外側(cè)下丘腦與黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的纖維投射

［摘要］目的研究黑質(zhì)致密部（SNpc）多巴胺能神經(jīng)元是否接受外側(cè)下丘腦（LH）的纖維投射。方法使用逆行示蹤劑、轉(zhuǎn)基因小鼠和順向病毒示蹤技術(shù)探究LH與SNpc的投射關(guān)系。在C57BL/6雄性小鼠（8周齡）的SNpc區(qū)注射逆行示蹤劑霍亂毒素亞基-B結(jié)合熒光素488（CTB-488），1周后制備冷凍腦切片，應(yīng)用Olympus VS120熒光顯微鏡觀察LH腦區(qū)CTB-488陽(yáng)性神經(jīng)元。在TH-Cre轉(zhuǎn)基因雄性小鼠（8周齡）的LH注射順向跨突觸病毒AAV-hSyn-Flp-WPRE-hGH，在SNpc注射AAV-hSyn-Con/Fon-EYFP-WPRE-hGH，3周后灌注取腦并切片，觀察SNpc和紋狀體（Str）區(qū)EYFP陽(yáng)性細(xì)胞及纖維。結(jié)果逆行示蹤實(shí)驗(yàn)表明，CTB-488注射后可在LH區(qū)觀察到CTB-488陽(yáng)性神經(jīng)元，提示LH可能是SNpc的上游腦區(qū)。順向病毒追蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在小鼠SNpc觀察到明顯的EYFP陽(yáng)性神經(jīng)元且在Str可觀察到EYFP陽(yáng)性纖維，提示LH支配SNpc的多巴胺能神經(jīng)元。結(jié)論LH是SNpc的上游腦區(qū)，并支配SNpc的多巴胺能神經(jīng)元。

［關(guān)鍵詞］帕金森??；黑質(zhì)；下丘腦區(qū)，側(cè)；多巴胺能神經(jīng)元；神經(jīng)纖維；小鼠，轉(zhuǎn)基因

［中圖分類(lèi)號(hào)］R742.5;R322.81［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［文章編號(hào)］2096-5532（2024）03-0359-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.047［開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240424.0942.003;2024-04-2416：52：19

Fibrous projections of the lateral hypothalamus to dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compactaPAN Xuening， WANG Xiaoya， XIE Junxia， XU Huamin（Department of Physiology and Pathophysiology， Medical College of Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［Abstract］ObjectiveTo investigate whether dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta （SNpc） can receive fibrous projections from the lateral hypothalamus （LH）.MethodsThe techniques of retrograde tracers， transgenic mice， and anterograde neural circuit tracers were used to investigate the projection from the LH to the SNpc. The retrograde tracer cho-lera toxin subunit B （recombinant） Alexa FluorTM 488 conjugate （CTB-488） was injected into the SNpc of male C57BL/6 mice aged 8 weeks; one week later， the brain was collected to prepare frozen brain slices， and the Olympus VS120 fluorescence microscope was used to observe CTB-488-positive neurons in the LH. The anterograde transneuronal virus AAV-hSyn-Flp-WPRE-hGH was injected into the LH of male TH-Cre transgenic mice aged 8 weeks， and AAV-hSyn-Con/Fon-EYFP-WPRE-hGH was injected into the SNpc of the mice; three weeks later， the brain was collected to prepare brain slices and observe EYFP-positive cells and fibers in the SNpc and the striatum （Str）. ResultsThe retrograde tracer experiment showed that CTB-488-positive neurons were observed in the LH after the injection of CTB-488， indicating that the LH might be the upstream brain region of the SNpc. The anterograde transneuronal virus tracking experiment showed that EYFP-positive neurons were observed in the SNpc of mice and EYFP-positive nerve fibers were observed in the Str， suggesting that the LH might dominate the dopaminergic neurons in the SNpc. ConclusionThe LH is the upstream brain region of the SNpc and may dominate the dopaminergic neurons in the SNpc.

［Key words］Parkinson disease; substantia nigra; hypothalamic area， lateral; dopaminergic neurons; nerve fibers; mice， transgenic

帕金森?。≒D）的臨床特征包括運(yùn)動(dòng)癥狀和非運(yùn)動(dòng)癥狀，如肌僵直、靜止性震顫和焦慮、抑郁等[1]。其病理特征為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失[2-3]。盡管其臨床和病理特征已得到充分證實(shí)，然而多巴胺能神經(jīng)元損傷的機(jī)制尚未完全闡明[3-5]。研究表明，黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元參與的環(huán)路異常是導(dǎo)致PD的重要機(jī)制之一[3，6]。黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元主要位于背側(cè)的黑質(zhì)致密部（SNpc），并投射到背側(cè)紋狀體（Str）[7-8]。外側(cè)下丘腦（LH）是下丘腦的外側(cè)部分，含有許多神經(jīng)肽[9]，表達(dá)神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸或γ-氨基丁酸[10-12]。有研究結(jié)果顯示，將逆行示蹤劑氟金注射到LH中，在SNpc中觀察到了氟金陽(yáng)性細(xì)胞[13]，提示SNpc可以投射到LH。但是，SNpc的多巴胺能神經(jīng)元是否接受LH的纖維投射尚不清楚。本文采用更靈敏高效的逆向示蹤劑霍亂毒素亞基-B結(jié)合熒光素488（CTB-488）驗(yàn)證LH是SNpc的上游腦區(qū)，首次用TH-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠探究LH對(duì)SNpc多巴胺能神經(jīng)元的纖維投射。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物選擇及飼養(yǎng)SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠（8周齡）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；SPF級(jí)雄性TH-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠為在本實(shí)驗(yàn)室建立鑒定、繁殖體系。飼養(yǎng)條件：室溫（22±2）℃，濕度（50±2）%，12 h-12 h晝夜循環(huán)光照，可自由飲食。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物使用和管理經(jīng)青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑及來(lái)源CTB-488購(gòu)自武漢樞密腦科學(xué)技術(shù)有限公司。順向示蹤病毒：AAV-hSyn-Flp-WPRE-hGH（血清型2/1，滴度：1.00E+13 VG/mL）和AAV-hSyn-Con/Fon-EYFP-WPRE-hGH（血清型2/9，滴度：2.0E+12 VG/mL），購(gòu)自武漢樞密腦科學(xué)技術(shù)有限公司。生理鹽水購(gòu)自山東齊都藥業(yè)有限公司，異氟烷購(gòu)自瑞沃德公司，阿佛丁購(gòu)自南京愛(ài)貝生物科技有限公司。酪氨酸羥化酶（TH）抗體購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，Alexa Fluor 555 Donkey anti-mouse IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1腦立體定位注射使用異氟烷對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，將其固定于腦立體定位儀，調(diào)節(jié)左右耳桿與小鼠兩耳間連線平行。選定腦部中間位置，剪除小鼠顱頂被毛后用碘附或體積分?jǐn)?shù)0.75的乙醇溶液消毒，縱向剪開(kāi)頭皮，用棉簽蘸取適量生理鹽水輕輕擦拭顱骨表面，剝離附著在顱頂骨表面的黏膜，顯露前囟點(diǎn)，取其坐標(biāo)定位零點(diǎn)，調(diào)整耳桿與儀器使前囟與后囟在同一水平位置，并調(diào)整左右兩側(cè)至水平。將玻璃電極中注入液體石蠟排除空氣，連接微量注射泵（瑞沃德公司），并吸取適量病毒溶液，將微量注射電極置于前囟點(diǎn)位置歸零。根據(jù)小鼠腦定位圖譜確定腦區(qū)坐標(biāo)參數(shù)，定位注射點(diǎn)并用顱骨鉆開(kāi)顱（直徑為0.5 mm），將玻璃電極插入目標(biāo)腦區(qū)后以60 nL/min流量進(jìn)行逆向示蹤劑CTB-488和順向示蹤病毒注射，注射完畢后對(duì)小鼠術(shù)區(qū)頭皮進(jìn)行消毒縫合。具體操作步驟如下。

逆向示蹤劑CTB-488注射：將65 nL的 CTB-488單側(cè)注射于C57BL/6雄性小鼠（8周齡）的SNpc腦區(qū)，以前囟為原點(diǎn)，坐標(biāo)為AP-2.92 mm、ML-1.50 mm、DV-4.40 mm。注射完成1周后進(jìn)行灌注取腦。

順向示蹤病毒注射：將40 nL順向跨突觸病毒AAV-hSyn-Flp-WPRE-hGH單側(cè)注射于TH-Cre轉(zhuǎn)基因雄性小鼠（8周齡）的LH腦區(qū)，以其前囟點(diǎn)為原點(diǎn)，坐標(biāo)為AP-1.25 mm、ML-1.10 mm、DV-5.20 mm；將50 nL的AAV-hSyn-Con/Fon-EYFP-WPRE-hGH單側(cè)注射于TH-Cre轉(zhuǎn)基因雄性小鼠SNpc腦區(qū)，坐標(biāo)為AP-2.92 mm、ML-1.50 mm、DV-4.40 mm。注射完成3周后進(jìn)行灌注取腦。

1.2.2小鼠腦組織切片樣本制備及觀察小鼠腹腔注射12.5 g/L的阿佛丁溶液進(jìn)行麻醉，注射劑量為20 mL/kg體質(zhì)量，待小鼠深度麻醉后剪開(kāi)肋骨暴露心臟，使用生理鹽水和40 g/L多聚甲醛溶液進(jìn)行灌注并取腦（在生物安全柜通風(fēng)條件下進(jìn)行）。將鼠腦置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定6～12 h，固定完成后放入300 g/L蔗糖溶液中48 h（鼠腦沉入蔗糖溶液底部）。取出鼠腦使用冷凍切片機(jī)制備厚30 μm腦切片。小鼠腦片以0.01 mol/L 的PBS溶液清洗后，用抗熒光淬滅封片液（含DAPI）封片，使用Olympus VS120熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.3免疫熒光染色將厚度30 μm冷凍腦組織切片在0.01 mol/L的PBS中搖床清洗3次，每次10 min。隨后使用體積分?jǐn)?shù)0.05驢血清封閉1 h，然后加入TH一抗（稀釋比1∶1 000）4 ℃搖床孵育過(guò)夜。次日于0.01 mol/L的PBS中搖床清洗3次，每次10 min。清洗完畢后，加入Alexa Fluor 555 Donkey anti-mouse IgG二抗（1∶500）室溫孵育2 h。取出腦切片在0.01 mol/L的PBS中搖床清洗3次，每次10 min。最后進(jìn)行貼片，用抗熒光淬滅封片液（含DAPI）封片，使用Olympus VS120熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

2結(jié)果

2.1逆向追蹤SNpc的上游腦區(qū)

本研究將逆向示蹤劑CTB-488注射至5只C57BL/6雄性小鼠（8周齡）腦部的SNpc（圖1A），注射1周后進(jìn)行灌注取腦并制作切片（30 μm），應(yīng)用Olympus VS120熒光顯微鏡觀察CTB-488陽(yáng)性神經(jīng)元。結(jié)果顯示，在小鼠SNpc中可觀察到CTB-488細(xì)胞（綠色），表明注射的位點(diǎn)準(zhǔn)確。在SNpc中CTB-488陽(yáng)性細(xì)胞（綠色）部分與TH陽(yáng)性細(xì)胞（紅色）共標(biāo)（圖1B）。同時(shí)，在LH中觀察到CTB-488陽(yáng)性細(xì)胞（綠色，圖1C）。提示LH可能是SNpc的上游腦區(qū)。

2.2順向示蹤驗(yàn)證LH是SNpc的上游腦區(qū)

TH-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠SNpc中多巴胺能神經(jīng)元表達(dá)Cre重組酶。選取5只轉(zhuǎn)基因小鼠，在LH注射的Flp重組酶順向跨突觸至下游SNpc，在SNpc注射依賴Flp重組酶和Cre重組酶表達(dá)的AAV-hSyn-Con/Fon-EYFP-WPRE-hGH（圖2A）。因此，LH投射至SNpc的多巴胺能神經(jīng)元可表達(dá)EYFP。順向病毒追蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在SNpc觀察到了EYFP陽(yáng)性神經(jīng)元胞體（綠色，圖2B），在SNpc中EYFP陽(yáng)性神經(jīng)元（綠色）部分與TH陽(yáng)性細(xì)胞（紅色）共標(biāo)（圖2C），說(shuō)明LH可能支配SNpc的多巴胺能神經(jīng)元。在Str觀察到了EYFP陽(yáng)性神經(jīng)纖維（綠色，圖2D）。提示LH可能支配TH-Cre小鼠SNpc的多巴胺能神經(jīng)元，并投射至Str。

3討論

PD是世界第二大類(lèi)神經(jīng)退行性疾病，雖然文獻(xiàn)報(bào)道了不同因素在PD發(fā)病中的可能作用，但其確切機(jī)制尚未闡明。目前對(duì)PD的治療主要是藥物療法，如左旋多巴類(lèi)藥物，左旋多巴是DA的前體，可通過(guò)血-腦脊液屏障，代替缺失的DA發(fā)揮作用。但長(zhǎng)期服用左旋多巴會(huì)引起許多副作用，如惡心、嘔吐等；并且左旋多巴和其他藥物只能控制PD癥狀，并不能減緩多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性死亡[14-15]。深部腦刺激（DBS）和干細(xì)胞移植也是近年來(lái)興起的新方法。雖然DBS治療可以改善部分PD病人的癥狀，但并不是對(duì)所有的病人都有效[16-17]。而將胎兒的神經(jīng)干細(xì)胞移植到PD病人的Str，是具有爭(zhēng)議性的一種治療方法，涉及倫理問(wèn)題[18-19]。因此，作為PD發(fā)病的關(guān)鍵腦區(qū)——富含多巴胺能神經(jīng)元的SNpc，是研究PD發(fā)病及治療的重點(diǎn)腦區(qū)。探究SNpc的上游腦區(qū)對(duì)闡明PD中異常的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制有重要意義，可為PD的治療提供新的方向。

霍亂毒素亞單位B（CTB）是目前應(yīng)用廣泛的一類(lèi)逆行示蹤劑，來(lái)源于霍亂弧菌產(chǎn)生的霍亂毒素。CTB可通過(guò)與神經(jīng)元突觸膜上的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的戊多糖鏈結(jié)合附于細(xì)胞表面，可被軸突末端吸收并逆向運(yùn)輸至胞體，進(jìn)而特異、高效地逆行標(biāo)記神經(jīng)元。CTB-488將CTB與熒光素488結(jié)合，作為熒光逆向示蹤劑，目前已被廣泛用于逆行示蹤。本實(shí)驗(yàn)采用CTB-488逆向追蹤小鼠SNpc的上游腦區(qū)，相較于前期的氟金法，CTB具有更靈敏高效的標(biāo)記性，我們的研究結(jié)果也與先前的報(bào)道一致[3]，證實(shí)LH可能是SNpc的上游腦區(qū)。進(jìn)而我們創(chuàng)新性地將順行跨突觸病毒AAV-hSyn-Flp-WPRE-hGH注射至TH-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠的LH中，并且在小鼠的同側(cè)SNpc中注射順行病毒AAV-hSyn-Con/Fon-EYFP-WPRE-hGH。結(jié)果顯示，在小鼠SNpc觀察到EYFP標(biāo)記的多巴胺能神經(jīng)元胞體，且在Str觀察到EYFP陽(yáng)性的神經(jīng)纖維。上述結(jié)果提示，LH可能是SNpc上游腦區(qū)，并支配SNpc的多巴胺能神經(jīng)元，這為PD的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制探討提供了新的思路，也為研究LH-SNpc環(huán)路在PD中的作用提供了理論基礎(chǔ)。

SNpc的多巴胺能神經(jīng)元可以投射至Str[20]。研究發(fā)現(xiàn)，在中腦切片中Sox6+多巴胺能神經(jīng)元包括一個(gè)Aldh1a1+亞群（主要分布于SNpc腹側(cè)），在PD中丟失嚴(yán)重，這些神經(jīng)元投射到背側(cè)Str，參與學(xué)習(xí)運(yùn)動(dòng)的調(diào)控[21-24]。此外，有研究證實(shí)，在PD中SNpc腹側(cè)的多巴胺能神經(jīng)元比背側(cè)的易感性更強(qiáng)[25-26]。另外，上丘（SC）可投射至SNpc的多巴胺能神經(jīng)元，激活此環(huán)路可增強(qiáng)小鼠的食欲運(yùn)動(dòng)[27]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，SNpc可投射至外側(cè)眶額葉皮質(zhì)（LOFC），這一環(huán)路與動(dòng)物自我梳理行為有關(guān)[28]。這說(shuō)明SNpc參與的環(huán)路可以調(diào)控多種行為，探究SNpc所涉及的神經(jīng)環(huán)路具有重要意義。

已有研究證實(shí)，LH的神經(jīng)元活動(dòng)在十字高架迷宮開(kāi)放臂探索性活動(dòng)中十分重要[29-30]。此外，LH釋放的神經(jīng)肽在控制食物攝入方面起著至關(guān)重要的作用[31]。先前的一項(xiàng)研究表明，LH中的DA水平會(huì)隨著食物攝入而增加[32]；而阻斷LH中的DA受體會(huì)增加小鼠的食物攝入量[33-34]。有研究結(jié)果證實(shí)，SNpc是LH的上游腦區(qū)，參與攝食運(yùn)動(dòng)的調(diào)控[13]。結(jié)合本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，LH與SNpc之間可能存在相互投射的關(guān)系，這種雙向的投射關(guān)系提示二者可能參與不同行為的調(diào)控。綜合上述對(duì)LH與SNpc的功能研究，我們推測(cè)LH-SNpc環(huán)路可能參與調(diào)控PD誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)障礙。而進(jìn)一步探討LH-SNpc環(huán)路的功能及其在PD中的作用，可能為PD的環(huán)路機(jī)制研究提供新的方向。

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