不同應激方式對小鼠恐懼記憶及其泛化的影響

［摘要］目的研究反復禁錮應激（RRS）和單次延長應激（SPS）對小鼠恐懼記憶及其泛化的影響。方法將8周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機分為4組，實驗組分別采用RRS和SPS處理，相應對照組未經任何處理。利用高架十字迷宮實驗檢測小鼠的焦慮水平，利用場景恐懼實驗檢測小鼠的恐懼記憶及其泛化。結果應激處理7 d后，RRS組和SPS組小鼠與其對照組相比均表現(xiàn)出明顯的焦慮樣行為（t=5.043、5.364，Plt;0.01）。RRS組小鼠電擊24 h后在電擊場景的僵立時間與對照小鼠相比無明顯差別（Pgt;0.05），電擊7、14 d后RRS小鼠在電擊場景的僵立時間百分比仍明顯高于新場景（Plt;0.001）。SPS組小鼠電擊24 h后在電擊場景的僵立時間百分比明顯高于對照組（Plt;0.01），兩組小鼠在電擊場景的僵立時間百分比均高于新場景；電擊7 d后SPS小鼠在電擊場景的僵立時間與新場景相比無明顯差別，對照小鼠在電擊場景的僵立時間百分比仍明顯高于新場景。結論SPS可增強小鼠場景恐懼記憶并促進其泛化，RRS對小鼠的場景恐懼記憶及其泛化無明顯影響。

［關鍵詞］應激障礙，創(chuàng)傷后；焦慮；恐懼；記憶障礙；小鼠，近交C57BL

［中圖分類號］R749.72［文獻標志碼］A［文章編號］2096-5532（2024）03-0372-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.099［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240729.1543.003;2024-07-3015：53：52

Effects of different stress paradigms on fear memory and its generalization in miceWANG Dengxu， GAO Shanshan， LI Nan， CHEN Lei， LI Boyi， ZHOU Yu （Department of Physiology and Pathophysiology， Basic Medical College， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［Abstract］ObjectiveTo investigate the effects of repeated restraint stress （RRS） and single prolonged stress （SPS） on fear memory and its generalization in mice. MethodsEight-week-old male C57BL/6J mice were randomly divided into four groups. The experimental groups were treated with either RRS or SPS， while the corresponding control groups underwent no treatment. Anxiety levels were assessed using the elevated plus maze test， and fear memory and its generalization were evaluated using the fear conditioning test. ResultsSeven days after stress treatment， both RRS and SPS mice exhibited significant anxiety-like behaviors compared to control mice （t=5.043，5.364;Plt;0.01）. Twenty-four hours after shock， the freezing time in the shock context did not differ significantly between RRS mice and control mice （Pgt;0.05）. However， on days 7 and 14 after shock， the freezing time in the shock context was still significantly higher in RRS mice compared to a new context （Plt;0.001）. For SPS mice， their freezing levels in the shock context 24 hours post-shock were significantly higher than those in control mice （Plt;0.01）. Both groups showed higher freezing time in the shock context compared to a new context; however， 7 days post-shock， the freezing time in the shock context for SPS mice did not differ significantly from that in the new context， whereas control mice showed significantly higher freezing time in the shock context compared to the new context.ConclusionSPS enhances contextual fear memory and promotes its generalization in mice， while RRS has no significant impact on contextual fear memory or its generalization.

［Key words］stress disorders， post-traumatic; anxiety; fear; memory disorders; mice， inbred C57BL

創(chuàng)傷后應激障礙（PTSD）是個體在面臨強烈創(chuàng)傷性刺激（如戰(zhàn)爭、自然災害、嚴重事故等）后產生的，嚴重影響人類身心健康的一種精神性疾病[1-3]。PTSD的病因復雜、機制不明[4-6]，目前尚未構建出可以完全模擬PTSD的動物模型，因此建立效應好的動物模型是研究其機制的關鍵。反復禁錮應激（RRS）和單次延長應激（SPS）是目前認同度比較高的PTSD建模方法，被應用于大鼠PTSD發(fā)病機制的研究[7-10]。小鼠作為最常用的模型動物，上述應激模型能否有效模擬小鼠PTSD核心特征——恐懼記憶的過度泛化，目前并不清楚[11-13]。為此，本研究采用RRS和SPS兩種不同的應激方式對小鼠進行處理，通過高架十字迷宮實驗檢測小鼠的焦慮樣行為，隨后檢測小鼠的場景恐懼記憶及其泛化，對PTSD造模效果進行綜合評價，以期為PTSD的研究和治療提供更多的新思路。

1材料與方法

1.1動物及其分組

C57BL/6J小鼠（8周齡雄鼠，體質量為25～30 g）飼養(yǎng)于青島大學醫(yī)學部清潔級動物房內，自由進食和飲水，12 h-12 h晝夜循環(huán)光照，保持室內恒濕（50±10）%、恒溫（21±2）℃狀態(tài)。在全部飼養(yǎng)過程及實驗過程中小鼠均自由進食和飲水，實驗前對小鼠的健康狀況進行評估，將小鼠隨機分分為4 組：RRS組7只及其對照組7只；SPS組8只及其對照組10只。所有行為學的動物實驗方案均得到青島大學醫(yī)學部倫理委員會的批準。

1.2實驗方法

1.2.1RRS實驗使用異氟烷輕度麻醉小鼠后，將其置入禁錮器中（直徑2.5 cm、長度10.0 cm透明且通氣良好的塑料管），關閉禁錮器兩端，使小鼠身體和頭部活動受限，期間密切關注小鼠的行為和生理狀態(tài)。每天禁錮1 h，連續(xù)4 d。

1.2.2SPS實驗將小鼠置入禁錮器中持續(xù)禁錮2 h（方法同1.2.1）后，強迫小鼠在25 ℃溫水中游泳10 min。將小鼠放回干凈籠具中休息15 min后，使用異氟烷進行短暫麻醉，再轉移至其固定飼養(yǎng)的籠具中休息30 min，然后將小鼠放入電擊箱進行足底電擊。電擊時先讓小鼠在電擊箱中自由探索3 min，接著給予0.75 mA持續(xù)2 s的足底電擊，電擊結束后將小鼠放回固定飼養(yǎng)的籠具中。

1.2.3高架十字迷宮實驗高架十字迷宮由4個臂組成（高度45 cm），包括兩個閉合臂和兩個開放臂（長度35 cm、直徑5 cm）。記錄小鼠行為的攝像頭位于迷宮中央正上方。實驗之前，噴灑體積分數(shù)0.70乙醇溶液消毒，確保環(huán)境清潔和無干擾。同時，調節(jié)燈光確保光線不影響小鼠在開放臂和閉合臂的活動。實驗開始時，小鼠被放置在迷宮中央，面向開放臂。攝像頭記錄5 min內小鼠在開放臂和閉合臂的停留時間，計算在開放臂停留時間百分比。每次實驗后，用體積分數(shù)0.70乙醇溶液清潔迷宮，以消除前一只小鼠留下的痕跡。

1.2.4場景恐懼實驗①場景恐懼訓練：將小鼠放入實驗箱中自由探索2.5 min以適應環(huán)境，分別在2.5、3.5、4.5 min時進行足底電擊1次。3次電擊強度相同，均為0.75 mA的電流持續(xù)2 s。電擊結束后，將小鼠放回固定飼養(yǎng)的籠具中。②場景恐懼測試：將小鼠依次放入電擊場景和新場景中自由探索5.0 min，分析小鼠在兩個場景中的僵立時間占總時間的百分比。當小鼠在電擊場景的僵立時間百分比明顯高于新場景時，判定為小鼠恐懼記憶模型建立成功。而在更遠時間點電擊場景和新場景中的僵立時間百分比無明顯差異時，說明小鼠無法正確區(qū)分兩個場景，即發(fā)生了恐懼記憶的泛化。

1.3統(tǒng)計學處理

使用Graph Pad Prism 6軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料實驗數(shù)據(jù)以±s形式表示，兩組高架十字迷宮實驗結果的均數(shù)比較采用t檢驗；兩組場景恐懼行為學測試結果的均數(shù)比較采用兩因素析因設計方差分析。以Plt;0.05表示差異有顯著性。

2結果

2.1RRS對小鼠焦慮、場景恐懼記憶及其泛化影響

高架十字迷宮測試結果顯示，RRS造模后第7天小鼠在開放臂停留時間百分比明顯低于對照組，差異有顯著性（t=5.364，Plt;0.01），表明RRS小鼠焦慮水平明顯提高。高架十字迷宮實驗后進行場景恐懼訓練，在訓練后第1、7和14天進行場景恐懼記憶測試。3次測試結果的析因設計方差分析顯示，組別與場景之間交互效應差異均無顯著性（F交互=1.043～1.801，P均gt;0.05），組別因素主效應差異均無顯著意義（F組別=0.033～2.078， P均gt;0.05），場景因素主效應差異均有顯著意義（F場景=34.700～165.500，P均lt;0.000 1）。單獨效應分析顯示，在電擊場景下對照組與RRS組比較差異均無顯著性（F=0.265～2.717，P均gt;0.05），在新場景下對照組與RRS組比較差異均無顯著意義（F=0.036～0.346，P均gt;0.05）。在對照組組內，電擊場景與新場景比較差異均有顯著性（F=7.597～30.105，P均lt;0.001）；在RRS組內，電擊場景與新場景比較差異有統(tǒng)計學意義（F=16.926～77.131，P均lt;0.000 1）。在第1天測試中，兩組小鼠在電擊場景的僵立時間百分比與新場景比較，差異均有顯著性（P均lt;0.000 1），即兩組小鼠成功建立場景恐懼記憶。在第7和14天的僵立時間百分比測試中，兩組小鼠在電擊場景的僵立時間仍均高于新場景（Plt;0.001、0.01），表明兩組小鼠在成功建立場景恐懼記憶后的第7和14天并未發(fā)生泛化。提示RRS可提高小鼠焦慮水平，但不影響小鼠的場景恐懼記憶的形成及其泛化。見表1。

2.2SPS對小鼠焦慮、場景恐懼記憶及其泛化影響

在SPS造模后的第7天進行高架十字迷宮實驗。實驗結果顯示，與對照組相比，SPS組小鼠在開放臂停留時間更短（t=5.043，Plt;0.001），表明SPS小鼠的焦慮水平顯著提高。在完成場景恐懼訓練后第1、7天進行場景恐懼實驗。2次測試結果的析因設計方差分析顯示，不同組別與場景之間交互效應差異均無顯著性（F交互=0.262、0.982，P均gt;0.05），組別因素主效應差異均有顯著性（F組別=11.980、14.990，P均lt;0.01），場景因素主效應差異均有顯著性（F場景=6.924、47.530，P均lt;0.01）。單獨效應分析顯示，電擊場景下對照組與SPS組在第1天比較差異有顯著性（F=13.141，Plt;0.01），而在第7天比較差異無顯著性（F=2.846，Pgt;0.05）；新場景下對照組與RRS組在第1、7天比較差異均有顯著性（F=4.776、5.411，P均lt;0.05）。對照組在第1、7天的電擊場景與新場景比較差異均有顯著性（F=9.637、13.238，P均lt;0.01）；SPS組在第1天的電擊場景與新場景比較差異有顯著性（F=10.490，Plt;0.01），而在第7天比較差異無顯著性（F=1.434，Pgt;0.05）。第1天的測試結果顯示，兩組小鼠在新場景和電擊場景中的僵立時間百分比均存在顯著差異，表明兩組小鼠均成功建立場景恐懼記憶；而且SPS組小鼠在電擊場景中的僵立時間百分比明顯高于對照組，表明SPS應激明顯提高小鼠的場景恐懼記憶。在完成場景恐懼訓練后第7天的測試結果顯示，對照組小鼠在電擊場景的僵立時間百分比依舊明顯高于新場景，而SPS組小鼠在新場景的僵立時間百分比與電擊場景的差異已無顯著性，表明SPS促進了小鼠場景恐懼記憶泛化。提示SPS不僅提高小鼠的焦慮水平，而且強化了小鼠的場景恐懼記憶并促其泛化。見表2。

3討論

恐懼記憶的泛化是指個體在經歷恐懼后，對于與恐懼刺激相似或相關的刺激也產生恐懼反應的現(xiàn)象，這是PTSD等疾病中創(chuàng)傷重現(xiàn)和警覺性增高的重要原因[14-15]。PTSD病人經常無法有效區(qū)分危險與安全環(huán)境，在安全環(huán)境中依然表現(xiàn)出較高的恐懼反應[16]，而這種不恰當?shù)膽し磻o病人帶來了極大的痛苦和傷害[17-18]。因此，建立穩(wěn)定且有效的PTSD模型，對于深入探討PTSD病人恐懼記憶過度泛化的發(fā)病機制至關重要。RRS和SPS是兩種常見的PTSD造模方式，以往的文獻報道應激后經過一定潛伏期，焦慮樣表型會更加明顯[19]。例如，小鼠在RRS剛結束后不會立即產生焦慮行為，而是在第7～12天時焦慮樣行為最明顯，具體表現(xiàn)為RRS小鼠在第7天后的高架十字迷宮實驗中，在開放臂的停留時間明顯縮短[19]；大鼠在SPS應激后7 d表現(xiàn)出明顯的焦慮樣行為，具體表現(xiàn)為大鼠在高架十字迷宮中開放臂的停留時間明顯縮短[20]。本文結果顯示，與對照組小鼠相比，SPS組與RRS組小鼠均在第7天表現(xiàn)出明顯的焦慮樣行為。這與以往報道的結果相符。

已有大量文獻報道，正常非應激小鼠在恐懼記憶形成后3～4周才會逐漸出現(xiàn)記憶的泛化[21]，即在電擊場景和新場景中的僵立時間無差別。本文結果表明，SPS組小鼠在恐懼記憶形成后第1天表現(xiàn)為場景恐懼記憶的增強，并且在第7天就已經出現(xiàn)了場景恐懼記憶的泛化，提示SPS導致小鼠發(fā)生恐懼記憶的過度泛化。但RRS組小鼠在恐懼記憶形成后第1～7天均未發(fā)生恐懼記憶的增強和泛化，究其原因可能是SPS的應激源是多樣的，而RRS的應激源是單一的且與誘發(fā)恐懼事件無直接關系。因此，SPS組小鼠在恐懼記憶形成后1周即出現(xiàn)明顯的記憶泛化，而RRS組小鼠在同一（第7天）或更遠程的時間點（第15天）都沒有出現(xiàn)恐懼記憶的泛化，即RRS小鼠恐懼記憶泛化的時間點要遠大于15 d。

綜上所述，RRS和SPS均能夠引起小鼠的焦慮樣行為，SPS可以顯著增強小鼠的恐懼記憶并促進其泛化，RRS則對小鼠的恐懼記憶及其泛化無明顯影響。本研究結果進一步說明不同應激模式對恐懼記憶及其泛化的影響不同，SPS不僅能夠模擬小鼠PTSD焦慮樣行為，而且還能模擬PTSD恐懼記憶的過度泛化這一核心癥狀。本實驗通過比較不同應激方式對恐懼記憶及其泛化的影響，明確了SPS是更適用于小鼠恐懼記憶泛化研究的PTSD模型，為未來針對恐懼記憶泛化的神經機制研究提供了一定的實驗依據(jù)。

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（本文編輯于國藝）