液體活檢在肺癌早期診斷中的應(yīng)用研究進(jìn)展

［摘要］液體活檢是肺癌診斷的一種重要方法，較之傳統(tǒng)組織活檢，有安全無創(chuàng)、標(biāo)本易獲取、可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等優(yōu)勢(shì)，在早期肺癌診斷中有確切價(jià)值。本文總結(jié)國內(nèi)外液體活檢診斷早期肺癌的研究進(jìn)展，探討其在早期肺癌診斷中的價(jià)值。

［關(guān)鍵詞］液體活組織檢查；肺腫瘤；早期診斷；生物標(biāo)記，腫瘤；綜述

［中圖分類號(hào)］R734.2;R446.8［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［文章編號(hào)］2096-5532（2024）03-0470-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.106［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240730.1145.003;2024-07-3109：16：33

Research advances in the application of liquid biopsy in the diagnosis of early-stage lung cancerHUANG Tongtong， XIN Ying， YIN Xiaojiao， SUN Yanqiu， XU Tao（Department of Respiratory and Critical Care Medicine， The Affiliated Hospital of Qing-dao University， Qingdao 266000， China）

［Abstract］Liquid biopsy is an important method for the diagnosis of lung cancer， and compared with traditional tissue biopsy， liquid biopsy has the advantages of favorable safety， noninvasiveness， convenience in obtaining specimens， and dynamic monitoring. Therefore， it has a marked value in the diagnosis of early-stage lung cancer. This article summarizes the research advances in liquid biopsy in the diagnosis of early-stage lung cancer in China and globally and discusses its value in the diagnosis of early-stage lung cancer.

［Key words］liquid biopsy; lung neoplasms; early diagnosis; biomarkers， tumor; review

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤之一， 據(jù)美國癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，2020年全球肺癌新增病例和新增死亡病例在所有癌癥中的占比分別是11.4%和18.0%[1]。在我國，肺癌病人5年生存率僅為19.7%[2]。肺癌預(yù)后較差主要與多數(shù)病人初診時(shí)已經(jīng)處于疾病晚期相關(guān)，實(shí)現(xiàn)肺癌的早診斷早治療是降低病死率、改善預(yù)后的重要手段。液體活檢作為一種新興的體外檢測(cè)方法，在肺癌的早期診斷中有重要價(jià)值。本文擬對(duì)國內(nèi)外液體活檢診斷早期肺癌的研究進(jìn)展作一綜述。

1液體活檢概述

液體活檢以血液、痰液、肺泡灌洗液等為檢測(cè)樣本，檢測(cè)體液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）、外泌體等生物標(biāo)志物，近年來在腫瘤診治領(lǐng)域獲得了越來越多的關(guān)注，2020年被Nature雜志網(wǎng)站評(píng)選為腫瘤診治領(lǐng)域的里程碑事件之一。

相對(duì)于傳統(tǒng)的組織活檢，液體活檢有安全無創(chuàng)、標(biāo)本易獲取、可重復(fù)取材等優(yōu)勢(shì)，在提高臨床依從性、克服腫瘤異質(zhì)性等方面有重要價(jià)值。當(dāng)前許多研究已表明，液體活檢在腫瘤篩查、用藥指導(dǎo)、療效檢測(cè)、預(yù)后判斷等臨床實(shí)踐中都有著巨大的前景。

2液體活檢在早期肺癌診斷中的應(yīng)用

2.1CTC

CTC于1869年首次在外周血中被發(fā)現(xiàn)[3]，指由于各種作用從原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性的腫瘤組織中脫落而進(jìn)入外周體液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞，是目前除循環(huán)游離DNA（cfDNA）外應(yīng)用最多的液體活檢生物標(biāo)志物[4]。

ILIE等[5]對(duì)168例慢性阻塞性肺疾?。–OPD）、77例非COPD病人進(jìn)行CTC檢測(cè)，結(jié)果顯示，COPD組5例血液標(biāo)本中檢測(cè)到了惡性CTC，隨訪發(fā)現(xiàn)該5例病人后續(xù)都發(fā)生了肺癌，證明了CTC在早期肺癌篩查中的重要意義。HE等[6]檢測(cè)了24例Ⅰ期和Ⅱ期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）病人、72例健康對(duì)照者外周血CTC，其診斷靈敏度和特異度分別為62.5%和100.0%，說明了CTC對(duì)于肺癌早期篩查與診斷的潛在價(jià)值。

CTC的檢測(cè)分富集分離、鑒定分析兩步進(jìn)行。首先通過密度梯度離心法、免疫磁珠吸附法等依賴于CTC物理學(xué)、生物學(xué)特征的方法富集CTC，繼而通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、細(xì)胞免疫熒光等方法對(duì)其進(jìn)行分析[7]。其中免疫磁珠吸附法包括陽性富集和陰性富集，前者依賴于偶聯(lián)上皮細(xì)胞黏附分子（EpCAM）和細(xì)胞角蛋白等富集CTC，而后者依賴于偶聯(lián)CD45等標(biāo)志物去除非腫瘤細(xì)胞[8]。CellSearch是美國食品藥品監(jiān)督管理局唯一批準(zhǔn)用于臨床的CTC檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)通過EpCAM抗體包被的磁珠結(jié)合CTC表面的EpCAM進(jìn)行免疫分離[9]，但EpCAM易受上皮間質(zhì)化影響，其診斷靈敏度欠佳且容易出現(xiàn)假陽性[10]。葉酸受體（FR）免疫磁珠負(fù)向篩選聯(lián)合靶向PCR，能靶向定量檢測(cè)FR陽性的CTC[11]，該方法不受上皮間質(zhì)化的影響，彌補(bǔ)了CellSearch的部分不足。一項(xiàng)研究將FR靶向PCR CTC檢測(cè)應(yīng)用于肺癌，發(fā)現(xiàn)良性肺結(jié)節(jié)病人的CTC水平顯著低于肺癌病人，該方法診斷肺癌的靈敏度和特異度分別為82.5%和72.2%，尤其對(duì)于Ⅰ期肺癌靈敏度可達(dá)86.8%，曲線下面積（AUC）可達(dá)0.912[12]，證明該方法對(duì)于早期肺癌有較好的輔助診斷價(jià)值。此外，近年也有一些獲得關(guān)注較多的其他CTC檢測(cè)技術(shù)，如CTCBIOPSY、微腔陣列（MCA）系統(tǒng)、微流控技術(shù)等，其肺癌檢出率的對(duì)比見表1。

2.2ctDNA

cfDNA是細(xì)胞以衰老、凋亡、壞死等方式釋放到體液循環(huán)中的游離DNA，主要包括正常組織細(xì)胞釋放的DNA、腫瘤細(xì)胞釋放的DNA，后者稱為ctDNA。ctDNA本質(zhì)上是腫瘤組織的基因組片段，攜帶腫瘤細(xì)胞突變、插入、缺失、重排等基因組信息。

CHEN等[17]通過靶向測(cè)序檢測(cè)Ⅰ～Ⅲ期NSCLC病人的ctDNA和腫瘤組織DNA，發(fā)現(xiàn)了頻繁的驅(qū)動(dòng)突變，該方法的診斷靈敏度和特異度分別為53.8%和47.3%。一項(xiàng)有關(guān)肺結(jié)節(jié)良惡性的研究顯示，ctDNA對(duì)于肺癌檢出的總體特異度為96.0%，靈敏度為69.0%[18]。因此，ctDNA被視作良好可靠的生物標(biāo)記物，對(duì)于肺結(jié)節(jié)良惡性的定性診斷及早期肺癌的檢出有很大的價(jià)值。

基于上述研究和高通量測(cè)序（NGS）、數(shù)字PCR等檢測(cè)技術(shù)，ctDNA的檢測(cè)在肺癌的診治領(lǐng)域已有了部分應(yīng)用，但仍面臨著在體液中含量低、清除速度快、敏感性低、缺乏統(tǒng)一檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)等問題。因此，ctDNA檢測(cè)在腫瘤臨床診治中的應(yīng)用仍需克服相關(guān)技術(shù)難題以提高其可靠性和準(zhǔn)確性。

2.3外泌體

外泌體是由細(xì)胞分泌到細(xì)胞外的囊泡，內(nèi)含母細(xì)胞來源的DNA、微小RNA（miRNA）、蛋白質(zhì)等成分，具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，在外周血、唾液、痰液、肺泡灌洗液等體液中均能檢測(cè)到，可通過自分泌或旁分泌的方式影響細(xì)胞間的物質(zhì)交換和信息傳遞[19]，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移。

ZHANG等[20]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中miR-5684和miR-125b-5p水平在NSCLC病人體內(nèi)明顯降低，二者聯(lián)合診斷NSCLC的AUC為0.793，靈敏度和特異度分別為82.7%和62.1%，其中對(duì)于早期肺癌病人鑒別的靈敏度和特異度分別為80.6%和60.9%，證明了外泌體在區(qū)分肺癌病人和非肺癌病人方面的潛在價(jià)值。

外泌體的分離常采用超速離心法、免疫磁珠法、聚乙二醇沉淀法等，再通過電子顯微鏡、免疫金標(biāo)記技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法分析鑒定[21]，其優(yōu)勢(shì)在于體液中相對(duì)豐度高、外層的脂質(zhì)雙分子層使其結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，有益于內(nèi)容物的提取分析。但外泌體的檢測(cè)還存在著許多問題，比如并未建立一套分離提純的標(biāo)準(zhǔn)程序，上述提到的離心法、免疫吸附法等都有造成蛋白質(zhì)污染的可能[22]，對(duì)實(shí)驗(yàn)研究造成了較大的阻礙?？傊?，當(dāng)前外泌體檢測(cè)難度大，檢測(cè)方法僅局限于實(shí)驗(yàn)室層面，在實(shí)際臨床應(yīng)用中不確定因素較多，克服技術(shù)難題、使其早日走向臨床應(yīng)用仍任重而道遠(yuǎn)。

2.4miRNA

miRNA是可以通過蛋白質(zhì)-miRNA復(fù)合體、外泌體、腫瘤相關(guān)血小板（TEP）等物質(zhì)攜帶釋放的非編碼RNA，長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸[23]，能夠?qū)虻霓D(zhuǎn)錄、翻譯進(jìn)行復(fù)雜的調(diào)控從而參與機(jī)體的病理生理過程。原癌基因和抑癌基因亦是一些miRNA的作用靶點(diǎn)，當(dāng)這些miRNA出現(xiàn)異常時(shí)將導(dǎo)致原癌基因被激活、抑癌基因失活，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[24]。

BOUTABB等[25]研究顯示，未經(jīng)治療的肺癌病人循環(huán)miR-16-5p、miR-92a-3p和miR-451a水平顯著高于健康個(gè)體，接受化療的病人miR-16-5p和miR-451a表達(dá)水平較未化療病人顯著降低，表明miRNA可能在肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵通路中發(fā)揮調(diào)控作用。XI等[26]的研究表明，外周血miR-146a、miR-200b、miR-7水平在肺結(jié)節(jié)和NSCLC病人體內(nèi)有明顯差異。另有一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，合并肺癌的COPD病人在診斷肺癌的前3年，其血清中的miR-1246和miR-206就存在顯著差異表達(dá)，說明miRNA可以用于肺癌的診斷及早期篩查[27]。

miRNA的分離提取和檢測(cè)過程尚無規(guī)范化程序，且當(dāng)前研究范圍較局限，欲準(zhǔn)確衡量其臨床價(jià)值還需大規(guī)模的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。

2.5TEP

TEP是新近興起的腫瘤生物標(biāo)志物，由腫瘤細(xì)胞將腫瘤相關(guān)分子轉(zhuǎn)移到血小板上，改變其RNA和蛋白質(zhì)而產(chǎn)生[28]，最早由BEST等[29]于2015年發(fā)現(xiàn)。

BEST等[29]分析肺癌病人和健康者的血小板mRNA譜，發(fā)現(xiàn)其識(shí)別肺癌病人的靈敏度和特異度分別達(dá)到了97.0%、94.0%，準(zhǔn)確度為96.0%。另有一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，NSCLC病人血小板整合素亞基α2b（ITGA2B）水平明顯高于健康者，在隊(duì)列研究中診斷Ⅰ期NSCLC的靈敏度和特異度分別為96.4%和78.6%[30]。

TEP在外周血中含量高、能富集腫瘤細(xì)胞RNA以反映腫瘤生物學(xué)信息，但其作用機(jī)制、應(yīng)用價(jià)值等方面的研究均處于起步階段，未來仍需要大量前瞻性研究來驗(yàn)證其應(yīng)用可行性。

2.6DNA甲基化

DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下將甲基

基團(tuán)添加到DNA分子堿基上，最常見胞嘧啶第5位碳原子與甲基的結(jié)合。DNA分子中某些區(qū)域有較高密度的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸（CpG），稱之為CpG島（CGIs），這些區(qū)域在正常情況下保持未甲基化狀態(tài)，而在惡性腫瘤病人體內(nèi)?？梢杂^察到抑癌基因啟動(dòng)子CGIs的高甲基化。異常的DNA甲基化會(huì)導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)改變、旋轉(zhuǎn)增加，影響基因轉(zhuǎn)錄，可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

一項(xiàng)研究結(jié)合臨床資料、影像和基于基因甲基化的PulmoSeek模型構(gòu)建PulmoSeek Plus模型，其在早期肺癌（0期和Ⅰ期）和5～10 mm結(jié)節(jié)中的診斷靈敏度分別為98.0%和99.0%，應(yīng)用該模型對(duì)肺結(jié)節(jié)進(jìn)行分類，可減少89.0%非必要手術(shù)并使延遲治療降低73.0%[31]。

DNA甲基化通過PCR擴(kuò)增更易檢出，且它可能是一種癌前改變，有益于在更早期發(fā)現(xiàn)病變[32]。但和其他生物標(biāo)志物一樣，其臨床應(yīng)用也需要更多大樣本研究的支持，實(shí)際應(yīng)用于臨床仍有很長(zhǎng)的路要走。

2.7腫瘤相關(guān)自身抗體

腫瘤細(xì)胞發(fā)生基因突變、重組，從而產(chǎn)生異常蛋白，連同腫瘤細(xì)胞死亡后釋放出的細(xì)胞內(nèi)蛋白，共同稱為腫瘤相關(guān)自身抗原，它可以激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，誘發(fā)產(chǎn)生腫瘤相關(guān)自身抗體[33]。

由英國Oncimmune公司研發(fā)的EarlyCDT-Lung肺癌相關(guān)自身抗體譜在歐美得到了推廣[34]。另外，經(jīng)一項(xiàng)大規(guī)模、多中心研究驗(yàn)證，我國針對(duì)亞洲人群基因特點(diǎn)研發(fā)的7種自身抗體檢測(cè)也在肺癌的早期診斷中表現(xiàn)出了很好的診斷效能，該自身抗體譜對(duì)Ⅰ期、Ⅱ期NSCLC病人和局限性小細(xì)胞肺癌病人的診斷靈敏度分別達(dá)到62.0%、59.0%和59.0%[35]。

2.8循環(huán)染色體異常細(xì)胞（CAC）

腫瘤細(xì)胞在復(fù)制的過程中常會(huì)發(fā)生染色體結(jié)構(gòu)的異常，從而產(chǎn)生CAC。攜帶3號(hào)（3p22.1，3q29）、10號(hào)（10q22.3，CEP10）染色體突變的外周血單個(gè)核細(xì)胞被命名為CAC，2010年首次在NSCLC病人外周血中被檢測(cè)到，據(jù)報(bào)道，CAC與原發(fā)腫瘤中的基因異常相似，與早期肺癌密切相關(guān)，且這些細(xì)胞的檢測(cè)不依賴于EpCAM，因此克服了CTC檢測(cè)的局限性[36]。

2020年KATZ等[37]公布了CAC在良惡性肺結(jié)節(jié)鑒別方面的研究成果，與組織活檢結(jié)果對(duì)照，CAC診斷的整體靈敏度為88.8%，特異度達(dá)100.0%。此外，YE等[38]進(jìn)行了前瞻性研究，檢測(cè)肺結(jié)節(jié)大小≤10 mm病人體內(nèi)的CAC，結(jié)果顯示其鑒別良惡性肺結(jié)節(jié)的靈敏度和特異度分別為70.5%和86.4%。

CAC作為液體活檢領(lǐng)域中的一種新選擇，對(duì)于肺結(jié)節(jié)良惡性鑒別、肺癌早期診斷的價(jià)值已得到了初步的研究驗(yàn)證，現(xiàn)已部分應(yīng)用于臨床，但尚未達(dá)到廣泛臨床應(yīng)用要求，隨著分離富集與檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)展，CAC的實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值有望得到進(jìn)一步提高。

以上各類生物標(biāo)記物對(duì)早期肺癌的診斷效能見表2。

3液體活檢的檢測(cè)方法

當(dāng)前，ctDNA是臨床應(yīng)用最廣泛的液體活檢生物標(biāo)志物，常用的檢測(cè)方法包括基于PCR的靶向檢測(cè)和以NGS為主的非靶向檢測(cè)。PCR技術(shù)原理是先對(duì)目標(biāo)DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，再進(jìn)行檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，但只能檢測(cè)部分已知可疑腫瘤基因片段。相比之下，NGS對(duì)所需DNA樣本的純度和濃度要求更低，能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)突變基因位點(diǎn)并對(duì)其進(jìn)行深度測(cè)序[41]，靈敏度和準(zhǔn)確性都有顯著提高。呂爽等[42]對(duì)比分析了NSCLC病人病理組織切片DNA檢測(cè)結(jié)果和NGS對(duì)其外周血ctDNA的檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩種方法無顯著差異，證明NGS檢測(cè)ctDNA突變具有較高的準(zhǔn)確性。

4液體活檢與人工智能（AI）輔助診斷聯(lián)合應(yīng)用

目前，AI越來越廣泛地應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域，在腫瘤的早篩早診方面，液體活檢與AI技術(shù)的聯(lián)合為實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療、提高診斷效率及準(zhǔn)確性提供了新的方向。

首先，經(jīng)典機(jī)器學(xué)習(xí)、深度學(xué)習(xí)、影像組學(xué)等AI技術(shù)較人力能夠更高效、自動(dòng)化地獲取影像學(xué)的深層圖像信息，與液體活檢的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于肺結(jié)節(jié)的檢出及良惡性鑒別意義較大。梁文華等[43]聯(lián)合AI分析CT影像與ctDNA甲基化檢測(cè)鑒別肺結(jié)節(jié)良惡性，將檢測(cè)模型的準(zhǔn)確率提高到了91.0%；YE等[44]綜合臨床特征、肺結(jié)節(jié)影像學(xué)特征、AI分析LDCT數(shù)據(jù)及液體活檢建立了一個(gè)早期肺癌預(yù)測(cè)模型，其靈敏度和特異度分別為89.5%和81.3%，AUC為0.88。

此外，將人工智能與液體活檢NGS相結(jié)合也為肺癌的早期診斷開辟了新的可能。首先通過NGS獲得肺癌病人的基因組信息，繪制基因組圖譜，再利用機(jī)器學(xué)習(xí)對(duì)其基因組信息進(jìn)行分析，構(gòu)建算法模型以用于肺癌的早期診斷[45]。已有研究對(duì)104例NSCLC病人的ctDNA特征譜和56例高風(fēng)險(xiǎn)病人的基因譜進(jìn)行深度學(xué)習(xí)，開發(fā)了對(duì)肺癌診斷效率達(dá)50.0%～70.0%的Lung-CLiP模型[46]。

5液體活檢在早期肺癌診斷中的優(yōu)勢(shì)與挑戰(zhàn)

液體活檢作為早期肺癌診斷的方法之一，因其安全、無創(chuàng)、便捷、可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的特點(diǎn)逐漸改變著傳統(tǒng)的診治模式。傳統(tǒng)組織活檢存在一定缺陷，如局部取樣所得樣本相對(duì)有限，且受到病灶大小及位置的影響，尤其是對(duì)于直徑小于10 mm的肺小結(jié)節(jié)及位于肺野中帶、內(nèi)帶肺結(jié)節(jié)穿刺難度大、準(zhǔn)確率低。另外，穿刺活檢作為一種侵入性檢查，面臨著氣胸、出血和咯血、胸膜反應(yīng)、空氣栓塞等并發(fā)癥的問題，在安全性及病人依從性方面較液體活檢有所不足。根據(jù)目前國內(nèi)外研究進(jìn)展，尚無影像學(xué)聯(lián)合組織活檢與液體活檢兩種檢測(cè)技術(shù)在肺結(jié)節(jié)診斷方面的比較研究，未來開展該領(lǐng)域的臨床研究將能夠?qū)υ搩煞N檢測(cè)技術(shù)的診斷效能做出更加客觀的對(duì)比。

然而，液體活檢仍不可取代組織活檢的診斷金標(biāo)準(zhǔn)價(jià)值，且其檢測(cè)的靈敏度和特異度有待進(jìn)一步提高，亟需更加靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)以及標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)規(guī)范，以提高肺癌診斷的準(zhǔn)確性、規(guī)范性及可推廣普及性。

6總結(jié)與展望

實(shí)現(xiàn)肺癌的早篩早診對(duì)提高病人生存率、指導(dǎo)針對(duì)性藥物應(yīng)用或外科治療、改善病人預(yù)后等意義重大。液體活檢為早期肺癌的診斷提供了新選擇，其與影像學(xué)、AI技術(shù)等相結(jié)合更是一種前景巨大的診斷模式。

作為早期肺癌診斷領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，液體活檢技術(shù)近年來發(fā)展迅猛，隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷更新、檢測(cè)程序逐漸規(guī)范化，結(jié)合基礎(chǔ)研究的理論支持及更多的臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證，液體活檢技術(shù)必能在早期肺癌的精確診斷、治療指導(dǎo)、預(yù)后判斷等方面實(shí)現(xiàn)其應(yīng)用價(jià)值。

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（本文編輯劉寧）