蘇格木勒—3湯水提物對小鼠鎮(zhèn)靜、催眠及失眠模型大鼠催眠的作用機制研究

韓金美 王樹梅 薩礎(chǔ)拉

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）23-3232-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.14

摘 要 目的：研究蘇格木勒-3湯水提物對小鼠鎮(zhèn)靜、催眠及對失眠模型大鼠催眠的作用機制。方法：將小鼠隨機分為空白組（生理鹽水，2 mL/100 g）、陽性對照組（阿普唑侖，0.15 mg/kg）和蘇格木勒-3湯水提物高、低劑量組（90.0、45.0 mg/kg，以生藥量計，下同），每組12只，各組小鼠每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥5 d，觀察小鼠自主活動（活動時間和站立次數(shù)）變化及在戊巴比妥鈉催眠劑量下（50 mg/kg）對小鼠入睡潛伏期和睡眠持續(xù)時間的影響。采用腹腔注射氯苯丙氨酸建立大鼠失眠模型，將成模大鼠隨機分為模型組（生理鹽水，2 mL/100 g）、陽性對照組（阿普唑侖，0.09 mg/kg）和蘇格木勒-3湯水提物高、低劑量組（108.0、54.0 mg/kg），每組10只，并另取10只正常大鼠作為空白組（生理鹽水，2 mL/100 g），各組大鼠每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d后處死；采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組大鼠腦組織內(nèi)5-羥色胺（5-HT）、γ-氨基丁酸（GABA）、白細胞介素1β（IL-1β）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的含量。結(jié)果：在鎮(zhèn)靜、催眠實驗中，與空白組比較，其余各組小鼠活動時間和站立次數(shù)均顯著減少（P<0.05或P<0.01）；蘇格木勒-3湯水提物高劑量組和陽性對照組小鼠入睡潛伏期均顯著縮短（P<0.05或P<0.01），蘇格木勒-3湯水提物高劑量組小鼠睡眠持續(xù)時間顯著延長（P<0.05）。在催眠作用機制實驗中，與空白組比較，模型組大鼠腦組織內(nèi)5-HT及GABA、SOD含量顯著降低（P<0.05），IL-1β、MDA含量顯著增加（P<0.05）。與模型組比較，陽性對照組和蘇格木勒-3湯水提物高、低劑量組大鼠腦組織內(nèi)5-HT含量顯著增加（P<0.05或P<0.01）；蘇格木勒-3湯水提物高劑量組、陽性對照組大鼠腦組織內(nèi)GABA、SOD含量顯著增加（P<0.05或P<0.01），蘇格木勒-3湯水提物高、低劑量組IL-1β含量顯著降低（P<0.05），其余指標差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：蘇格木勒-3湯水提物具有較好的鎮(zhèn)靜、催眠作用，其催眠作用機制可能與中樞神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、GABA及細胞因子IL-1β水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞 蘇格木勒-3湯；水提物；失眠；鎮(zhèn)靜；催眠；大鼠；小鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the hypnotic and sedative effects of water extract of Sugmel-3 decoction on mice and its effects on insomnia of insomnia model rats. METHODS： The mice were randomly divided into blank group （normal saline， 2 mL/100 g）， positive control group （alprazolam， 0.15 mg/kg）， water extract of Sugmel-3 decoction high-dose and low-dose groups （90.0， 45.0 mg/kg， calculated by crude drug， similarly hereinafter）， with 12 mice in each group. Each group was given relevant medicine intragastrically once a day， for consecutive 5 days. The change of spontaneous activity （activity time and the number of standing）， the effects of hypnotic dose of pentobarbital sodium （50 mg/kg） on latency and duration of sleep were observed in mice. Insomnia rat model was induced by intraperitoneal injection of para-chlorophenylalanine. Model rats were randomly divided into model group （normal saline， 2 mL/100 g）， positive control group （alprazolam， 0.09 mg/kg）， water extract of Sugmel-3 decoction high-dose and low-dose groups （108.0， 54.0 mg/kg）， with 10 rats in each group. Other 10 normal rats were included in blank group （normal saline， 2 mL/100 g）. Other groups were given relevant medicine intragastrically once a day， and then sacrificed after consecutive administration of 7 d. ELISA assay was used to detect the contents of 5-HT， GABA， IL-1β， SOD and MDA in cerebral tissue of rats. RESULTS： In the experiment of sedation and hypnosis， compared with blank group， the activity time and the number of standings of mice in other groups were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）， sleep latency of mice was shortened significantly in water extract of Sugmel-3 decoction high-dosage group and positive control group （P<0.05 or P<0.01）. The sleep duration of mice was prolonged significantly in water extract high-dose group of Sugmel-3 decoction （P<0.05）. In the experiment of hypnotic mechanism， compared with blank group， the contents of 5-HT， GABA and SOD in cerebral tissue of rats were decreased significantly in model group （P<0.05）， the contents of IL-1β and MDA were increased significantly （P<0.05）. Compared with model group， the content of 5-HT of rats was increased significantly in positive control group， water extract of Sugmel-3 decoction high-dose and low-dose group （P<0.05 or P<0.01）. The contents of GABA and SOD in cerebral tissue of rats were increased significantly in water extract of Sugmel-3 decoction high-dose group and positive control group （P<0.05 or P<0.01）. The content of IL-1β of rats in water extract of Sugmel-3 decoction high-dose and low-dose group were decreased significantly （P<0.05）， the others indexes differences were not statistically significant （P>0.05）. CONCLUSIONS： The water extract of Sugmel-3 decoction has good sedative and hypnotic effects， and its hypnotic mechanism may be related to the regulation of level of 5-HT and GABA in central neurotransmitters and the cytokine IL-1β.

KEYWORDS Sugmel-3 decoction； Water extract； Insomnia； Sedatiion； Hypnosis； Rats； Mice

失眠在蒙醫(yī)學(xué)上指失去正常睡眠習(xí)慣、無困意、長期處于清醒狀態(tài)的癥狀。蒙醫(yī)理論認為，引起失眠的原因有勞逸失調(diào)、受到驚嚇、思慮過多或者體內(nèi)“赫依”（蒙醫(yī)理論里具有調(diào)節(jié)人體機制平衡的物質(zhì)）增多紊亂，最后導(dǎo)致機體失調(diào)，引起心、腦、腎、血管、神經(jīng)等相關(guān)疾病[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，在睡眠-覺醒節(jié)律過程中，相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺（5-HT）、γ-氨基丁酸（GABA）、細胞因子白細胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等起到重要作用[2]；朱國慶[3]發(fā)現(xiàn)選擇性阻斷腦組織內(nèi)5-HT的合成，可致大鼠失眠；Sherin JE等[4]發(fā)現(xiàn)增加腦組織內(nèi)GABA含量，可提高慢波睡眠質(zhì)量；宋媛等[5]發(fā)現(xiàn)增加腦組織內(nèi)IL-1β的含量，能治療失眠。超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）也被發(fā)現(xiàn)在睡眠-覺醒節(jié)律過程中起到一定的作用[6]，當大鼠腦組織內(nèi)SOD活性降低、MDA含量增加時，大鼠出現(xiàn)失眠癥狀[7]。

蒙藥蘇格木勒-3湯為蒙醫(yī)臨床常用主治失眠的方劑，始載于《四部醫(yī)典》[8]，由白豆蔻（君藥）、香旱芹、蓽茇組成，具有治療失眠、消化不良等功效[9-11]。本研究通過灌胃蘇格木勒-3湯水提物觀察其對小鼠自主活動（活動時間和站立次數(shù)）變化的影響，對戊巴比妥鈉催眠劑量下（50 mg/kg）小鼠入睡潛伏期和睡眠持續(xù)時間的影響；對對氯苯丙氨酸（PCPA）致失眠模型大鼠腦組織內(nèi)5-HT、GABA、IL-1β、SOD、MDA含量的影響，初步探討蘇格木勒-3湯水提物的鎮(zhèn)靜、催眠作用及改善大鼠失眠的作用機制，為蘇格木勒-3湯水提物的進一步探究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BS323S電子天平（北京賽多利斯科技儀器有限公司）；FW135中草藥粉粹機（天津華新儀器廠）；ZZ-6小鼠自主活動測試儀（成都泰盟科技有限公司）；MK3全自動多功能酶標儀（德國賽默飛世爾科技有限公司）；DH4000A電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司）；離心機（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

白豆蔻、香旱芹與蓽茇購自內(nèi)蒙古天立藥材公司，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院圖門巴雅爾教授鑒定為真品；注射用戊巴比妥鈉粉末（德國西蒙-奧德里奇生物與化學(xué)制品有限公司，批號：101B54076，純度：≥97.0%）；阿普唑侖片（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號：H32020215，規(guī)格：0.4 mg/片）；0.9%生理鹽水（山東科倫藥業(yè)有限公司，批號：H37022918）；PCPA（美國Sigma公司）；水合氯醛（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20171211）；IL-1β試劑盒（聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，批號：2301b71122）；5-HT試劑盒（批號：20180425）、GABA試劑盒（批號：20180425）均購自上海藍基生物科技有限公司；SOD測試盒（批號：A001-1）、MDA測試盒（批號：A003-1）均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 動物

ICR小鼠48只，♂，體質(zhì)量18～22 g，由北京海淀區(qū)興隆實驗動物生長繁殖中心提供，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（京） 2012-0004 。SPF級SD大鼠50只，♀♂各半，體質(zhì)量180～220 g，分籠飼養(yǎng)，購自北京市海淀區(qū)興隆實驗動物生長繁殖中心，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（京）2014-0004。各動物在常溫安靜動物室環(huán)境下正常飼養(yǎng)。

2 方法

2.1 蘇格木勒-3湯水提物的制備

取一定量的白豆蔻、香旱芹、蓽茇分別加入粉粹機中粉碎，過50目篩。分別稱取粉碎過篩后的白豆蔻25 g、香旱芹17 g、蓽茇8 g共50 g，然后加1 000 mL蒸餾水，煎煮30 min后，濾過；濾液倒入蒸發(fā)皿中，置于水浴鍋蒸干，得到蘇格木勒-3湯水提物浸膏，得率為18%（計算公式：濾液蒸干后質(zhì)量/藥材總質(zhì)量×100%）。

2.2 失眠大鼠模型的制備

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，除空白組外，其余各組大鼠每天上午8：00-9：00腹腔注射PCPA混懸液（300 mg/kg）（生理鹽水溶解，pH為7～8），每天1次，連續(xù)注射2 d，觀察大鼠行為。2 d后，與空白組比較，其他組大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律紊亂、白天活動不停、毛發(fā)雜亂、興奮性增強、攻擊性增強、大便灰白等顯著的行為學(xué)改變，表明大鼠失眠模型制備成功[12]。

2.3 分組與給藥

小鼠隨機分為空白組（生理鹽水，2 mL/100 g）、陽性對照組（阿普唑侖，0.15 mg/kg，根據(jù)成人臨床常用劑量換算而得）和蘇格木勒-3湯水提物高、低劑量組（90.0、45.0 mg/kg，以生藥量計），每組12只，各組小鼠每天上午8：00-9：00灌胃給藥1次，連續(xù)給藥5 d。大鼠隨機分為空白組（生理鹽水，2 mL/100 g）、模型組（生理鹽水，2 mL/100 g）、陽性對照組（阿普唑侖，0.09 mg/kg，根據(jù)成人臨床常用劑量換算而得）和蘇格木勒-3湯水提物高、低劑量組（108.0、54.0 mg/kg，以生藥量計），每組10只，各組大鼠每天上午8：00-9：00灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d。蘇格木勒-3湯水提物給藥劑量參考薩礎(chǔ)拉等[13]研究中的劑量并加以調(diào)整得到。

2.4 蘇格木勒-3湯水提物對小鼠自主活動的影響

參考文獻[14]方法，在小鼠第5天給藥前，先將各組小鼠投入自主活動測試儀中適應(yīng)2 min，再灌胃給藥，60 min后開始記錄各組小鼠5 min內(nèi)的活動時間和站立次數(shù)（前肢向上抬舉次數(shù)）。

2.5 蘇格木勒-3湯水提物對戊巴比妥鈉催眠劑量下小鼠睡眠時間的影響

參考文獻[15]方法，小鼠連續(xù)灌胃5 d，末次給藥1 h后，小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg），觀察記錄小鼠入睡潛伏期（翻正反射消失時間）和睡眠持續(xù)時間（翻正反射消失至恢復(fù)的時間）。

2.6 蘇格木勒-3湯水提物對失眠模型大鼠腦組織內(nèi)5-HT、GABA、IL-1β、SOD、MDA含量的影響

各組大鼠灌胃給藥7 d后，將其斷頭處死，迅速取出大鼠腦組織，經(jīng)生理鹽水沖洗后稱質(zhì)量，每只取100 mg組織加入1 mL生理鹽水中，用電動勻漿器勻漿。4 ℃下3 500 r/min離心10 min（離心半徑10 cm）后取上清液，于-20 ℃或-80 ℃低溫保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法嚴格按照相應(yīng)試劑盒說明書進行操作，測定各組大鼠腦組織內(nèi)5-HT、GABA、IL-1β、SOD、MDA的含量。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量數(shù)據(jù)用x±s表示，各組間差異比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 蘇格木勒-3湯水提物對小鼠自主活動的影響結(jié)果

與空白組比較，陽性對照組和蘇格木勒-3湯水提物高、低劑量組小鼠的活動時間、站立次數(shù)顯著減少（P<0.05或P<0.01），結(jié)果詳見表1。

3.2 蘇格木勒-3湯水提物對戊巴比妥鈉催眠劑量下小鼠睡眠的影響結(jié)果

與空白組比較，蘇格木勒-3湯水提物高劑量組和陽性對照組小鼠的入睡潛伏期顯著縮短（P<0.05或P<0.01），蘇格木勒-3湯水提物高劑量組小鼠的睡眠持續(xù)時間顯著延長（P<0.05），結(jié)果詳見表2。

3.3 蘇格木勒-3湯水提物對失眠模型大鼠腦組織內(nèi)5-HT、GABA、IL-1β、SOD、MDA含量的影響結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠腦組織內(nèi)5-HT、GABA及SOD含量顯著降低（P<0.05或P<0.01），IL-1β、MDA含量顯著增加（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，陽性對照組和蘇格木勒-3湯水提物高、低劑量組大鼠腦組織內(nèi)5-HT的含量顯著增加（P<0.05或P<0.01）；蘇格木勒-3湯水提物高劑量組、陽性對照組大鼠腦組織內(nèi)GABA和SOD的含量顯著增加（P<0.05或P<0.01）；蘇格木勒-3湯水提物高、低劑量組大鼠腦組織內(nèi)IL-1β含量顯著降低（P<0.05）；其余指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），結(jié)果詳見表4。

4 討論

小鼠鎮(zhèn)靜實驗可通過觀察小鼠的自主活動情況來反映其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能狀態(tài)，興奮時其活動次數(shù)增加，抑制時活動次數(shù)減少[16]。催眠實驗以動物的入睡潛伏期、睡眠持續(xù)時間及入睡率為指標評價試驗藥物與戊巴比妥鈉的協(xié)同催眠作用[17]。本課題組考察了蘇格木勒-3水提物對小鼠自主活動和在戊巴比妥鈉催眠劑量下對小鼠睡眠的影響，結(jié)果表明，蘇格木勒-3湯水提物能顯著減少小鼠自主活動次數(shù)，縮短催眠劑量戊巴比妥鈉引起的小鼠入睡潛伏期，延長睡眠持續(xù)時間，達到鎮(zhèn)靜、催眠作用。

相關(guān)研究表明，睡眠障礙患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮和抑制的平衡被破壞可能與神經(jīng)遞質(zhì)含量的改變有關(guān)[18]。本實驗采用腹腔注射PCPA構(gòu)建動物失眠模型，在預(yù)實驗中用小鼠構(gòu)建失眠模型，其死亡率為12.5%，而用大鼠構(gòu)建失眠模型死亡率為0，故本研究參考陳金鋒等[19]的方法選擇小鼠評價蘇格木勒-3湯的鎮(zhèn)靜、催眠作用，選擇用大鼠構(gòu)建失眠模型研究蘇格木勒-3湯水提物的作用機制。結(jié)果表明，灌胃蘇格木勒-3湯水提物后大鼠腦組織內(nèi)5-HT、GABA含量顯著增加，IL-1β顯著減少，推測其催眠作用機制可能與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、GABA及IL-1β水平有關(guān)。本實驗結(jié)果也為蘇格木勒-3湯水提物在治療失眠上的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

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（收稿日期：2018-07-07 修回日期：2018-09-13）

（編輯：唐曉蓮）