagus officinalis; SSR-PCR reaction system; Orthogonal design

蘆筍又名石刁柏，為天門冬科天門冬屬多年生草本植物，富含礦物質(zhì)、多糖、皂苷、氨基酸、維生素和蘆丁等多種營養(yǎng)成分，具有抗氧化、降血糖、降血脂、提高免疫力等多種藥理功能，深受國內(nèi)外關(guān)注，被譽為“蔬菜之王”[1-4]。目前，我國已成為世界第一大蘆筍生產(chǎn)國和出口國，經(jīng)濟效益顯著。然而，我國蘆筍育種起步較晚，技術(shù)滯后，缺乏擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良品種，生產(chǎn)上仍以國外品種為主，如阿波羅、格蘭德、紫色激情等，已成為影響我國蘆筍產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一[5]。

分子標記是對DNA進行檢測，實現(xiàn)了對基因型的直接選擇，具有多態(tài)性豐富、鑒定方法簡捷、準確性高等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于作物的分子生物學(xué)和遺傳育種研究[6-7]。簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）是由1～6個核苷酸組成的基序，經(jīng)多次重復(fù)形成的DNA片段[8]。與RAPD、SRAP等分子標記相比，SSR標記具有分布廣泛、多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性和操作簡便等優(yōu)點[9]，已廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析[10]、分子標記輔助育種[11-12]及重要農(nóng)藝性狀定位[13-14]等領(lǐng)域。SSR標記屬于PCR標記類型，檢測結(jié)果易受Taq聚合酶、引物、模板、Mg2+和dNTPs等諸多因素影響。因此，開展蘆筍SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化至關(guān)重要，可為SSR分子標記應(yīng)用于蘆筍種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、分子標記輔助育種和重要農(nóng)藝性狀的圖位克隆奠定基礎(chǔ)，對加速蘆筍新品種選育和優(yōu)異基因挖掘具有重要意義。目前，前人已經(jīng)對多個物種開展了SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化研究，如木麻黃[15]、云南草果[16]、白及[17]、短絲木犀[18]等，發(fā)現(xiàn)不同物種的最優(yōu)反應(yīng)體系各異，具有一定的物種特異性。然而，SSR分子標記在蘆筍中的應(yīng)用研究進展緩慢，僅有部分基于EST序列和基因組序列的SSR標記開發(fā)的報道[1，19-20]，且彼此間反應(yīng)體系存在較大差異，尚未見關(guān)于蘆筍SSR反應(yīng)體系優(yōu)化的研究報道，尤其是現(xiàn)今廣為應(yīng)用的PCR Mix。

鑒于上述背景，筆者以PCR Mix為基礎(chǔ)，采用正交設(shè)計對SSR-PCR反應(yīng)體系中的PCR Mix、引物和模板進行優(yōu)化，并以此為基礎(chǔ)對擴增程序中的退火溫度和循環(huán)次數(shù)進行進一步優(yōu)化，以期獲得適用于蘆筍的穩(wěn)定性高、重復(fù)性好的反應(yīng)體系，為SSR標記應(yīng)用于蘆筍的遺傳育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以冠軍、TC、京綠蘆1號、特立龍和新科2030共5個蘆筍品種為試驗材料，其中冠軍和TC來自山東省濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，京綠蘆1號來自北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所，特利龍和新科2030來自美國沃克兄弟公司。試驗于2020年6月30日開始，種子經(jīng)3% NaClO溶液消毒后，采用40 ℃溫水浸種48 h后催芽，待大部分種子露白時，采用32孔穴盤育苗，基質(zhì)配比為V椰糠∶V草炭∶V蛭石∶V珍珠巖=2∶1∶1∶1。幼苗期每個品種隨機選擇5株采集健康、新鮮幼葉，液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱備用。試驗用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒和SanTaq Plus PCR Mix預(yù)混液均購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 蘆筍基因組提取與檢測

參照Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒說明提取蘆筍DNA，經(jīng)微量紫外分光光度計檢測，其質(zhì)量濃度范圍為452.3～625.8 ng·μL-1，OD260/OD280比值在1.82～2.02；經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA條帶清晰明亮、無彌散，可用于后續(xù)PCR擴增。采用ddH2O將DNA質(zhì)量濃度稀釋至50 ng·μL-1，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 SSR引物來源及篩選

以3個蘆筍品種冠軍、TC、京綠蘆1號DNA為模板，隨機挑選馬振川[1]開發(fā)的蘆筍EST-SSR引物5對（表1），委托上海生工生物工程有限公司合成。參照胡一凡等[16]PCR反應(yīng)體系并略作修改，10 μL體系具體包括：50 ng·μL-1 DNA模板0.5 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR Mix 4 μL，滅菌ddH2O 4.5 μL。PCR擴增程序參照馬振川[1]的報道并略作修改，具體為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 蘆筍SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

1.4.1 單因素試驗 在初篩試驗基礎(chǔ)上，以條帶明亮、雜帶較少的冠軍品種DNA為模板、LS6組合為引物，對影響PCR反應(yīng)的3個主要因素（2×Taq PCR Mix、引物和模板）進行單因素優(yōu)化，其中引物濃度10 μmol·L-1，DNA質(zhì)量濃度50 ng·μL-1。以初篩試驗的PCR體系為基礎(chǔ)組成，設(shè)置8個梯度的單因素試驗（表2），用ddH2O補齊10 μL，分別篩選2×Taq PCR Mix、引物和模板的最適用量。擴增程序同1.3，設(shè)3次重復(fù)。采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測擴增產(chǎn)物，分別用0.2% AgNO3和1.5% NaOH溶液進行染色和顯色。

1.4.2 正交優(yōu)化試驗 經(jīng)單因素試驗，分別選取3個影響因素中擴增效果較好的4個水平，即2×Taq PCR Mix為1.000、2.000、3.000和4.000 μL；50 ng·μL-1 DNA模板為0.125、0.250、0.500和0.625 μL；10 μmol·L-1引物為0.125、0.250、0.375和0.500 μL。采用L16（43）設(shè)計3因素4水平正交試驗（表3），篩選最優(yōu)組合，每個組合3次重復(fù)。擴增產(chǎn)物檢測方法同1.4.1。

1.5 蘆筍SSR-PCR退火溫度和循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化

以最優(yōu)PCR體系為基礎(chǔ)，優(yōu)化LS6引物組合的PCR擴增程序，設(shè)置退火溫度和循環(huán)次數(shù)的單因素試驗，篩選最適退火溫度和循環(huán)次數(shù)。設(shè)置54、56、58、60和62 ℃共5個退火溫度，選取目標條帶清晰、雜帶較少的為最適退火溫度。采用最適退火溫度，設(shè)置20、25、30、35和40次循環(huán)，選擇條帶清晰、雜帶較少的最少循環(huán)次數(shù)為最適循環(huán)次數(shù)。

1.6 蘆筍SSR-PCR最佳反應(yīng)體系的驗證

基于優(yōu)化后的SSR-PCR反應(yīng)體系和擴增程序，用5對SSR引物組合對5個蘆筍品種DNA模板進行擴增，以檢測最佳反應(yīng)體系的穩(wěn)定性和通用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物及模板初步篩選

由圖1可知，引物組合LS23和LS20擴增條帶亮度和清晰度較低，且存在部分模板未擴增出目標條帶的現(xiàn)象；引物組合LS13和LS22擴增條帶亮度和清晰度最高，但是均存在不同程度的雜帶；引物組合LS6條帶較為清晰，未發(fā)現(xiàn)明顯雜帶，且以冠軍DNA為模板的條帶亮度和清晰度明顯優(yōu)于京綠蘆1號和特立龍。因此，選擇冠軍DNA和LS6引物組合進行后續(xù)PCR反應(yīng)體系優(yōu)化試驗。

2.2 蘆筍SSR-PCR反應(yīng)體系的單因素試驗

由圖2可知，2×Taq PCR Mix、引物和模板用量均會對蘆筍SSR-PCR擴增效果產(chǎn)生明顯影響。在2×Taq PCR Mix單因素試驗中，1～4水平初始用量的反應(yīng)體系均可明顯擴增出目標條帶，其中，1/2倍用量條帶清晰且雜帶較3/4和1倍體系少。因此，10 μL PCR反應(yīng)體系中2×Taq PCR Mix最佳用量為2 μL；引物單因素試驗中，8個引物用量的體系均可擴增出目的條帶，其中2～4水平用量體系的目標條帶最為清晰?？紤]引物用量的經(jīng)濟適用性，以0.25 μL為引物最佳用量；模板DNA單因素試驗中，8個用量的反應(yīng)體系均可清晰擴增出目標條帶，1～3、5～6、8水平初始用量的反應(yīng)體系條帶清晰度基本一致，明顯優(yōu)于4和7水平用量，且1和2水平用量的雜帶較少。基于經(jīng)濟節(jié)約原則，10 μL PCR反應(yīng)體系中DNA最佳用量為0.125 μL。綜上可知，10 μL PCR反應(yīng)體系中2×Taq PCR Mix、10 μmol·L-1引物和50 ng·μL-1 模板的最適用量分別為2、0.25和0.125 μL。

2.3 蘆筍SSR-PCR反應(yīng)體系的正交試驗

由圖3可知，16個正交組合處理的擴增結(jié)果具有較大差異。組合1～5沒有擴增出目標條帶，組合6、7、8、11、13和15目標條帶清晰度偏低，組合9、10、12、14和16目標條帶較為清晰。就目標條帶清晰度而言，組合9、14和16的清晰度相似，明顯高于組合10、12。同時，組合9的雜帶明顯弱于組合14和16。因此，選擇組合9為蘆筍SSR擴增的最優(yōu)體系，即10 μL反應(yīng)體系組成為：50 ng·μL-1 DNA模板0.125 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR Mix 3 μL，滅菌ddH2O 5.875 μL。

2.4 蘆筍SSR-PCR退火溫度試驗

由圖4可知，退火溫度對引物組合LS6的PCR擴增結(jié)果具有一定影響。退火溫度為54～60 ℃時，PCR擴增的目標條帶較為清晰，且均具有一定雜帶，但不影響主帶識別；退火溫度為62 ℃時，目標條帶清晰度大幅降低。因此，基于相同擴增效果選擇較高退火溫度的原則，選擇60 ℃為LS6引物組合的最適退火溫度。

2.5 蘆筍SSR-PCR循環(huán)次數(shù)試驗

由圖5可知，循環(huán)次數(shù)可明顯影響引物組合LS6的PCR擴增結(jié)果。循環(huán)次數(shù)為30、35和40次時，PCR擴增的目標條帶較為清晰，但雜帶較多，影響擴增結(jié)果識別；循環(huán)次數(shù)為20次時，雜帶明顯消失，但目標條帶清晰度也隨之大幅下降；循環(huán)次數(shù)為25次時，PCR擴增的目標條帶較為清晰，同時雜帶清晰度也明顯低于30、35和40次循環(huán)。因此，選擇25次為引物組合LS6的最適循環(huán)次數(shù)。

2.6 蘆筍SSR-PCR最佳反應(yīng)體系的驗證

依據(jù)優(yōu)化試驗獲得的最適體系（50 ng·μL-1 DNA模板0.125 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR Mix 3 μL，滅菌ddH2O 5.875 μL）擴增程序（94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，循環(huán)25次，72 ℃延伸10 min），采用LS6、LS13、LS20、LS22和LS23引物組合對5個蘆筍品種的基因組DNA進行擴增。結(jié)果表明（圖6），引物組合LS6、LS13、LS22和LS23均可在5個蘆筍品種中擴增出相應(yīng)目標條帶，且條帶清晰、易辨；引物組合LS20在5個模板中沒有擴增出目標條帶，僅有部分非特異性條帶被擴增，可能是由于引物特異性不高所致。綜上所述，篩選出的反應(yīng)體系及擴增程序具有較高的穩(wěn)定性和較好的重現(xiàn)性，可用于蘆筍及近緣物種的SSR-PCR擴增反應(yīng)。

3 討論與結(jié)論

與RAPD、SRAP等傳統(tǒng)分子標記相比，SSR標記具有操作簡便、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好、共顯性等優(yōu)勢，已在植物遺傳育種研究中發(fā)揮重要作用[6-7]。SSR標記以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，鑒定結(jié)果易受PCR反應(yīng)體系及擴增程序影響，且不同物種對PCR反應(yīng)體系的要求各異[15-18]。因此，通過優(yōu)化試驗獲取蘆筍最優(yōu)反應(yīng)體系是利用SSR分子標記開展分子育種研究的前提和基礎(chǔ)。

Taq聚合酶、引物、模板、Mg2+和dNTPs是影響PCR擴增效果的主要因素[15]。2×Taq PCR Mix包含了PCR反應(yīng)體系所需的Taq聚合酶、Mg2+、dNTPs和Buffer緩沖液，極大簡化了試驗程序，縮短試驗操作時間，在大規(guī)模的分子標記鑒定中具有廣闊的應(yīng)用前景[17]。因此，筆者選擇2×Taq PCR Mix、模板DNA和引物為3個設(shè)計因素。單因素試驗結(jié)果表明，2×Taq PCR Mix對PCR反應(yīng)的影響最為明顯，其次為DNA和引物濃度，本試驗結(jié)果與徐德林等[17]的研究結(jié)果一致，而與錢慧蓉等[18]和蔣小剛等[21]的研究結(jié)果不太一致。這說明不同物種對PCR因素的靈敏度不同，對不同物種進行SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化至關(guān)重要。目前，SSR-PCR體系優(yōu)化的方法主要有完全組合、正交設(shè)計和響應(yīng)面法。筆者在單因素試驗的基礎(chǔ)上，又通過正交試驗設(shè)計并利用直觀分析方法對影響蘆筍SSR-PCR反應(yīng)的3個因素進行了優(yōu)化，確定了最優(yōu)反應(yīng)體系。而徐德林等[17]則利用響應(yīng)面法對白及SSR-PCR反應(yīng)體系進行了優(yōu)化，獲得了擬合方程模型及最優(yōu)體系。正交設(shè)計法具有試驗組數(shù)少、簡便高效、布點均衡等優(yōu)點，但精準度不及響應(yīng)面法，較適用于對精度要求不太高的試驗；響應(yīng)面法則需要通過更多試驗組合的得分情況對方程模型進行擬合及響應(yīng)值預(yù)測，工作量較大[22]。采用正交設(shè)計法即可完全滿足SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化試驗需求。首先，對各試驗組的評價以人工識別擴增條帶為主，未涉及到具體數(shù)值測量；其次，優(yōu)化的反應(yīng)體系穩(wěn)定性好，條帶明亮，清晰易辨。

退火溫度和循環(huán)次數(shù)對PCR擴增產(chǎn)物均具有明顯影響，其中，退火溫度決定了PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量和特異性，循環(huán)次數(shù)決定了PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量和擴增時間。退火溫度過高容易影響引物與模板DNA的緊密結(jié)合；溫度過低則易發(fā)生引物與模板DNA錯配從而導(dǎo)致非特異性擴增，影響目標條帶識別[23]。在本研究中，退火溫度為54～60 ℃條件下，擴增效果基本相同，選擇60 ℃為LS6引物組合的最佳退火溫度。因此，有必要對每條引物的最佳退火溫度進行篩選，尤其是特異性低的引物組合。PCR擴增的循環(huán)次數(shù)與產(chǎn)物產(chǎn)量和擴增時間成正比。在本研究中，循環(huán)次數(shù)為25次時的擴增條帶清晰易辨，且雜帶較少，在一定程度上節(jié)約了PCR擴增時間。

筆者優(yōu)化獲得了適用于蘆筍基因組DNA的SSR-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系，10 μL反應(yīng)體系具體包括50 ng·μL-1 DNA模板0.125 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR Mix 3 μL，滅菌ddH2O 5.875 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，循環(huán)25次，72 ℃延伸10 min。該體系經(jīng)隨機選擇的不同引物和不同模板DNA驗證，除LS20引物特異性不明顯外，其他均可擴增出重復(fù)性好、清晰易辨的條帶，表明該體系穩(wěn)定、可靠。可為今后SSR標記應(yīng)用于蘆筍遺傳多樣性分析、種子純度鑒定、分子標記輔助育種及重要農(nóng)藝性狀的圖位克隆等工作奠定基礎(chǔ)。

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收稿日期：2023-02-16；修回日期：2024-02-24

基金項目：山西省高?？萍紕?chuàng)新項目（2022L104）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新研究課題（YCX2020YQ07）

作者簡介：白" " 揚，女，助理研究員，研究方向為蔬菜育種及生物技術(shù)。E-mail：baiy5502@163.com

通信作者：儀澤會，男，助理研究員，研究方向為蔬菜育種及生物技術(shù)。E-mail：yizehui2008bj@163.com