鋅原卟啉對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響

［摘要］目的探究血紅素加氧酶1（HO-1）抑制劑鋅原卟啉（ZnPP）對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞抗凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。方法以25 μmol/L的ZnPP處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后，使用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，采用Western blot的方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ZnPP對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞抗凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白（Bcl-2）與促凋亡蛋白Bcl2-Associated X蛋白（Bax）、剪切的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（Cleaved caspase 3）等蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果與對(duì)照組相比，以10 μmol/L的 ZnPP處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后細(xì)胞活力無(wú)明顯變化（F=14.720，q=2.819，P＞0.05）。而以25 μmol/L的 ZnPP作用于小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力明顯下降（q=7.591，P＜0.001）；細(xì)胞內(nèi)HO-1和Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，Cleaved caspase 3蛋白和Bax蛋白表達(dá)明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.975～5.189，P＜0.01）。結(jié)論ZnPP處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后可通過(guò)線粒體凋亡途徑激活細(xì)胞凋亡，此過(guò)程可能與抑制HO-1的作用有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］鋅；原卟啉類；血紅素加氧酶-1；小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；線粒體蛋白質(zhì)類

［中圖分類號(hào)］R977.9;R322.8［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［文章編號(hào)］2096-5532（2024）03-0368-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.045［開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.r.20240424.0942.001;2024-04-2417：13：28

Effect of zinc protoporphyrin on the expression of apoptosis-related proteins in BV2 microglial cellsLIU Rong， JING Cuiting， XIE Junxia， WANG Jun（Department of Physiology， School of Basic Medicine， Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）

［Abstract］ObjectiveTo investigate the effect of zinc protoporphyrin （ZnPP）， an inhibitor ofheme oxygenase 1 （HO-1）， on the expression levels of the anti-apoptosis-related proteins in BV2 microglial cells. MethodsBV2 microglial cells were treated with 25 μmol/L ZnPP for 24 hours. CCK-8 assay was used to measure cell viability， and Western blot was used to measure the changes in the protein expression levels of the anti-apoptotic protein B-cell lymphoma-2 （Bcl-2） and the pro-apoptotic proteins Bcl-2 related X protein （Bax） and Cleaved caspase-3 induced by ZnPP in BV2 microglial cells.ResultsCompared with the control group， the BV2 microglial cells treated with 10 μmol/L ZnPP for 24 hours showed no significant change in cell viability （F=14.720，q=2.819，Pgt;0.05）， while the microglial cells treated with 25 μmol/L ZnPP for 24 hours showed a significant reduction in cell viability （q=7.591，Plt;0.01）， as well as significant reductions in the protein expression levels of HO-1 and Bcl-2 and significant increases in the protein expression levels of Cleaved caspase-3 and Bax （t=2.975-5.189，Plt;0.01）.ConclusionTreatment of BV2 microglial cells with ZnPP can activate cell apoptosis through the mitochondrial apoptosis pathway， possibly by inhibiting HO-1.

［Key words］zinc; protoporphyrins; heme oxygenase-1; microglia; apoptosis; mitochondrial proteins

帕金森?。≒D）是一類復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病，其主要臨床癥狀表現(xiàn)為靜止性震顫、肌僵直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)不穩(wěn)等[1-2]。PD的病理特征主要與黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性丟失有關(guān)[3-4]。近年來(lái)，有大量的體外、體內(nèi)和人體研究表明，細(xì)胞凋亡與PD的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[5]。鋅原卟啉（ZnPP）是血紅素合成過(guò)程中產(chǎn)生的一種中間體，是血紅素加氧酶1（HO-1）的抑制劑[6]。HO-1是血紅素降解途徑中的限速酶，它可以與NADPH細(xì)胞色素P450還原酶裂解血紅素生成一氧化碳、二價(jià)鐵和膽綠素。膽綠素可被其還原酶還原生成膽紅素[7]。在腦缺血再灌注模型中，ZnPP能通過(guò)抑制HO-1來(lái)調(diào)節(jié)血紅素分解代謝，從而促進(jìn)大鼠海馬細(xì)胞凋亡并加重?fù)p傷[8]。在小鼠原代肝細(xì)胞中，用ZnPP處理后可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)加重肝損傷[9]。但是，對(duì)于用ZnPP處理小膠質(zhì)細(xì)胞后，細(xì)胞是否會(huì)發(fā)生凋亡目前尚不清楚。因此，本研究使用ZnPP抑制HO-1的表達(dá)，檢測(cè)ZnPP對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中抗凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白（Bcl-2）與促凋亡蛋白Bcl2-Associated X蛋白（Bax）、剪切的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（Cleaved caspase 3）等蛋白表達(dá)的影響，為后續(xù)研究神經(jīng)退行性疾病提供新的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

BV2小膠質(zhì)細(xì)胞購(gòu)置于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心，DMEM培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone公司），胎牛血清（中國(guó)依科賽生物科技有限公司），青霉素-鏈霉素溶液（北京索萊寶科技有限公司），D-多聚賴氨酸、ZnPP（美國(guó)Sigma公司），Cleaved caspase 3抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體和β-actin抗體（Abcam公司），HRP-IgG抗體（中國(guó)博奧森公司）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與處理

將BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)在含有體積分?jǐn)?shù)為0.10的胎牛血清和加有青霉素（100 kU/L）-鏈霉素（0.1 g/L）的DMEM高糖培養(yǎng)液中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞以2×108/L的密度接種于預(yù)先鋪有D-多聚賴氨酸的6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)到70%～80%融合時(shí)，采用ZnPP（25 μmol/L）處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，并置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活力的CCK-8法檢測(cè)

分別向BV2細(xì)胞中加入濃度為0、10、25 μmol/L的ZnPP溶液，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸出原培養(yǎng)液，加入100 μL的基礎(chǔ)培養(yǎng)液、10 μL的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中避光孵育1～4 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度，并按照公式計(jì)算細(xì)胞活力。

1.4Cleaved caspase 3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)檢測(cè)

用ZnPP處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后，按照文獻(xiàn)方法[10]處理細(xì)胞，分別用Cleaved caspase 3（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）和β-actin（1∶10 000）一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST清洗3次后用羊抗兔HRP-IgG（1∶10 000）二抗室溫孵育1 h。使用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影，掃描后用Image J軟件分析結(jié)果。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graph Pad Prism 9.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s形式表示，兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用Tukey法。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果

2.1ZnPP對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活性影響

使用不同濃度ZnPP（0、10、25 μmol/L，n=5）作用于BV2小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力分別為1.000±0.007、0.956±0.029和0.881±0.053，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.720，P＜0.001）。其中濃度為10 μmol/L的ZnPP組與對(duì)照組（0 μmol/L的ZnPP）相比較，細(xì)胞活力無(wú)明顯變化（q=2.819，P＞0.05）；而25 μmol/L的ZnPP組細(xì)胞活力與對(duì)照組相比明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=7.591，P＜0.001）。

2.2ZnPP對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞HO-1蛋白表達(dá)的影響

對(duì)照組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞HO-1蛋白表達(dá)量為1.758±0.302，25 μmol/L的ZnPP處理組（ZnPP組）為1.171±0.288。與對(duì)照組相比，ZnPP組HO-1蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.975，P＜0.05）。

2.3ZnPP對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響

與對(duì)照組相比較，25 μmol/L的ZnPP處理組（ZnPP組）BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的Cleaved caspase 3與Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降，且Bcl-2/Bax表達(dá)比值降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.753～17.450，P＜0.05）。見(jiàn)表1。

3討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種死亡方式，主要表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、胞膜內(nèi)陷、核膜破裂以及染色質(zhì)凝集等變化[11-12]。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞凋亡可以大致分為兩種途徑：一種是內(nèi)在途徑，即線粒體凋亡途徑，該途徑主要受到Caspase 3、Bcl-2和Bax等凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)；另一種是外在途徑，也稱為死亡受體介導(dǎo)的途徑，這條途徑主要依賴于腫瘤壞死因子受體家族的死亡受體調(diào)節(jié)[13-15]。已有研究結(jié)果表明，細(xì)胞過(guò)度凋亡或者凋亡不足與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[16-18]。

PD是繼阿爾茨海默病后被發(fā)現(xiàn)的第二大類常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，其運(yùn)動(dòng)特征表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)遲緩、肌僵直、靜止性震顫和姿勢(shì)異常等。除此之外，還有許多非運(yùn)動(dòng)癥狀，如嗅覺(jué)異常、睡眠異常、焦慮和抑郁等[19-21]。PD的病理特征主要為黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性丟失以及路易體的形成[22]。而中腦黑質(zhì)是腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞分布密度最高的區(qū)域，該細(xì)胞激活可以產(chǎn)生大量的自由基進(jìn)而損傷多巴胺能神經(jīng)元[23]。盡管PD的病因尚不清楚，但是有研究結(jié)果表明，衰老是其主要的危險(xiǎn)因素[24]。目前針對(duì)PD的治療多為藥物療法、基因療法和細(xì)胞療法等[25-27]。這些方法有一個(gè)共同的特點(diǎn)，它們僅僅只能起到緩解病情的作用，并不能治愈疾病。因此，現(xiàn)在迫切需要尋找和開(kāi)發(fā)新的治療策略。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)轉(zhuǎn)基因小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)表達(dá)HO-1時(shí)，會(huì)出現(xiàn)一系列PD相關(guān)改變，如明顯的運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)、黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元減少、基底神經(jīng)節(jié)鐵沉積、線粒體損傷/線粒體自噬等與PD相符的異常[28]。此外對(duì)小鼠腦出血模型研究發(fā)現(xiàn)，HO-1表達(dá)主要出現(xiàn)在血腫區(qū)域周圍的小膠質(zhì)細(xì)胞中[29]。并且在凝血酶誘導(dǎo)的腦損傷中也觀察到，HO-1的缺失與活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量減少有關(guān)[30]。所以從PD的致病因素來(lái)看，HO-1的表達(dá)水平將會(huì)是一個(gè)值得研究的新方向。

HO-1是一種由人類的HMOX1基因編碼的應(yīng)激誘導(dǎo)同工酶[31]。它可以被多種刺激因素如脂多糖、炎性因子、重金屬以及紫外線等誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平表達(dá)[32-35]。ZnPP是一種天然存在的金屬原卟啉，在體內(nèi)缺鐵或鐵的利用率低時(shí)就會(huì)導(dǎo)致ZnPP合成增加，進(jìn)而抑制HO-1的表達(dá)水平[6，36]。既往的研究表明，ZnPP通過(guò)抑制HO-1可以阻斷白楊素對(duì)膿毒癥引起的心功能障礙的保護(hù)作用[37]。在用ZnPP處理人晶狀體上皮細(xì)胞后則發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2的保護(hù)作用發(fā)生顯著降低，并且細(xì)胞發(fā)生凋亡[38]。這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。本文的研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比較，用抑制劑ZnPP處理的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)HO-1與Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，Cleaved caspase 3與Bax蛋白表達(dá)明顯升高，而且Bcl-2/Bax比值明顯下降。這表明用ZnPP抑制HO-1的表達(dá)可以通過(guò)激活線粒體凋亡途徑來(lái)增加小膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，此過(guò)程可能與HO-1的調(diào)控有關(guān)。正如前所述，HO-1的表達(dá)水平在PD的進(jìn)展過(guò)程中十分重要，而小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并最終加劇PD的病理進(jìn)展。所以，盡管HO-1與細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制還尚不完全清楚，但是靶向HO-1或者調(diào)控HO-1的活性可能會(huì)為后續(xù)研究神經(jīng)退行性疾病提供一個(gè)新的有意義的方向。

當(dāng)然，本文實(shí)驗(yàn)?zāi)壳斑€有很多不足。我們僅在小膠質(zhì)細(xì)胞系中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，后續(xù)將會(huì)進(jìn)一步在動(dòng)物模型中進(jìn)行驗(yàn)證，繼續(xù)探究HO-1與線粒體凋亡途徑之間的關(guān)聯(lián)，以及其調(diào)控細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，以期為神經(jīng)退行性疾病新療法的開(kāi)發(fā)，以及新治療策略和生物標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)提供新的思路。

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