上皮性卵巢癌中ERCC1及轉(zhuǎn)錄因子Nanog蛋白的表達水平及意義

［摘 要］目的 探討上皮性卵巢癌中核昔酸切除修復(fù)交叉互補組1（ERCC1）及轉(zhuǎn)錄因子Nanog蛋白的表達水平及意義。方法 收集2019年1月至2022年12月在連云港市腫瘤醫(yī)院婦科行卵巢手術(shù)切除的組織標本，其中上皮性卵巢癌組織標本101例（上皮性卵巢癌組），良性卵巢腫瘤組織標本80例（對照組），采用免疫組化檢測ERCC1及Nanog蛋白表達水平，并分析與臨床病理指標的關(guān)系。分別用0mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L不同濃度的順鉑處理人卵巢癌OVCAR-3細胞24h，以Western blot檢測細胞中ERCC1、Nanog蛋白的相對表達量，比較兩組間ERCC1及Nanog蛋白的表達水平。結(jié)果 上皮性卵巢癌組ERCC1、Nanog蛋白的陽性率均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2值分別為49.960、39.941，Plt;0.05）。Spearman相關(guān)性分析顯示，上皮性卵巢癌組中ERCC1與Nanog蛋白表達水平呈正相關(guān)（r=0.463，Plt;0.01）；對照組中ERCC1與Nanog蛋白表達水平無相關(guān)性（r=0.125，Pgt;0.05）。在上皮性卵巢癌臨床病理指標中，F(xiàn)IGO分期為Ⅲ+Ⅳ期的ERCC1、Nanog蛋白的陽性率均明顯高于Ⅰ+Ⅱ期（χ2值分別為9.578、9.756），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的ERCC1、Nanog蛋白陽性率均明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性（χ2值分別為3.018、2.389），經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。1mg/L、2mg/L、4mg/L濃度順鉑處理的ERCC1和Nanog蛋白相對表達量均明顯高于0mg/L濃度順鉑處理的相對表達量，經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F值分別為8.564、6.571，Plt;0.05）；在ERCC1、Nanog蛋白相對表達量中，順鉑處理濃度1mg/L與0mg/L相比（t值分別為17.236、5.381）、順鉑處理濃度2mg/L與0mg/L相比（t值分別為5.621、6.380）、順鉑處理濃度4mg/L與0mg/L相比（t值分別為12.813、6.810），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）；且隨順鉑濃度的增加，ERCC1、Nanog蛋白相對表達量逐漸升高。結(jié)論 ERCC1及Nanog蛋白在上皮性卵巢癌中呈現(xiàn)出高表達，可能與該病的發(fā)病機理和病情發(fā)展具有相關(guān)性。順鉑可誘導(dǎo)卵巢癌細胞ERCC1及Nanog蛋白高表達，可能為化療耐藥的潛在機制。

［關(guān)鍵詞］上皮性卵巢癌；核昔酸切除修復(fù)交叉互補組1；Nanog蛋白；耐藥性

Doi：10.3969/j.issn.1673-5293.2024.08.005

［中圖分類號］R173""nbsp; ［文獻標識碼］A

［文章編號］1673-5293（2024）08-0032-06

Expression levels of ERCC1 and transcription factor Nanog protein

in epithelial ovarian cancer and their significance

LIU Huiling，CHEN Yingxiu，LI Jing，LI Dazhong

（Department of Gynaecology，Lianyungang Municipal Cancer Hospital，Jiangsu Lianyungang 222000，China）

［Abstract］ Objective To explore expression levels and significance of ERCC1 and transcription factor Nanog protein in epithelial ovarian cancer. Methods 181 tissue specimens of patients who underwent ovarian surgery in Lianyungang Municipal Cancer Hospital from January 2019 to December 2022 were collected，including 101 specimens of epithelial ovarian cancer （epithelial ovarian cancer group） and 80 specimens of benign ovarian tumors （control group）.Immunohistochemistry was used to detect expression levels of ERCC1 and Nanog protein，and their relationships with clinicopathological indexes were analyzed.OVCAR-3 cells were treated with different concentrations （0mg/L，1mg/L，2mg/L and 4mg/L） of cisplatin for 24 hours，and Western blot method was used to detect relative expression levels of ERCC1 and Nanog protein in the cells.The differences in expression levels of ERCC1 and Nanog protein between the two groups were compared. Results The positive expression rates of ERCC1 and Nanog protein in the epithelial ovarian cancer group were significantly higher than those in the control group，and the differences were statistically significant （t=49.960 and 39.941 respectively，both Plt;0.05）.Spearman correlation analysis showed that in the epithelial ovarian cancer group，the expression level of ERCC1 was positively correlated with that of Nanog protein （r=0.463，Plt;0.01）;while there was no correlation between the expression level of ERCC1 and the expression level of Nanog protein in the control group （r=0.125，Pgt;0.05）.The positive rates of ERCC1 and Nanog protein in these ovarian cancer tissues with FIGO stage Ⅲ+Ⅳ were significantly higher than those in those ovarian cancer tissues with FIGO stage Ⅰ+Ⅱ （χ2=9.578 and 9.756 respectively），and the positive rates of ERCC1 and Nanog protein in these ovarian cancer tissues with positive lymph node metastasis were significantly higher than those in those ovarian cancer tissues without lymph node metastasis （χ2=3.018 and 2.389 respectively），and the differences were statistically significant （all Plt;0.05）.After 24 hours of treatment with different concentrations of cisplatin on OVCAR-3 cells，the relative expression levels of ERCC1 and Nanog protein in the 1mg/L，2mg/L and 4mg/L of cisplatin treated OVCAR-3 cells groups were significantly higher than those in the 0mg/L of cisplatin treated OVCAR-3 cells group，and the differences were statistically significant （F=8.564 and 6.571 respectively，both Plt;0.05）.In the relative expression amounts of ERCC1 and Nanog protein，there were significant differences between the 1mg/L of cisplatin treated OVCAR-3 cells group and 0mg/L of cisplatin treated OVCAR-3 cells group （t=17.236 and 5.381 respectively），between the 2mg/L of cisplatin treated OVCAR-3 cells group and 0mg/L of cisplatin treated OVCAR-3 cells group （t=5.621 and 6.380 respectively），and between the 4mg/L of cisplatin treated OVCAR-3 cells group and 0mg/L of cisplatin treated OVCAR-3 cells group （t=12.813 and 6.810 respectively），and the differences were statistically significant （all Plt;0.05）.And with increase in cisplatin concentration，the relative expression amounts of ERCC1 and Nanog protein gradually increased. Conclusion ERCC1 and Nanog are highly expressed in epithelial ovarian cancer，which may be related to the pathogenesis and the progression of the disease.Cisplatin can induce high expressions of ERCC1 and Nanog protein in ovarian cancer cells，which may be a potential mechanism of chemotherapy resistance.

［Key words］ epithelial ovarian cancer;nucleotide excision repair cross complementation group 1;Nanog protein;drug resistance

上皮性卵巢癌是婦科常見惡性疾病，該病致死率居高于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌等婦科腫瘤［1］。因該病患者病情確診時多處于晚期，且化療耐藥性的發(fā)生率很高，導(dǎo)致5年生存率低于50%［2］。核昔酸切除修復(fù)交叉互補組1（nucleotide excision repair cross complementation group 1，ERCC1）是一種DNA損傷修復(fù)基因，在核苷酸、堿基切除修復(fù)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，還參與端粒長度的調(diào)節(jié)［3］。有研究顯示，轉(zhuǎn)錄因子Nanog蛋白多表達于胚胎干細胞，病理狀態(tài)下可表達于成體組織［4-5］，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用受到廣泛關(guān)注。本研究以上皮性卵巢癌患者病灶組織為研究材料，分析上皮性卵巢癌組織中ERCC1、Nanog蛋白表達量及與臨床病理指標的關(guān)系；并用不同濃度的順鉑處理人卵巢癌細胞OVCAR-3，探討化療對ERCC1、Nanog蛋白基因表達的影響。

1研究對象與方法

1.1研究對象

收集2019年1月至2022年12月間在連云港市腫瘤醫(yī)院婦科行卵巢手術(shù)切除患者的組織標本；將101例上皮性卵巢癌組織標本作為上皮性卵巢癌組，80例良性卵巢腫瘤組織標本作為對照組。上皮性卵巢癌患者的年齡為45～65歲，平均（45.31±7.33）歲，腫瘤直徑為5～12cm，平均（7.10±1.11）cm，BMI為18.5～24.0kg/m2，平均（23.14±2.11）kg/m2；對照組患者的年齡為44～66歲，平均（45.17±7.15）歲，腫瘤直徑為5～10cm，平均（6.85±1.01）cm，BMI為18.5～24.0kg/m2，平均（23.14±2.11）kg/m2。兩組的年齡、腫瘤直徑、BMI比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為8.123、5.270、9.102，Pgt;0.05）。

1.2納入與排除標準

納入標準：上皮性卵巢癌組為經(jīng)術(shù)后病理確診的患者，均為初次手術(shù)，術(shù)前無放化療、免疫治療史；對照組為卵巢囊腺瘤行手術(shù)切除的患者，術(shù)前半年內(nèi)無雌激素和孕激素服藥史。排除標準：合并其他類型惡性腫瘤的患者。

本研究通過連云港市腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批（倫審2019研第012號）。

1.3病理的判斷標準

病理的判斷依據(jù)國際婦產(chǎn)科學(xué)聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期標準［6］，Ⅰ期：腫瘤局限于單側(cè)卵巢表面，直徑≤2cm，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；Ⅱ期：腫瘤局限于兩側(cè)卵巢表面，直徑gt;2cm，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；Ⅲ期：腫瘤擴散至盆腔內(nèi)或出現(xiàn)單側(cè)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；Ⅳ期：腫瘤侵犯其他器官或者遠處轉(zhuǎn)移。參考世界衛(wèi)生組織腫瘤分類［7］進行病理分型和分級。

1.4細胞與試劑

人卵巢癌OVCAR-3細胞購于上海慧穎生物科技有限公司，用含10%胎牛血清的含各種氨基酸和葡萄糖（DMEM）培養(yǎng)基，在37℃的5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育，收集對數(shù)期細胞進行后續(xù)實驗。免疫組化試劑盒購于北京中山生物技術(shù)公司；小鼠抗人ERCC1單克隆抗體、小鼠抗人Nanog單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗鼠IgG均購自美國EPITOMICS公司。

1.5方法

1.5.1免疫組化檢測ERCC1及Nanog蛋白的表達

兩組標本均經(jīng)甲醛固定后石蠟包埋，4μm連續(xù)切片。免疫組化SP法分批對兩組標本進行染色，用磷酸緩沖液代替一抗作陰性對照，嚴格按試劑盒說明書進行操作。在光學(xué)顯微鏡下隨機取5個高倍鏡視野，對每個視野中陽性細胞比例進行評分，具體為：陽性細胞比例lt;5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、gt;75%分別計0～4分。對每個視野中陽性細胞染色強度進行評分，具體為：淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計1～3分。將陽性細胞比例和染色強度評分的乘積為最終陽性表達強度，具體為：陰性（0～1分）、弱陽性（2～3分）、中等陽性（4～5分）、強陽性（gt;5分）。

1.5.2 Western blot檢測順鉑處理后人卵巢癌OVCAR-3細胞中ERCC1、Nanog蛋白的表達

分別用終濃度為0mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L的順鉑處理人卵巢癌OVCAR-3細胞24h，加入蛋白裂解液，以4℃、12 000r/min恒溫離心10min，上清為總蛋白，以蛋白質(zhì)濃度測定方法（BCA）測定蛋白含量，調(diào)整濃度至3μg/μL，分別取40μL行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），分離目標蛋白，轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF），封閉1h，滴加小鼠抗人ERCC1單克隆抗體（1∶1 000）、小鼠抗人Nanog單克隆抗體（1∶1 000），以鼠源性β-actin（1∶500）為內(nèi)參，4℃孵育過夜；洗膜后滴加HRP標記的二抗，室溫下反應(yīng)2h。以電化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色，凝膠成像系統(tǒng)分析各條帶灰度值。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（x-±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析；計數(shù)資料以例數(shù)（百分率）［n（%）］表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Spearman進行相關(guān)性分析，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組標本組織中ERCC1及Nanog蛋白的表達情況

ERCC1陽性染色位于細胞膜；Nanog陽性染色多數(shù)位于細胞核，部分位于細胞漿。上皮性卵巢癌組ERCC1、Nanog蛋白的陽性率均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）；經(jīng)Spearman相關(guān)性分析顯示，上皮性卵巢癌組中ERCC1與Nanog蛋白表達水平呈正相關(guān)（r=0.463，Plt;0.01），對照組中ERCC1與Nanog蛋白表達水平無相關(guān)性（r=0.125，Pgt;0.05），見圖1、表1。

2.2 ERCC1和Nanog蛋白陽性表達在上皮性卵巢癌臨床病理指標中的對比

在101例上皮性卵巢癌患者中，年齡≤50歲者43例，ERCC1和Nanog蛋白的陽性率分別占72.09%（31/43）、74.42%（32/43）；年齡gt;50歲者58例，ERCC1和Nanog蛋白的陽性率分別占68.97%（40/58）、70.69%（41/58），不同年齡ERCC1和Nanog蛋白的陽性率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.115，P=0.888；χ2=0.171，P=0.345）。

在上皮性卵巢癌臨床病理指標中，F(xiàn)IGO分期為Ⅲ+Ⅳ期的ERCC1、Nanog蛋白的陽性率均明顯高于Ⅰ+Ⅱ期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的ERCC1、Nanog蛋白的陽性率均明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性，經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）；病理分型（漿液性與其他）、病理分級（G1+G2級與G3級）、腫瘤位置（單側(cè)與雙側(cè)）的ERCC1、Nanog蛋白的陽性率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05），見表2。

2.3順鉑對人卵巢癌OVCAR-3細胞中ERCC1和Nanog蛋白表達的影響

不同濃度順鉑處理人卵巢癌OVCAR-3細胞24h后，1mg/L、2mg/L、4mg/L濃度順鉑處理的ERCC1和Nanog蛋白相對表達量均明顯高于0mg/L濃度順鉑處理的相對表達量，經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）；且隨順鉑濃度的增加，ERCC1、Nanog蛋白相對表達量逐漸升高，見圖2、表3。

3討論

3.1上皮性卵巢癌DNA損傷修復(fù)的途徑和耐藥的關(guān)系

研究顯示，癌基因活化是導(dǎo)致各類腫瘤發(fā)生的重要因素之一，同時可能伴隨著抑癌基因活性的抑制及DNA修復(fù)基因表達出現(xiàn)異常［8］。ERCC1即是一種新發(fā)現(xiàn)的重要DNA修復(fù)基因，其機制主要是通過切除核苷酸修復(fù)損傷DNA［9］。相關(guān)研究顯示，腫瘤干細胞在多種實體腫瘤中廣泛存在［10］。上皮性卵巢癌具有干細胞特征，與肺癌、乳腺癌等腫瘤比較，其侵襲力和細胞毒性耐受力相對更高［11］。Nanog蛋白是一種僅存在于生殖干細胞及早期胚胎中的重要轉(zhuǎn)錄因子，不存在已分化的組織中，對胚胎干細胞的自我更新、多向分化和高度繁殖的能力具有重要轉(zhuǎn)錄作用［12］。相關(guān)報道證實，Nanog蛋白在精原細胞瘤、前列腺癌及乳腺癌等惡性腫瘤患者組織中均存在異常表達［13］。有研究發(fā)現(xiàn)，ERCC1、Nanog蛋白不僅與肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤發(fā)病具有相關(guān)性，還會影響基于順鉑聯(lián)合化療的耐藥性［14］。

3.2 ERCC1和Nanog蛋白表達量與鉑類藥物敏感性的關(guān)系

本研究顯示，上皮性卵巢癌組織中ERCC1、Nanog蛋白的陽性率均明顯高于良性卵巢腫瘤組織，且二者表達水平具有協(xié)同性；對患者的臨床病理指標分析發(fā)現(xiàn)，ERCC1、Nanog蛋白的陽性率與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均明顯有關(guān)聯(lián)；其提示在上皮性卵巢癌病情的進展過程中存在ERCC1、Nanog蛋白表達上調(diào)，進而提升腫瘤細胞的DNA損傷修復(fù)能力和自我更新、分化水平，導(dǎo)致臨床分期惡化，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；但該過程中所涉及到的調(diào)控通路仍需進一步深入探討。有研究發(fā)現(xiàn)，放射抵抗細胞中ERCC1、ERCC5等基因表達上調(diào)，而在放射敏感細胞中表達下降［15］。亦有研究顯示，在乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中，ERCC1高表達是引發(fā)順鉑同期放、化療敏感性下降的主要原因之一，其作用機制可能與順鉑誘導(dǎo)癌細胞表達干性基因有關(guān)［16］。本研究顯示，用0mg/L、1mg/L、2mg/L、4mg/L不同濃度順鉑處理后的人卵巢癌OVCAR-3細胞中ERCC1、Nanog蛋白相對表達量明顯升高，且隨順鉑濃度的增加提升程度更明顯；其提示卵巢癌發(fā)展過程中伴隨著干性基因表達激活，順鉑化療也會上調(diào)腫瘤干細胞相關(guān)基因的表達，進而促進卵巢癌的發(fā)生與發(fā)展。

3.3小結(jié)

高表達的ERCC1與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在修復(fù)DNA損傷和維持遺傳信息的完整性中發(fā)揮重要作用。Nanog蛋白參與調(diào)控干細胞的自我更新和分化，其高表達與腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強及不良預(yù)后有關(guān)。因此，ERCC1和Nanog蛋白的表達水平有望成為評估上皮性卵巢癌患者惡性程度及預(yù)后的指標，有助于指導(dǎo)治療方案的選擇和預(yù)后的評估。此外，本研究中樣本量較小，樣本中患者的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面存在個體差異，說明可能影響治療方法及預(yù)后。未來希望深入研究其他基因?qū)ι掀ば月殉舶┑挠绊懀股掀ば月殉舶┗颊攉@得針對性的精準治療。

［參考文獻］

［1］Amin N，Chaabouni N，George A.Genetic testing for epithelial ovarian cancer［J］.Best Pract

Res Clin Obstet Gynaecol，2020，65：125-138.

［2］Lheureux S，Gourley C，Vergote I，et al.Epithelial ovarian cancer［J］.Lancet，2019，393（10177）：1240-1253.

［3］Jiang F，Shen Q，Zhang F，et al.ADH1C facilitates cisplatin resistance of lung adenocarcinoma cells［J］.DNA Cell Biol，2022，41（6）：631-640.

［4］Hu Z，Cang R，Zhang H，et al.The expression levels of NF-κB and IKKβ in epithelial ovarian cancer and their correlation with drug resistance-related genes MDR1，TOPOII and ERCC1［J］.Acta Biochim Pol，2023，70（1）：23-29.

［5］Konstantinopoulos P A，Norquist B，Lacchetti C，et al.Germline and somatic tumor testing in epithelial ovarian cancer：ASCO Guideline［J］.J Clin Oncol，2020，38（11）：1222-1245.

［6］Neerja B，Daisuke A，Daya NS，et al.Cancer of the cervix uteri［J］.Int J Gynecol Obstet，2018，143（Suppl 2）：22-36.

［7］Louis D N，Perry A，Reifenberger G，et al.The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system：a summary［J］.Acta Neuropathol，2016，131（6）：803-820.

［8］董健，翟梁好，呂小慧，等.外泌體在上皮性卵巢癌中的研究進展［J］.中國婦幼健康研究，2022，33（3）：111-115.

［9］Armstrong D K，Alvarez R D，Backes F J，et al.NCCN Guidelines Insights：Ovarian Cancer，Version 3.2022［J］.J Natl Compr Canc Netw，2022，20（9）：972-980.

［10］Wood G E，Ledermann J A.Adjuvant and post-surgical treatment in high-grade epithelial ovarian cancer［J］.Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol，2022，78：64-73.

［11］Kuznetsova K，Chabot N M，Ugolini M，et al.Nanog organizes transcription bodies［J］.Curr Biol，2023，33（1）：164-173.

［12］Chambers L M，Esakov Rhoades E L，Bharti R，et al.Disruption of the gut microbiota confers cisplatin resistance in epithelial ovarian cancer［J］.Cancer Res，2022，82（24）：4654-4669.

［13］Schoutrop E，Moyano-Galceran L，Lheureux S，et al.Molecular，cellular and systemic aspects of epithelial ovarian cancer and its tumor microenvironment［J］.Semin Cancer Biol，2022，86（Pt 3）：207-223.

［14］Kim S，Cho H，Hong S O，et al.LC3B upregulation by NANOG promotes immune resistance and stem-like property through hyperactivation of EGFR signaling in immune-refractory tumor cells［J］.Autophagy，2021，17（8）：1978-1997.

［15］Xu L M，Zhu L，Wang P.MicroRNA-135 inhibits initiation of epithelial-mesenchymal transition in breast cancer by targeting ZNF217 and promoting m6A modification of NANOG［J］.Oncogene，2022，41（12）：1742-1751.

［16］Okimoto T，Hamaguchi S，Araki A.ERCC1 is a predictive biomarker for non-small cell lung cancer but is antibody-dependent［J］.Anticancer Res，2021，41（5）：2653-2660.

［專業(yè)責(zé)任編輯：楊 紅 安瑞芳］

［中文編輯：王 懿；英文編輯：楊周岐］

［收稿日期］2022-09-23

［作者簡介］劉慧玲（1983—），女，主治醫(yī)師，主要從事婦科臨床工作。

［通訊作者］李大眾，副主任醫(yī)師。