LncRNA PVT1對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞活性的影響及其機(jī)制

［摘要］目的探究長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）漿細(xì)胞瘤變體異位基因1（PVT1）對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并分析其潛在機(jī)制。方法收集41例DLBCL病人和15例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生（RLH）病人的組織標(biāo)本，體外培養(yǎng)人正常B淋巴細(xì)胞GM12878和人DLBCL細(xì)胞（OCI-Ly3、U2932、TMD8），對(duì)TMD8細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將其分為control組（只轉(zhuǎn)染Lipofectamine-2000）、si-NC組（轉(zhuǎn)染si-NC）、inhibitor-NC組（轉(zhuǎn)染inhibitor-NC）、si-PVT1組（轉(zhuǎn)染si-PVT1）、miR-145-5p inhibitor組（轉(zhuǎn)染miR-145-5p inhibitor）、si-PVT1+miR-145-5p inhibitor組（轉(zhuǎn)染si-PVT1和miR-145-5p inhibitor）。應(yīng)用qRT-PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞PVT1 mRNA和miR-145-5p表達(dá)，Western Blot方法檢測(cè)CDK6蛋白表達(dá)，CCK-8法檢測(cè)TMD8細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TMD8細(xì)胞周期變化，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TMD8細(xì)胞遷移和侵襲能力，RNA pull down和雙熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證PVT1、miR-145-5p與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶6（CDK6）的靶向關(guān)系。結(jié)果DLBCL組織PVT1 mRNA、CDK6蛋白的表達(dá)水平高于RLH組織，miR-145-5p表達(dá)低于RLH組織（t=14.264～24.445，Plt;0.05）。與GM12878細(xì)胞比較，OCI-Ly3、U2932、TMD8細(xì)胞中PVT1 mRNA、CDK6蛋白表達(dá)均增加，miR-145-5p表達(dá)均減少（F=69.557～234.718，Plt;0.05）。6組細(xì)胞PVT1 mRNA、miR-145-5p、CDK6蛋白表達(dá)及增殖率、G0/G1期細(xì)胞比例、S期細(xì)胞比例、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=25.589～319.150，Plt;0.05）；與control組比較，si-PVT1組細(xì)胞PVT1 mRNA、CDK6蛋白、增殖率、S期細(xì)胞比例、遷移和侵襲數(shù)量降低，miR-145-5p表達(dá)、G0/G1期細(xì)胞比例升高（Plt;0.05），miR-145-5p inhibitor組呈相反變化（Plt;0.05）；下調(diào)miR-145-5p表達(dá)可減弱敲低PVT1對(duì)TMD8細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用（Plt;0.05）。過(guò)表達(dá)PVT1 mRNA增高CDK6蛋白表達(dá)、細(xì)胞增殖率、S期細(xì)胞比例、遷移和侵襲數(shù)量，降低miR-145-5p表達(dá)、G0/G1期的細(xì)胞比例（F=38.025～327.887，Plt;0.05）。miR-145-5p是PVT1的靶基因，且miR-145-5p可靶向下調(diào)CDK6表達(dá)。結(jié)論敲低PVT1可抑制DLBCL細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，其作用機(jī)制可能與調(diào)控miR-145-5p/CDK6軸有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］淋巴瘤，大B細(xì)胞，彌漫性；RNA，長(zhǎng)鏈非編碼；漿細(xì)胞瘤變體異位基因1；miR-145-5p；細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶6

［中圖分類(lèi)號(hào)］R733.4［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［文章編號(hào)］2096-5532（2024）03-0381-07

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.102［開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240730.1613.008;2024-07-3111：35：43

Effect of long non-coding RNA plasmacytoma variant translocation gene 1 on the viability of diffuse large B-cell lymphoma cells and its mechanismLU Xiaohui， LI Wenyong， WANG Menglin， CHEN Xiangli（Lymphoma Hematopoietic Stem Cell Transplantation Center， Jiaozuo People’s Hospital， Jiaozuo 454150， China）

［Abstract］ObjectiveTo investigate the effect of long non-coding RNA （LncRNA） plasmacytoma variant translocation gene 1 （PVT1） on the biological behavior of diffuse large B-cell lymphoma （DLBCL） cells and its potential mechanism.MethodsTissue specimens were collected from 41 patients with DLBCL and 15 patients with lymph node reactive hyperplasia （RLH）， and normal human B lymphocytes GM12878 and human DLBCL cells （OCI-Ly3， U2932， TMD8） were cultured in vitro. TMD8 cells were transfected and divided into control group （transfected with Lipofectamine-2000 alone）， si-NC group （transfected with si-NC）， inhibitor-NC group （transfected with inhibitor-NC）， si-PVT1 group （transfected with si-PVT1）， miR-145-5p inhibitor group （transfected with miR-145-5p inhibitor）， and si-PVT1+miR-145-5p inhibitor group （transfected with si-PVT1 and miR-145-5p inhibitor）. The qRT-PCR method was used to measure the mRNA expression levels of PVT1 and miR-145-5p in each group of cells; Western Blot was used to measure the protein expression level of cyclin-dependent kinase 6 （CDK6）; CCK-8 assay was used to measure the proliferation of TMD8 cells; flow cytometry was used to measure the change in cell cycle of TMD8 cells; Transwell assaywas used to measure the migration and invasion abilities of TMD8cells; RNA pull-down and dual-luciferase reporter assay were used to verify the targeting relationship between PVT1， miR-145-5p， and CDK6.ResultsThe mRNA expression level of PVT1 and the protein expression level of CDK6 in DLBCL tissue were significantly higher than those in RLH tissue， and the expression level of miR-145-5p in DLBCL tissue was significantly lower than that in RLH tissue （t=14.264-24.445，Plt;0.05）. Compared with GM12878 cells， OCI-Ly3， U2932， and TMD8 cells had significant increases in the mRNA expression level of PVT1 and the protein expression level of CDK6 and a significant reduction in the expression level of miR-145-5p （F=69.557-234.718，Plt;0.05）. There were significant differences between the six groups of cells in PVT1， miR-145-5p， CDK6， proliferation rate， the proportion of cells in G0/G1 phase， the proportion of cells in S phase， and the number of cells with migration and invasion （F=25.589-319.150，Plt;0.05）. Compared with the control group， the si-PVT1 group had significant reductions in PVT1， CDK6， proliferation rate， the proportion of cells in S phase， and the number of cells with migration and invasion， as well as significant increases in the expression of miR-145-5p and the proportion of cells in G0/G1 phase（Plt;0.05）， while the miR-145-5p inhibitor group showed opposite changes （Plt;0.05）. Down regulating the expression of miR-145-5p could weaken the inhibitory effect of PVT1 knockdown on the malignant biological behavior of TMD8 cells （Plt;0.05）. Overexpression of PVT1 increased the protein expression level of CDK6， proliferation rate， the proportion of cells in S phase， and the number of cells with migration and invasion and reduced the expression of miR-145-5p and the proportion of cells in G0/G1 phase （F=38.025-327.887，Plt;0.05）. This study showed that miR-145-5p was a target gene of PVT1， and miR-145-5p could down regulate the expression of CDK6.ConclusionPVT1 knockdown can inhibit the malignant biological behavior of DLBCL cells， possibly by regulating the miR-145-5p/CDK6 axis.

［Key words］lymphoma， large B-cell， diffuse; RNA， longnoncoding; plasmacytoma variant translocation gene 1; miR-145-5p; cyclin-dependent kinase 6

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）約占所有淋巴瘤病例的40%[1]。隨著化療和新的DLBCL藥物的發(fā)展，大部分病人治療后處于長(zhǎng)期緩解，但有些病人臨床結(jié)果不佳[2]。因此，明確DLBCL的發(fā)病機(jī)制，對(duì)改善DLBCL的預(yù)后有重要意義。非編碼RNA（LncRNA）是包括DLBCL在內(nèi)的癌癥診斷和預(yù)后判斷的有希望的標(biāo)志物[3-4]。LncRNA漿細(xì)胞瘤變體異位基因1（PVT1）在DLBCL中表達(dá)升高，可促進(jìn)DLBCL惡性進(jìn)展，且與病人不良預(yù)后相關(guān)[5]。但關(guān)于其分子機(jī)制的研究較少。LncRNA可以海綿化miRNA保護(hù)其下游靶mRNA免被降解[6]。miR-145-5p被證實(shí)在DLBCL中表達(dá)降低，作為抑癌基因發(fā)揮作用[7]。細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶6（CDK6）在包括DLBCL在內(nèi)的多種惡性腫瘤中異常高表達(dá)[8]。有研究顯示，CDK6為miR-145-5p的靶基因，而PVT1又可以作用于miR-145-5p[9-10]。推測(cè)LncRNA PVT1可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-145-5p/CDK6軸在DLBCL中發(fā)揮致癌作用。本研究探討PVT1對(duì)DLBCL細(xì)胞生物學(xué)活性的影響及其潛在機(jī)制，為DLBCL的治療提供新的靶點(diǎn)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

收集2017年1月—2020年12月焦作市人民醫(yī)院病理科診斷為DLBCL病人的組織標(biāo)本41例，另取15例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生（RLH）病人的組織標(biāo)本作為對(duì)照組。人正常B淋巴細(xì)胞GM12878和人DLBCL細(xì)胞OCI-Ly3、U2932、TMD8購(gòu)自上?？道噬锟萍脊尽０邢騊VT1的siRNA（si-PVT1）及其陰性對(duì)照（si-NC）、miR-145-5p模擬物（mimic）及其陰性對(duì)照（mimic-NC）、miR-145-5p抑制劑（inhibitor）及其陰性對(duì)照（inhibitor-NC）、PVT1野生型（PVT1-WT）質(zhì)粒、PVT1突變型（PVT1-MUT）質(zhì)粒、CDK6-WT質(zhì)粒、CDK6-MUT質(zhì)粒均購(gòu)自上海吉瑪制藥公司；PVT1、miR-145-5p、GAPDH、U6引物由武漢金開(kāi)瑞生物工程公司設(shè)計(jì)合成；Lipofectamine-2000、Trizol（上海玉博生物科技公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒（Takara公司）；兔源一抗CDK6、β-actin和山羊抗兔二抗（Abcam公司）；CCK-8試劑盒、碘化丙啶（PI）（上海Beyotime公司）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

GM12878、OCI-Ly3、U2932、TMD8細(xì)胞均在添加含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。將TMD8細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種至24孔板內(nèi)，待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)應(yīng)用Lipofectamine-2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分為control組（A組，只轉(zhuǎn)染Lipofectamine-2000）、si-NC組（B組，轉(zhuǎn)染si-NC）、inhibitor-NC組（C組，轉(zhuǎn)染inhibitor-NC）、si-PVT1組（D組，轉(zhuǎn)染si-PVT1）、miR-145-5p inhibitor組（E組，轉(zhuǎn)染miR-145-5p inhibitor）、si-PVT1+miR-145-5p inhibitor組（F組，轉(zhuǎn)染si-PVT1和miR-145-5p inhibitor），轉(zhuǎn)染48 h后收集各組TMD8細(xì)胞，通過(guò)qRT-PCR方法檢測(cè)PVT1mRNA、miR-145-5p表達(dá)，以鑒定轉(zhuǎn)染效率。

1.3檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1qRT-PCR檢測(cè)PVT1 mRNA、miR-145-5p表達(dá)采用Trizol法提取各組織及細(xì)胞中總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以GAPDH、U6為內(nèi)參，利用qRT-PCR試劑盒擴(kuò)增cDNA。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min，然后在95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min和72 ℃ 1 min下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。應(yīng)用ABI 7500 qRT-PCR儀檢測(cè)PVT1、miR-145-5p水平，2-△△CT法分析結(jié)果。引物及其序列見(jiàn)表1。

1.3.2Western Blot方法檢測(cè)CDK6蛋白表達(dá)分別向各組織、細(xì)胞中加入RIPA裂解液提取總蛋白，定量、熱變性后，分離蛋白、轉(zhuǎn)膜，用50 g/L脫脂奶粉封閉，4 ℃孵育兔源一抗CDK6、β-actin（1∶1 000，過(guò)夜），次日室溫孵育山羊抗兔二抗（1∶2 000，2 h），滴加ECL發(fā)光液后置于WD-9413A凝膠成像分析儀中拍照，用Image J軟件分析目的條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參對(duì)CDK6的表達(dá)進(jìn)行定量。

1.3.3CCK-8法檢測(cè)TMD8細(xì)胞的增殖情況TMD8細(xì)胞在96孔板（10 000個(gè)/孔）中培養(yǎng)24 h，加入CCK-8試劑（10 μL/孔）培養(yǎng)2 h后，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處吸光度（OD），計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD×100%。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TMD8細(xì)胞周期的變化TMD8細(xì)胞用RNase A（0.1 g/L）孵育30 min后，3 000 r/min離心5 min，重懸，4 ℃乙醇固定4 h，棄上清液，與PI（50 mg/L）避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞各周期比例。

1.3.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TMD8細(xì)胞遷移、侵襲能力TMD8細(xì)胞用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液重懸（1×108個(gè)/L），Transwell上室加入200 μL懸液，下室加入600 μL含血清的培養(yǎng)液，孵育24 h后收集下室細(xì)胞，40 g/L多聚甲醛固定，1 g/L結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)細(xì)胞遷移數(shù)量。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，Matrigel包被到Transwell上室，其余操作同遷移實(shí)驗(yàn)，計(jì)數(shù)著色的細(xì)胞數(shù)量，即為侵襲數(shù)量。

1.3.6RNA pull down法和雙熒光素酶報(bào)告基因（DLR）法驗(yàn)證PVT1與miR-145-5p的作用及其關(guān)系將5×105個(gè)/孔TMD8細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)分別將生物素（biotin）標(biāo)記的miR-145-5p mimic（biotin-miR-145-5p mimic組）、mimic-NC（biotin-mimic-NC組）轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，24 h后，裂解細(xì)胞，然后向細(xì)胞裂解液中加入鏈霉親和素瓊脂糖磁珠孵育30 min，提取RNA并檢測(cè)PVT1富集量。

在DLR實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)RNA相互作用百科全書(shū)（ENCORI）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//rnasysu.com/encori/）對(duì)miR-145-5p和PVT1的互補(bǔ)位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建PVT1-WT質(zhì)粒、PVT1-MUT質(zhì)粒。將TMD8細(xì)胞接種至24孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)用Lipofectamine-2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染并分組：PVT1-WT+mimic-NC組（共轉(zhuǎn)染PVT1-WT和mimic-NC）、PVT1-WT+miR-145-5p mimic組（細(xì)胞共轉(zhuǎn)染PVT1-WT和miR-145-5p mimic）、PVT1-MUT+mimic-NC組（細(xì)胞共轉(zhuǎn)染PVT1-MUT和mimic-NC）、PVT1-MUT+miR-145-5p mimic組（細(xì)胞共轉(zhuǎn)染PVT1-MUT和miR-145-5p mimic），轉(zhuǎn)染24 h后利用DLR試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.3.7DLR方法驗(yàn)證miR-145-5p與CDK6的作用關(guān)系利用ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-145-5p與CDK6的結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建CDK6-WT質(zhì)粒、CDK6-MUT質(zhì)粒。將TMD8細(xì)胞接種至24孔板中（5×104個(gè)/孔），待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染分組：CDK6-WT+mimic-NC組（細(xì)胞共轉(zhuǎn)染CDK6-WT和mimic-NC）、CDK6-WT+miR-145-5p mimic組（細(xì)胞共轉(zhuǎn)染CDK6-WT和miR-145-5p mimic）、CDK6-MUT+mimic-NC組（細(xì)胞共轉(zhuǎn)染CDK6-MUT和mimic-NC）及CDK6-MUT+miR-145-5p mimic組（共轉(zhuǎn)染CDK6-MUT和miR-145-5p mimic），轉(zhuǎn)染24 h后檢測(cè)各組熒光素酶活性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料結(jié)果以±s，兩組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，3組及以上的組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。采用Spearman秩相關(guān)分析PVT1與miR-145-5p及miR-145-5p與CDK6的相關(guān)性。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1DLBCL組織和細(xì)胞中PVT1 mRNA、miR-145-5p及CDK6蛋白表達(dá)

DLBCL組織中PVT1 mRNA、CDK6蛋白表達(dá)高于RLH組織，miR-145-5p表達(dá)低于RLH組織（t=14.264～24.445，Plt;0.05），見(jiàn)圖1和表2。相關(guān)性分析顯示，DLBCL組織中PVT1 mRNA表達(dá)與miR-145-5p呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.405，P=0.009），miR-145-5p與CDK6蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.457，P=0.003），見(jiàn)圖2。與GM12878細(xì)胞比較，OCI-Ly3、U2932、TMD8細(xì)胞中CDK6蛋白、PVT1 mRNA表達(dá)均增加，miR-145-5p表達(dá)均減少（F=69.557～234.718，Plt;0.05），且TMD8細(xì)胞中PVT1 mRNA、CDK6蛋白表達(dá)最高，miR-145-5p表達(dá)最低。見(jiàn)圖1和表3。

2.2PVT1 mRNA、miR-145-5p轉(zhuǎn)染效率鑒定

control組、si-NC組、si-PVT1組細(xì)胞PVT1 mRNA表達(dá)分別為0.29±0.02、1.00±0.05、0.99±0.03，與control組、si-NC組相比較，si-PVT1組PVT1 mRNA的表達(dá)顯著下降（F=523.262，Plt;0.05），說(shuō)明si-PVT1轉(zhuǎn)染成功。inhibitor-NC組、miR-145-5p inhibitor組miR-145-5p表達(dá)分別為0.25±0.03、1.01±0.05，兩組比較差異有顯著性（t=26.068，Plt;0.05），說(shuō)明miR-145-5p inhibitor轉(zhuǎn)染成功。

2.3敲低PVT1 mRNA或者下調(diào)miR-145-5p對(duì)TMD8細(xì)胞中PVT1 mRNA、miR-145-5p及CDK6蛋白表達(dá)的影響

本文6組細(xì)胞的PVT1 mRNA、miR-145-5p、CDK6蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=25.589～319.150，Plt;0.05）。與control組比較，si-PVT1組PVT1 mRNA、CDK6蛋白表達(dá)降低，miR-145-5p表達(dá)升高（Plt;0.05）；miR-145-5p inhibitor組miR-145-5p表達(dá)降低，CDK6蛋白表達(dá)升高（Plt;0.05）；與si-PVT1組比較，si-PVT1+miR-145-5p inhibitor組TMD8細(xì)胞中miR-145-5p表達(dá)降低，CDK6蛋白表達(dá)升高（Plt;0.05）。見(jiàn)圖3、表4。

2.4敲低PVT1 mRNA或下調(diào)miR-145-5p對(duì)細(xì)胞增殖的影響

本文6組細(xì)胞增殖率及G0/G1期、S期細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=66.037～213.482，Plt;0.05）。與control組比較，si-PVT1組TMD8細(xì)胞增殖率、S期的細(xì)胞比例降低，G0/G1期的細(xì)胞比例升高（Plt;0.05），miR-145-5p inhibitor組上述指標(biāo)呈相反變化（Plt;0.05）；與si-PVT1組比較，si-PVT1+miR-145-5p inhibitor組TMD8細(xì)胞增殖率、S期細(xì)胞比例升高，G0/G1期細(xì)胞比例降低（Plt;0.05）。見(jiàn)圖4和表5。

2.5敲低PVT1或下調(diào)miR-145-5p對(duì)TMD8細(xì)胞遷移、侵襲的影響

本文6組細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=64.630、57.457，Plt;0.05）。與control組比，si-PVT1組細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)量降低（Plt;0.05），miR-145-5p inhibitor組細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)均升高（Plt;0.05）；與si-PVT1組比較，si-PVT1+miR-145-5p inhibitor組細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)均升高（Plt;0.05）。見(jiàn)圖5和表6。

2.6過(guò)表達(dá)PVT1對(duì)TMD8細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

control組（轉(zhuǎn)染Lipofectamine-2000）、pcDNA-NC組（轉(zhuǎn)染pcDNA-NC）、pcDNA-PVT1組（轉(zhuǎn)染pcDNA-PVT1）細(xì)胞PVT1 mRNA、miR-145-5p、CDK6蛋白、細(xì)胞增殖率、G0/G1期及S期細(xì)胞比例、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=38.025～327.887，Plt;0.05）；與control組、pcDNA-NC組比較，pcDNA-PVT1組PVT1 mRNA、CDK6表達(dá)升高，miR-145-5p表達(dá)降低，細(xì)胞增殖率、S期的細(xì)胞比例增高，G0/G1期的細(xì)胞比例降低，細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)量增高（Plt;0.05）。見(jiàn)圖6、7和表7。

2.7PVT1與miR-145-5p作用關(guān)系驗(yàn)證

應(yīng)用ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)PVT1與miR-145-5p的結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖8。與biotin-mimic-NC組比較，biotin-miR-145-5p mimic組PVT1富集量較高（3.17±0.09比1.02±0.05；t=41.765，Plt;0.05）。PVT1-WT+mimic-NC組、PVT1-MUT+mimic-NC組、PVT1-MUT+miR-145-5p mimic組以及PVT1-WT+miR-145-5p mimic組的熒光素酶活性分別為1.02±0.04、0.99±0.04、1.01±0.03、0.26±0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=338.263，Plt;0.05）；與PVT1-WT+mimic-NC組、PVT1-MUT+miR-145-5p mimic組相比較，PVT1-WT+miR-145-5p mimic組熒光素酶活性降低（Plt;0.05）。

2.8miR-145-5p與CDK6作用關(guān)系驗(yàn)證

通過(guò)ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到miR-145-5p序列與CDK6互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖9。CDK6-WT+mimic-NC組、CDK6-MUT+mimic-NC組、CDK6-MUT+miR-145-5p mimic組和CDK6-WT+miR-145-5p mimic組的熒光素酶活性分別為1.03±0.05、1.00±0.06、1.01±0.05、0.32±0.04，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=188.758，Plt;0.05）；與CDK6-WT+mimic-NC組、CDK6-MUT+miR-145-5p mimic組比較，CDK6-WT+miR-145-5p mimic組熒光素酶活性降低（Plt;0.05）。

3討論

目前，大部分DLBCL病人接受化療后預(yù)后較好，但仍有約1/3的病人在初步緩解后發(fā)生復(fù)發(fā)，預(yù)后較差，由此需要開(kāi)發(fā)新的靶向治療方法[2，11]。相關(guān)研究顯示，LncRNA參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[12-13]。PVT1是一種促癌基因，在膽囊癌、乳癌、卵巢癌中表達(dá)升高，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[14-15]。近期研究顯示，PVT1在DLBCL中呈高表達(dá)，敲低PVT1能降低DLBCL細(xì)胞的增殖能力[16]。本研究結(jié)果顯示，PVT1在DLBCL組織和細(xì)胞中均高表達(dá)，與上述研究結(jié)果一致[16]。選取表達(dá)最高的TMD8細(xì)胞敲低PVT1表達(dá)，觀察細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移和侵襲變化，結(jié)果顯示，與control組比較，si-PVT1組TMD8細(xì)胞增殖率、S期比例、遷移數(shù)、侵襲數(shù)均減少，G0/G1期比例增加，pcDNA-PVT1組各指標(biāo)變化則相反，表明敲低PVT1表達(dá)能夠誘導(dǎo)TMD8細(xì)胞G0/G1期阻滯，抑制其增殖、遷移和侵襲，而過(guò)表達(dá)PVT1則促進(jìn)TMD8細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。以上結(jié)果說(shuō)明，PVT1在DLBCL進(jìn)展中發(fā)揮促進(jìn)作用。

LncRNA通過(guò)充當(dāng)miRNA的海綿調(diào)控腫瘤細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。本研究應(yīng)用RNA pull down和DLR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PVT1可靶向miR-145-5p，并負(fù)調(diào)控其表達(dá)；此外，DLBCL組織和細(xì)胞中PVT1高表達(dá)的同時(shí)，miR-145-5p呈低表達(dá)；敲低PVT1后，miR-145-5p的表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果表明，PVT1可充當(dāng)miR-145-5p海綿促進(jìn)TMD8細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。本研究生物學(xué)預(yù)測(cè)顯示，miR-145-5p是CDK6的上游調(diào)控因子，DLR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-145-5p與CDK6之間存在直接相互作用。本研究結(jié)果顯示，DLBCL組織和細(xì)胞中CDK6表達(dá)升高，敲低PVT1后，CDK6表達(dá)下調(diào)，且下調(diào)miR-145-5p可促進(jìn)CDK6表達(dá)。以上結(jié)果表明，PVT1可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-145-5p/CDK6軸影響DLBCL細(xì)胞的生物學(xué)活性。

綜上所述，敲低PVT1可抑制DLBCL細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，其作用機(jī)制可能與miR-145-5p/CDK6有關(guān)。未結(jié)合動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證是本研究的不足之處，這是我們未來(lái)研究的重點(diǎn)。

［參考文獻(xiàn)］

[1]SIEGEL R L， MILLER K D， JEMAL A. Cancer statistics， 2019[J]." CA： a Cancer Journal for Clinicians， 2019，69（1）：7-34.

[2]SARKOZY C， SEHN L H. Management of relapsed/refractory DLBCL[J]." Best Practice amp; Research Clinical Haematology， 2018，31（3）：209-216.

[3]BRIDGES M C， DAULAGALA A C， KOURTIDIS A. LNCcation： lncRNA localization and function[J]." The Journal of Cell Biology， 2021，220（2）：e202009045.

[4]HUANG X B， QIAN W B， YE X J. Long noncoding RNAs in diffuse large B-cell lymphoma： current advances and perspectives[J]." OncoTargets and Therapy， 2020，13：4295-4303.

[5]YANG R F， SHAO T T， LONG M M， et al. Long noncoding RNA PVT1 promotes tumor growth and predicts poor prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma[J]." Cancer Communications， 2020，40（10）：551-555.

[6]KARAGKOUNI D， KARAVANGELI A， PARASKEVOPOULOU M D， et al. Characterizing miRNA-lncRNA interplay[J]." Methods in Molecular Biology， 2021，2372：243-262.

[7]GAO Y M， DING X J. MiR-145-5p exerts anti-tumor effects in diffuse large B-cell lymphoma by regulating S1PR1/STAT3/AKT pathway[J]." Leukemia amp; Lymphoma， 2021，62（8）：1884-1891.

[8]GU J Y， WANG X， ZHANG L， et al. Matrine suppresses cell growth of diffuse large B-cell lymphoma via inhibiting CaMKIIγ/c-Myc/CDK6 signaling pathway[J]." BMC Complementary Medicine and Therapies， 2021，21（1）：163.

[9]SHI W D， GAO Z Y， SONG J X， et al. Silence of FOXD2-AS1 inhibited the proliferation and invasion of esophagus cells by regulating miR-145-5p/CDK6 axis[J]." Histology and Histopathology， 2020，35（9）：1013-1021.

[10]TANG J J， YI S Y， LIU Y. Long non-coding RNA PVT1 can regulate the proliferation and inflammatory responses of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes by targeting microRNA-145-5p[J]." Human Cell， 2020，33（4）：1081-1090.

[11]張貴兵，何正飛，商文忠，等. 三乙醇胺對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞生物特性的影響[J]. 中華全科醫(yī)學(xué)， 2022，20（5）：785-788.

[12]王圓圓，關(guān)新壘，秦海霞. 基因間長(zhǎng)鏈非編碼RNA 467對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、凋亡及遷移和侵襲能力的影響[J]. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2024，41（1）：13-20.

[13]SMOLARZ B， ZADRONA-NOWAK A， ROMANOWICZ H. The role of lncRNA in the development of tumors， including breast cancer[J]." International Journal of Molecular Sciences， 2021，22（16）：8427.

[14]WANG H T， HUANG Y L， YANG Y R. LncRNA PVT1 regulates TRPS1 expression in breast cancer by sponging miR-543[J]." Cancer Management and Research， 2020，12：7993-8004.

[15]WU Y X， GU W Q， HAN X， et al. LncRNA PVT1 promotes the progression of ovarian cancer by activating TGF-β pathway via miR-148a-3p/AGO1 axis[J]." Journal of Cellular and Molecular Medicine， 2021，25（17）：8229-8243.

[16]TAO S， CHEN Y， HU M， et al. LncRNA PVT1 facilitates DLBCL development via miR-34b-5p/Foxp1 pathway[J]." Molecular and Cellular Biochemistry， 2022，477（3）：951-963.

（本文編輯黃建鄉(xiāng)）