Anle138b對oAβ1-42誘導大鼠海馬神經(jīng)元線粒體功能損傷的影響

［摘要］目的探究Anle138b對慢性β淀粉樣蛋白（Aβ）誘導的海馬神經(jīng)元線粒體功能損傷的影響。方法取出生24 h以內的SD乳鼠，原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，待細胞成熟將其分為對照組（不進行任何處理）、oAβ1-42組（100 nmol/L oAβ1-42處理7 d）、oAβ1-42+Anle138b組（100 nmol/L oAβ1-42+100 nmol/L Anle138b共處理7 d）、Anle138b組（100 nmol/L Anle138b處理7 d）。各組處理結束后，應用流式細胞術檢測活性氧（ROS）和線粒體膜電位（Δψm）陽性細胞的變化。結果析因設計的方差分析顯示，oAβ1-42和Anle138b的主效應明顯（FoAβ1-42=14.149、38.209，F(xiàn)Anle138b=1.942、24.871，Plt;0.01），oAβ1-42和Anle138b之間有交互性作用（F交互=18.425、21.904，Plt;0.01）。單獨效應分析顯示，用oAβ1-42處理時，Anle138b的處理效應明顯（F=16.483、19.148，Plt;0.01）；不用Anle138b處理時，oAβ1-42的處理效應明顯（F=14.149、38.209，Plt;0.01）。結論Anle138b可以減輕oAβ1-42引起的海馬神經(jīng)元氧化應激和線粒體損傷，抑制oAβ1-42對海馬神經(jīng)元的損傷。

［關鍵詞］阿爾茨海默病；淀粉樣β肽類；Anle138b；海馬；神經(jīng)元；氧化應激；大鼠， Sprague-Dawley

［中圖分類號］R745.7;R341［文獻標志碼］A［文章編號］2096-5532（2024）03-0337-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.050［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網(wǎng)絡出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.r.20240426.1149.004;2024-05-0108：01：33

Effect of Anle138b on oAβ1-42-induced damage in mitochondrial function of rat hippocampal neuronsZHANG Li， LIU Xinyu， MA Zegang（Department of Physiology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［Abstract］ObjectiveTo explore the effect of Anle138b on mitochondrial dysfunction in hippocampal neurons chronicallyexposed to β-amyloid oligomers （oAβ1-42）. MethodsWe divided mature primary hippocampal neurons fromneonatal Sprague-Dawley rats within 24 h after birth into control group （without any treatment）， oAβ1-42 group （treated with 100 nmol/L oAβ1-42 for 7 d）， oAβ1-42+Anle138b group（co-treated with 100 nmol/L oAβ1-42 and 100 nmol/L Anle138b for 7 d）， and Anle138b group （treated with 100 nmol/L Anle138b for 7 d）. After treatment， changes in reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential （Δψm）-positive cells were measured by flow cytometry. ResultsAccording to the factorial analysis of variance， oAβ1-42 and Anle138b had significant main effects （FoAβ1-42=14.149，38.209;FAnle138b=1.942，24.871;Plt;0.01）， and there was an interaction between oAβ1-42 and Anle138b （Finteraction=18.425，21.904;Plt;0.01）. The individual effect analysis showed that in the presence of oAβ1-42， Anle138b produced significant effects （F=16.483，19.148;Plt;0.01）， and in the absence of Anle138b， oAβ1-42 produced significant effects （F=14.149，38.209;Plt;0.01）.ConclusionAnle138b can reduce oAβ1-42-induced oxidative stress and mitochondrial damage in hippocampal neurons， inhibiting the damage to hippocampal neurons caused by oAβ1-42.

［Key words］Alzheimer disease; amyloid beta-peptides; Anle138b; hippocampus; neurons; oxidative stress; rats， Sprague-Dawley

阿爾茨海默?。ˋD）是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為記憶、認知和語言障礙，視覺能力喪失及精神、性格和行為改變等癥狀[1]。研究表明，β淀粉樣蛋白（Aβ）的毒性作用是AD發(fā)病的關鍵因素，淀粉樣蛋白級聯(lián)假說認為Aβ多肽是淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）通過細胞外β和γ分泌酶切割產生的[2-4]。其中Aβ1-42是最豐富、毒性最強的形式，它在大腦中聚集成Aβ1-42寡聚體（oAβ1-42），通過一系列氧化應激損傷和神經(jīng)炎癥、tau 過度磷酸化和代謝途徑失調等機制，最終導致神經(jīng)元死亡、記憶障礙和認知能力下降[4-5]。Aβ離子通道假說是oAβ1-42發(fā)揮毒性作用的一種機制，oAβ1-42可能以形成離子通道的構型插入膜中[6]。Anle138b是一種新型低聚物調節(jié)劑，在治療劑量下沒有可檢測到的毒性，并且該藥具有出色的口服生物利用度和血-腦脊液屏障穿透性[7]。另外，Anle138b能在Aβ通道形成后改善其病理改變。在AD病人大腦中，oAβ1-42聚集加速，過量的 Ca2+被吸收到線粒體中，導致活性氧化物質（ROS）產生增加[8-10]。本課題組已用電生理技術檢測到Aβ的毒性作用，本實驗通過流式細胞術檢測海馬神經(jīng)元ROS和線粒體膜電位（Δψm）陽性細胞的變化，分析Anle138b對oAβ1-42誘導的海馬神經(jīng)元線粒體功能損傷的影響，為治療AD提供新的治療思路?，F(xiàn)將結果報告如下。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物及管理選擇出生24 h以內的SD乳鼠8只，性別不拘，由青島大任富城畜牧有限公司提供。所有乳鼠均飼養(yǎng)于室溫（22±2）℃、相對濕度50%～60%的SPF級動物室內。本實驗經(jīng)過青島大學實驗動物倫理審查委員會批準。

1.1.2主要試劑及其配制神經(jīng)元專用培養(yǎng)物b27購自美國Gibco公司，青霉素-鏈霉素溶液購自中國北京索萊寶科技有限公司，DME/F12基礎培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司，Aβ1-42購自中國MCE公司，4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、羅丹明（Rh123）購自美國Sigma公司，H2DCH-DA購自武漢賽維爾生物科技有限公司。①海馬神經(jīng)元細胞培養(yǎng)液：在超凈工作臺上，將10 mL神經(jīng)元專用培養(yǎng)物b27、5 mL青霉素-鏈霉素混合溶液與500 mL的 DME/F12基礎培養(yǎng)液混勻，分裝于50 mL離心管中，儲存于4 ℃冰箱。②oAβ1-42：按照文獻方法配制[11]。③HBS溶液：由20 mmol/L HEPES、150 mmol/L NaCl和雙蒸水組成，NaOH調節(jié)pH值=7.4，過濾，儲存于4 ℃冰箱。④H2DCH-DA溶液：1 μL H2DCH-DA加2 mL HBS，混勻，避光儲存，現(xiàn)用現(xiàn)配。⑤Rh123溶液：1 μL Rh123加2 mL HBS，混勻，避光儲存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組及處理參考本實驗室方法處理海馬神經(jīng)元，培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元細胞[11]。細胞發(fā)育成熟后分為4組：對照組（A組，不進行任何處理），oAβ1-42組（B組，用100 nmol/L oAβ1-42處理海馬神經(jīng)元細胞7 d），oAβ1-42+Anle138b組（C組，100 nmol/L oAβ1-42+100 nmol/L Anle138b共處理海馬神經(jīng)元7 d），Anle138b組（D組，100 nmol/L Anle138b處理海馬神經(jīng)元7 d）。各組使用35 mm細胞培養(yǎng)皿，在含有體積分數(shù)0.05 CO2、37 ℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組處理完成后進行流式細胞術檢測。

1.2.2流式細胞術檢測海馬神經(jīng)元內的ROS陽性細胞提前0.5 h水浴HBS，配制H2DCH-DA工作液。吸出培養(yǎng)液，用HBS清洗1次，每孔加入1 mL工作液，37 ℃避光孵育30 min。孵育結束用HBS沖洗2～3次，每孔加入1 mL HBS吹打細胞成單細胞懸液，用300目的過濾網(wǎng)過濾到流式管中，避光待檢測。將流式細胞儀設置激發(fā)波長為488 nm、發(fā)射波長為523 nm，調節(jié)FCS/SSC門，自動收集10 000個細胞后停止，用CELL Quest Pro分析系統(tǒng)對所收集細胞 H2DCH-DA 的熒光強度進行分析。以ROS陽性細胞百分比表示ROS水平。

1.2.3流式細胞術檢測海馬神經(jīng)元內的Δψm陽性細胞吸出海馬神經(jīng)元培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，用HBS清洗細胞1次。配制Rh123溶液，每孔加入1 mL 5 mg/L的Rh123溶液，37 ℃避光孵育0.5 h。孵育結束后吸出工作液，HBS清洗細胞2～3次，每孔加入1 mL HBS吹打細胞至單細胞懸液，300目的過濾網(wǎng)過濾到流式管中，避光待檢測。將流式細胞儀設置激發(fā)波長為488 nm、發(fā)射波長為523 nm，調節(jié)FCS/SSC門，系統(tǒng)自動收集10 000個細胞后停止，用CELL Quest Pro分析系統(tǒng)分析Rh123的熒光強度。計算Δψm陽性細胞百分比，并以其表示海馬神經(jīng)元內Δψm陽性細胞變化。

1.3統(tǒng)計學處理

應用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料數(shù)據(jù)以±s形式表示，各組均數(shù)比較采用2×2析因設計的方差分析。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

流式細胞術檢測各組海馬神經(jīng)元ROS和Δψm陽性細胞的結果見圖1、2和表1。析因設計的方差分析結果顯示，oAβ1-42和Anle138b的主效應明顯（FoAβ1-42=14.179、38.209，F(xiàn)Anle138b=1.942、24.871，Plt;0.01），oAβ1-42和Anle138b之間有交互性作用（F交互=18.425、21.904，Plt;0.01）。單獨效應分析顯示，用oAβ1-42處理時，是否用Anle138b處理的差異具有統(tǒng)計學意義（F=16.483、19.148，Plt;0.01）；不用oAβ1-42處理時，是否用Anle138b處理的差異無統(tǒng)計學意義；用Anle138b處理時，是否用oAβ1-42的差異無統(tǒng)計學意義；不用Anle138b處理時，是否用oAβ1-42處理的差異有統(tǒng)計學意義（F=14.179、38.209，Plt;0.01）。

3討論

目前全球AD病人數(shù)量眾多，該病已被認為是影響人類尤其是65歲以上人群健康的關鍵因素之一[8]。AD的致病過程有多種因素和機制參與，主要包括神經(jīng)元凋亡、氧化應激損傷等[12]。由聚集的oAβ1-42組成的淀粉樣斑塊和由微管相關蛋白tau組成的神經(jīng)原纖維纏結是AD的神經(jīng)病理學診斷標準[13]。另外，β和γ分泌酶對APP的異常加工導致Aβ40和Aβ42單體的產生，進一步寡聚并聚集成老年斑[14]。Aβ斑塊的異常沉積會造成神經(jīng)炎癥、線粒體功能不良，促進氧化應激以及tau蛋白過度磷酸化[15]。Aβ斑塊的形成、沉積與清除在AD的病理機制中發(fā)揮著重要作用。Anle138b是首個被報道的能夠在Aβ通道形成后將通道阻斷并改善Aβ病理變化的化合物，并且還可以減少病理性tau蛋白聚集體，是治療AD相關病理改變的新型且有希望的化合物[16]。AD導致線粒體能量產生途徑受損，引起細胞氧化磷酸化、活性氧生成增加。Aβ離子通道假說認為oAβ1-42可引起大量鈣離子內流，造成細胞內鈣離子水平紊亂[17-19]。

本實驗應用流式細胞術分別檢測海馬神經(jīng)元內ROS及Δψm陽性細胞的變化。本文的研究結果顯示，Anle138b本身對細胞沒有產生明顯的影響，oAβ1-42處理海馬神經(jīng)元7 d產生神經(jīng)毒性，造成細胞氧化損傷、ROS水平明顯增加，而使用Anle138b能夠降低oAβ1-42引起的ROS水平增加，對細胞產生保護作用。oAβ1-42可引起細胞線粒體膜通透性增加，線粒體呼吸鏈電子傳遞過程障礙，線粒體膜電位降低，Anle138b能阻止oAβ1-42對細胞的損傷，抑制其毒性作用。其保護機制可能為：Anle138b通過阻斷肽主鏈間的相互作用，從而阻止oAβ1-42對細胞的打孔作用，導致oAβ1-42無法以離子通道結構嵌入脂雙層膜，抑制其毒性產生[20]。另外，oAβ1-42誘導的膜損傷導致鈣離子過度進入神經(jīng)元，從而引起突觸囊泡大量釋放[21]。Aβ提高了突觸前谷氨酸的釋放[22]，Anle138b能夠阻止這一過程，從而在突觸前抑制其毒性作用。已有研究結果證明，Anle138b不僅能夠預防oAβ1-42誘導的海馬神經(jīng)元突觸毒性，而且能夠消除已經(jīng)產生的神經(jīng)元突觸毒性[23]。動物模型研究顯示，Anle138b可用于帕金森?。≒D）和AD等神經(jīng)退行性疾病的改善治療[7，24]。

綜上所述，Anle138b能夠抑制oAβ1-42引起的海馬神經(jīng)元ROS水平增高、線粒體膜電位下降，抑制海馬神經(jīng)元凋亡。Anle138b發(fā)揮作用的機制可能是它阻斷oAβ1-42形成離子通道結構，致使oAβ1-42無法嵌入脂質雙層膜，從而抑制oAβ1-42的毒性作用，保護海馬神經(jīng)元。因此，Anle138b作為AD等神經(jīng)

340青島大學學報（醫(yī)學版）60卷

退行性疾病的保護藥物開發(fā)可能具有重要的現(xiàn)實意義，值得進一步研究。但Anle138b抑制oAβ1-42發(fā)揮毒性作用的深入機制尚不明確，本研究后續(xù)可以從電生理方面探討Aβ對海馬神經(jīng)元的超興奮影響，進而研究Aβ毒性作用產生的具體機制。

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