胚胎期Wnt3a基因特異性敲降對小鼠大腦神經發(fā)生的影響

［摘要］目的研究胚胎期第13天（E13）特異性敲降Wnt3a基因對小鼠大腦神經發(fā)生的影響。方法利用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）驗證Wnt3a在腦皮質神經干細胞中的敲降率。通過子宮內電穿孔實驗在E13時將Wnt3a-shRNA質粒電轉到胎鼠大腦皮質中，從而下調Wnt3a在腦皮質神經干細胞中的表達。在E16時收取小鼠腦組織，進行免疫熒光染色檢測，觀察下調Wnt3a后小鼠腦組織中神經元發(fā)育進程的改變。結果RT-qPCR結果顯示，神經干細胞中Wnt3a敲降后其mRNA表達水平降低54%，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（t=11.260，Plt;0.001）。免疫熒光染色結果顯示，Wnt3a下調導致大腦皮質的皮質板（CP）中的綠色熒光蛋白（GFP）陽性細胞比例降低，大腦中間帶（IZ）的GFP陽性細胞比例上升，差異均具有統(tǒng)計學意義（t=4.400、4.482，Plt;0.01）。結論E13時特異性下調小鼠腦中Wnt3a基因導致GFP熒光分布異常，神經發(fā)生過程受到干擾。

［關鍵詞］Wnt3A蛋白質；小鼠，基因敲除；神經發(fā)生；大腦皮質；胚胎發(fā)育；電穿孔

［中圖分類號］R977.6;R329.21［文獻標志碼］A［文章編號］2096-5532（2024）03-0355-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.051［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240426.1149.003;2024-04-2915：01：03

Effect of the specific knockdown of Wnt3a in embryonic stage on neurogenesis in mouse brainZHAO Cheng， JIAO Jianwei（State Key Disciplines： Physiology （Incubation）， Department of Physiology， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［Abstract］ObjectiveTo investigate the effect ofspecific knockdown of the Wnt3a gene at embryonic day 13 （E13） on brain neurogenesis in mice.MethodsRT-qPCR was used to verify the knockdown rate of Wnt3a in neural stem cells in the cerebral cortex， and intrauterine electroporation was used to transfect Wnt3a-shRNA plasmid into the cerebral cortex of fetal mice at E13 to downregulate the expression of Wnt3a in neural stem cells in the cerebral cortex. The mouse brain tissue samples were collected at embryonic day 16 （E16）， and immunofluorescent staining was performed to observe the changes in neuronal development after the downregulation of Wnt3a.ResultsRT-qPCR showed that the mRNA expression level of Wnt3a in neural stem cells was reduced by 54% after knockdown， with a significant difference compared with the control group （t=11.260，Plt;0.001）. Immunofluorescent staining showed that the downregulation of Wnt3a led to a reductionin the proportion of green fluorescent protein （GFP）-positive cells in the cortical plateof the cerebral cortexand an increase in the proportion of GFP-positive cells in the intermediate zone （IZ） （t=4.400，4.482;Plt;0.01）.ConclusionThe specific downregulation of the Wnt3a gene in the brain of mice at E13 can lead to an aberrant distribution of GFP fluorescence， thereby disrupting the process of neurogenesis.

［Key words］Wnt3A protein; mice， knockout; neurogenesis; cerebral cortex; embryonic development; electroporation

小鼠的大腦皮質是一個極其復雜的腦組織結構，它承載著多種重要的生物功能，其中包括學習、記憶和認知等[1-4]。近年來，越來越多的人開始探索大腦發(fā)育過程中的奧秘，其中神經發(fā)生過程受到廣泛的關注。神經發(fā)生過程是一個復雜且有序的事件，其中神經干細胞的分化和增殖是大腦皮質正常發(fā)育的重要基礎[5]。神經干細胞能夠分化并且發(fā)育為神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞[6-7]。其中神經元能夠隨著發(fā)育的進程而有序地遷移到特定位置，進而發(fā)揮其生理功能[8-9]。在大腦發(fā)育過程中，每一個過程都受到各種基因和眾多外部信號之間復雜相互作用的精確調節(jié)，這個過程中任何的異常改變都可能改變神經干細胞的發(fā)育命運，如果神經發(fā)育進程受到干擾，會擾亂大腦皮質的正常結構和生理功能，進而導致多種神經系統(tǒng)疾病，如腦部畸形、自閉癥等相關疾病[10-12]。眾所周知，Wnt基因家族編碼的蛋白質能夠參與胚胎發(fā)育過程中的細胞命運和發(fā)育模式的調節(jié)，進而影響細胞遷移、分化和增殖等[13-15]。Wnt3a是Wnt家族的一員，在經典的Wnt信號通路中發(fā)揮作用[16-17]。已有研究表明，Wnt3a能夠促進小鼠創(chuàng)傷性腦組織中神經細胞的損傷恢復[18]。但Wnt3a在發(fā)育過程中對于早期胚胎神經發(fā)生的作用還沒有完全明確。胚胎期第13～16天（E13～E16）時期為胚胎神經發(fā)生高峰期，本實驗利用子宮內電穿孔（IUE）實驗技術，直接下調E13～E16時期的Wnt3a表達，探究神經干細胞內Wnt3a特異性敲降對小鼠大腦神經發(fā)生的影響。

1材料和方法

1.1實驗動物及主要試劑

ICR孕鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養(yǎng)于SPF級標準動物飼養(yǎng)環(huán)境，12 h明暗交替，可自由飲水和進食，飼養(yǎng)至E13。動物實驗操作全部符合《中國科學院動物研究所實驗動物管理辦法（試行）》的相關規(guī)定，并根據(jù)《中國科學院動物研究所實驗倫理審查指南（試行）》獲得了中國科學院動物研究所倫理委員會的批準。Wnt3a-shRNA質粒和綠色熒光蛋白（GFP）質粒均由中國科學院動物研究所干細胞與生殖學國家重點實驗室構建。實時熒光定量 PCR（RT-qPCR）試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

1.2質粒轉染及RT-qPCR檢測

按照文獻報道的方法[19-20]，進行胎鼠神經干細胞原代培養(yǎng)及Wnt3a-shRNA質粒和對照GFP質粒轉染實驗，并提取總RNA進行逆轉錄（引物序列為F：GCGGCTGTAGTGAGGACATT；R：TTCACAGCTGCCAGATAGCC）。利用RT-qPCR實驗驗證Wnt3a-shRNA質粒的敲降效率（以β-actin為對照），RT-qPCR的具體實驗步驟按照北京天根公司SuperReal熒光定量預混試劑盒進行操作。

1.3實驗分組及IUE實驗

首先使用電穿孔儀拉制玻璃電極，將電極修剪到合適的長度和硬度。將E13的ICR孕鼠隨機分為對照組（Control組）和實驗組（Wnt3a下調組）。ICR孕鼠以10 μL/g體質量的劑量腹腔注射7 g/L的戊巴比妥鈉，麻醉后在超凈工作臺上用無菌手術剪剪開孕鼠皮膚和腹膜以暴露胎鼠。按照文獻方法[21-22]，將1.5 g/L的目的質粒（Wnt3a-shRNA）和GFP質粒以3∶1的摩爾比充分混合，并且加入適量固綠以示色。使用玻璃電極將質粒沿著胎鼠顱腦的人字縫垂直注射入實驗組胎鼠腦室。按照電壓為36 V、5個脈沖、每個脈沖間隔 50 ms的參數(shù)進行電轉。對照組胎鼠腦室注入等體積的GFP質粒和固綠混合物，其余操作均與實驗組相同。

1.4腦組織冰凍切片制作

在E16時處死孕鼠，取出胎鼠腦組織用40 g/L多聚甲醛溶液固定24 h，然后在4 ℃下用300 g/L蔗糖溶液脫水24 h。先將包埋模具內加入1/3的組織包埋液，冷卻后加入胎鼠腦組織并且調整方向，用包埋劑包埋整個腦組織，標記腦組織前后端。凍存后進行冰凍切片。調整切片的厚度為15 μm，在黏附載玻片上加入PBS，使切片貼附在載玻片上，在室溫下晾干后進行組織信息標記，置于-80 ℃保存或者直接進行后續(xù)免疫熒光染色。

1.5免疫熒光染色檢查

將組織樣本在室溫下用40 g/L的多聚甲醛固定30 min，用體積分數(shù)0.01的PBST清洗載玻片3次，每次10 min。使用2 mg/L的DAPI溶液對腦組織切片樣本的細胞核進行染色，用 PBS清洗2次，每次10 min。用濾紙擦去組織周圍的PBS溶液，加入適量體積分數(shù)0.50的甘油進行封片，小心蓋上蓋玻片后用指甲油（主要成分包括透明樹脂、添加劑和溶劑）涂抹其四周予以固定。切片樣本制作后置4 ℃冰箱保存。免疫熒光染色切片使用蔡司LSM 880共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。根據(jù)文獻方法區(qū)分大腦皮質的皮質板（CP）層和大腦中間帶（IZ）層[23-24]，分別統(tǒng)計兩組CP層和IZ層中GFP陽性細胞總個數(shù)，并計算各層中GFP陽性細胞的占比。采用ZEN 2012軟件進行圖像處理。

1.6統(tǒng)計學處理

使用Graph Pad Prism 7.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料數(shù)據(jù)采用±s形式表示，兩組間均數(shù)比較采用雙尾t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1神經干細胞Wnt3a基因敲降效率

RT-qPCR檢測Wnt3a-shRNA質粒轉染神經干細胞后相關基因的mRNA表達的結果顯示，與對照組相比，Wnt3a下調組Wnt3a的mRNA表達水平降低了54%，差異具有統(tǒng)計學意義（n=3，t=11.260，Plt;0.001）。見圖1A。

2.2Wnt3a敲降對胎鼠CP層發(fā)育的影響

免疫熒光檢測顯示，Wnt3a下調組胎鼠腦組織中CP層GFP陽性細胞占比為（63.85±1.88）%，對照組為（74.25±1.43）%，與對照組相比，Wnt3a下調組GFP陽性細胞占比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（n=6，t=4.400，Plt;0.01）。見圖1B、C。

2.3Wnt3a敲降對胎鼠IZ層發(fā)育的影響

免疫熒光檢測顯示，Wnt3a下調組胎鼠腦組織中IZ層GFP陽性細胞占比為（36.32±1.87）%，對照組為（25.75±1.43）%，與對照組相比，Wnt3a下調組GFP陽性細胞占比明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（n=6，t=4.482，Plt;0.01）。見圖1B、C。

3討論

哺乳動物的大腦皮質是能控制認知等復雜行為的一個高級中樞結構，它的發(fā)育進程是精密而有序的，并且大腦皮質的神經發(fā)生過程受到大量信號分子的嚴格調控[25-27]。這個過程中的任何一步出現(xiàn)差錯都可能導致大腦功能發(fā)生異常。胚胎時期的神經發(fā)生過程遵循嚴格的發(fā)育模式，這個正常的神經發(fā)生進程是確保大腦皮質正常發(fā)育的基礎[28]。而大腦皮質的詳細結構由一個自內向外的六層結構組成[6]，它包含許多從各種神經祖細胞分化產生的神經元和神經膠質細胞[7]。

大腦Wnt信號的傳導可以與其他細胞信號傳導途徑相互作用，因此Wnt信號傳導的破壞可能導致體內表型異常[18]。已有研究結果表明，在胚胎和出生后發(fā)育過程中的經典Wnt/β-catenin信號傳導對于介導大腦發(fā)育、中樞神經系統(tǒng)血管化、血-腦脊液屏障的形成和成熟等過程均發(fā)揮著至關重要的作用[16，29-30]。其中Wnt3a作為重要的Wnt配體，在神經系統(tǒng)發(fā)育中的作用不言而喻。已有研究結果證明，Wnt3a在神經系統(tǒng)發(fā)育中有重要作用，Wnt3a能夠促進小鼠創(chuàng)傷腦組織的神經元再生[31]，促進神經認知功能的恢復[18]。

E13～E16階段是胚胎神經發(fā)生的高峰期，E16之后逐漸轉為膠質發(fā)生[10]。故本實驗選擇在此時期內研究胚胎期的神經發(fā)生過程，在實驗中我們于E13時采用胚胎電轉的方法將神經干細胞內的Wnt3a特異性敲降，隨著神經干細胞的發(fā)育分化，在E16時收取胎鼠腦組織，觀察熒光特異性標記的神經元的發(fā)育過程。

本實驗結果表明，胚胎發(fā)育早期神經干細胞內的Wnt3a特異性敲降導致CP層和IZ層GFP熒光分布的改變，引起神經干細胞發(fā)育命運發(fā)生改變，進而影響了神經發(fā)生的原本進程。這種發(fā)育命運的改變可能會通過影響神經元的遷移和增殖來發(fā)揮作用，經過一系列復雜的信號間相互作用最終導致CP層和IZ層中神經元GFP陽性細胞占比失衡。故胚胎早期Wnt3a敲降會導致腦組織中神經元熒光分布異常，神經發(fā)生進程受到干擾，證明Wnt3a信號的破壞會導致早期神經發(fā)生過程中神經上皮的異常區(qū)域化。而大腦正常發(fā)育進程受到破壞可能會出現(xiàn)如自閉癥、腦部畸形等神經系統(tǒng)疾病。與其他研究相比，本研究直接在胚胎神經發(fā)生的高峰期E13～E16時敲降神經干細胞內的Wnt3a表達來探究其表型，為早期神經發(fā)生進程中Wnt3a信號通路的研究提供實驗依據(jù)。但本研究中對于胚胎早期Wnt3a敲降對神經增殖和分化的具體影響以及對成年后小鼠相應表型的影響沒有進行深入探討，此方面有待未來進一步探究。

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（本文編輯于國藝）