GHS-R1a敲除對小鼠下丘腦小膠質(zhì)細胞表達的影響

鄧明銣 鐘萍 許靖 劉俊汝 熊星星 袁海成

［摘要］ 目的

探討生長激素促分泌受體1a（GHS-R1a）敲除對小鼠下丘腦小膠質(zhì)細胞表達的影響。

方法

選取12只6月齡GHS-R1a-/-雄性小鼠設(shè)為GHS-R1a-/-組，12只同月齡野生型（WT）雄性小鼠設(shè)為WT組。采用高架十字迷宮（EPM）實驗測試兩組小鼠的焦慮水平，采用組織免疫熒光技術(shù)檢測兩組小鼠下丘腦小膠質(zhì)細胞數(shù)量，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測兩組小鼠下丘腦離子鈣結(jié)合接頭分子1（Iba1）、小膠質(zhì)細胞活化蛋白CD68和髓系細胞觸發(fā)受體2（Trem2）基因的表達水平。

結(jié)果 兩組小鼠EPM實驗結(jié)果無顯著差異（P>0.05）；組織免疫熒光技術(shù)檢測結(jié)果顯示，GHS-R1a-/-組小鼠下丘腦中小膠質(zhì)細胞數(shù)量顯著多于WT組小鼠（t=4.61，P<0.05）；qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，GHS-R1a-/-組小鼠下丘腦Iba1和Trem2 mRNA表達水平顯著高于WT組小鼠（t=3.63、3.01，P<0.05），CD68 mRNA水平表達顯著低于WT組小鼠（t=3.79，P<0.05）。

結(jié)論

GHS-R1a基因敲除不影響小鼠的焦慮水平，但會導致小鼠下丘腦中小膠質(zhì)細胞數(shù)量增加；GHS-R1a可能在抑制小膠質(zhì)細胞增殖及吞噬功能、促進小膠質(zhì)細胞活化的過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

［關(guān)鍵詞］ 受體，胃促生長素；小神經(jīng)膠質(zhì)細胞；鈣結(jié)合蛋白質(zhì)類；基因表達調(diào)控；下丘腦

［中圖分類號］ R392.11；R338.27；R394??? ［文獻標志碼］ A

小膠質(zhì)細胞作為大腦抵御病原體入侵的重要防線，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）免疫中發(fā)揮著重要作用，其分布于整個大腦和脊髓中，約占大腦細胞總數(shù)的5%～20%[1]。生理情況下，小膠質(zhì)細胞通常呈現(xiàn)小胞體、高度分支的狀態(tài)，發(fā)揮監(jiān)測大腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)作用[2]。除監(jiān)視功能之外，小膠質(zhì)細胞還能吞噬有害物質(zhì)以維持CNS正常功能及調(diào)節(jié)大腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)平衡[3]。生長激素促分泌受體1a（GHS-R1a）是一種由366個氨基酸殘基及7次跨膜結(jié)構(gòu)域組成的G蛋白偶聯(lián)受體，廣泛分布于外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)[4]，尤其在下丘腦和垂體廣泛表達[5]。GHS-R1a受體通常定位于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的細胞膜上[6]，發(fā)揮相應的生物活性作用。GHS-R1a受體除了影響機體生長發(fā)育、能量代謝，還參與調(diào)節(jié)人體學習記憶、食欲、氧化應激反應等生理過程，對多種疾病也具有重要影響[7]。研究顯示，下丘腦腹內(nèi)側(cè)核不僅參與外周代謝調(diào)控，其自身還能作為杏仁核的下游“效應器”調(diào)控焦慮相關(guān)行為[8]，但目前有關(guān)GHS-R1a是否參與調(diào)節(jié)下丘腦小膠質(zhì)細胞增殖過程未見報道，同時GHS-R1a參與調(diào)節(jié)焦慮發(fā)生的具體機制亦尚不明確。本研究利用GHS-R1a敲除（GHS-R1a-/-）小鼠檢測GHS-R1a對于小鼠焦慮水平和下丘腦小膠質(zhì)細胞及其相關(guān)因子表達水平的影響。

1 材料和方法

1.1 材料來源

GHS-R1a+/-小鼠購買于上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司，下丘腦離子鈣結(jié)合接頭分子1（Iba1）一抗購自日本和光純藥工業(yè)株式會社，兔AF488二抗購買于美國Cell Signaling Technology公司，山羊血清、無酶水、RNA提取試劑盒、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購買于美國英杰生命技術(shù)有限公司，去RNA酶試劑購自美國賽默飛世爾科技公司，SYBR Green熒光定量試劑盒購自日本寶生物工程有限公司，氯化鈉、氨基甲酸乙酯、蔗糖購自美國西格瑪奧德里奇公司，包埋劑購自北京普利萊公司，多聚甲醛購自天津瑞金公司。

1.2 小鼠的來源及分組

GHS-R1a+/-小鼠遺傳背景為C57BL6J，非同窩GHS-R1a+/-雌雄小鼠間交配繁殖，待小鼠出生1個月以后基因鑒定，保留GHS-R1a-/-小鼠及野生型（WT）小鼠，分別設(shè)為GHS-R1a-/-組和WT組，每組各12只。兩組小鼠在溫度（21±2）℃、濕度（50±10）%、12/12 h晝夜交替光照、可自由飲水與取食的環(huán)境下飼養(yǎng)至6月齡。所有小鼠在行為學實驗前至少適應實驗室環(huán)境1周，行為學實驗環(huán)境需保證光線適度、整潔無異味、安靜無噪音干擾，適應期間每天將小鼠放置于實驗環(huán)境中1 h左右。

1.3 高架十字迷宮（EPM）實驗檢測小鼠焦慮水平

EPM由1個中心區(qū)、2個封閉臂、2個開放臂五部分組成，將兩組小鼠頭朝向開放臂放入中心區(qū)，攝像記錄5 min小鼠自由活動過程。利用MATLAB 2018軟件分析并記錄小鼠在開放臂、封閉臂自由探索的時間及跑動平均速度等參數(shù)，以此為據(jù)判斷小鼠焦慮水平。實驗重復3次，結(jié)果取均值。

1.4 免疫熒光染色測定小鼠下丘腦小膠質(zhì)細胞分布密度

使用10%氨基甲酸乙酯麻醉各組小鼠后，固定于泡沫板上，切開小鼠胸腔，充分暴露心臟，將準備好的注射器插入左心室，剪開右心房，推入50 mL生理鹽水，待從右心房流出的液體變澄清后拔出針頭。將小鼠開顱，完整取出腦組織，沿矢狀面切取一半腦組織置于裝有4%多聚甲醛溶液的EP管中固定，次日將溶液換為質(zhì)量濃度300 g/L的蔗糖溶液。待腦組織沉到EP管底后取出，用冰凍切片機將腦組織沿冠狀面40 μm厚切片，置于含有PBS緩沖液的24孔板中。將切片用PBS緩沖液清洗3次（每次10 min）后，使用封閉液常溫封閉1 h，再將Iba1一抗（1∶1 000）加入小鼠腦組織切片中，4 ℃下?lián)u床孵育過夜后再用PBS緩沖液清洗3次（每次10 min）后，加入兔AF488二抗（1∶500）室溫孵育1 h，PBS緩沖液清洗2次（每次10 min）后貼片，將含DAPI的封片液滴于載玻片，緩慢蓋上蓋玻片，于顯微鏡下拍照并保存。使用Image J軟件分析照片圖像從而得出小膠質(zhì)細胞密度。實驗重復3次，結(jié)果取均值。

1.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測小鼠下丘腦離子鈣結(jié)合接頭分子（Iba1）、CD68和髓系細胞觸發(fā)受體2（Trem2）mRNA表達水平

將1.4中剩余部分下丘腦組織置于1.5 mL的無酶離心管中，加入裂解液研磨至混懸液后，4 ℃下12 000 r/min離心5 min；取上清液加入新無酶EP管中，并加入體積分數(shù)0.7的乙醇溶液700 μL，渦旋振蕩后將液體加入分離柱，待洗脫蛋白質(zhì)及無機鹽后加入30 μL無酶水，將液體離心轉(zhuǎn)移至新無酶EP管中。用Nanodrop分光光度計測定RNA濃度后按RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按SYBR Green熒光定量試劑盒說明書配制反應體系后擴增，以GAPDH作為內(nèi)參照，計算Iba1、CD68及Trem2的相對表達水平。引物名稱及其序列見表1。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用Graph Pad Prism 6統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理。符合正態(tài)分布的計量資料以[AKx-D]±s表示，兩組間比較采用雙尾t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)? 果

2.1 兩組小鼠焦慮水平比較

EPM實驗結(jié)果顯示，GHS-R1a-/-組及WT組小鼠開放臂探索時間占總時間之比分別為（9.53±3.47）%、（8.73±5.65）%，平均速度分別為（4.56±0.77）、（4.69±0.87）cm/s，兩組小鼠上述指標比較無顯著差異（P>0.05）。

2.2 兩組小鼠下丘腦小膠質(zhì)細胞密度比較

組織免疫熒光染色結(jié)果顯示，GHS-R1a-/-組與WT組下丘腦小膠質(zhì)細胞密度分別為（10.71±3.25）%和（4.38±0.87）%，GHS-R1a-/-組小鼠下丘腦中小膠質(zhì)細胞密度顯著高于WT組小鼠（t=4.61，P<0.05）。見圖1。

2.3 兩組小鼠下丘腦Iba1、CD68及Trem2 mRNA表達水平比較

qRT-PCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示，GHS-R1a-/-組小鼠Iba1、CD68及Trem2 mRNA相對表達量分別為1.18±0.06、0.65±0.18、1.24±0.20，WT組小鼠上述指標分別為1.01±0.04、1.43±0.47、0.92±0.16。GHS-R1a-/-組小鼠下丘腦Iba1和Trem2 mRNA表達水平顯著高于WT組（t=3.63、3.01，P<0.05），CD68 mRNA表達水平顯著低于WT組（t=3.79，P<0.05）。

3 討? 論

GHS-R1a作為G蛋白偶聯(lián)受體家族的重要成員，是胃饑餓素ghrelin的功能性受體，具有抗炎、抗細胞凋亡、參與學習記憶等生物學功能[6，9]。研究顯示，ghrelin在下丘腦-垂體-腎上腺軸應激反應中發(fā)揮著重要作用，在下丘腦注射ghrelin可引起小鼠短期內(nèi)的焦慮行為[10]，但目前GHS-R1a調(diào)節(jié)情緒的具體機制尚不明確。此外，作為腦組織中GHS-R1a含量最高的部位，下丘腦除了在控制機體進食、新陳代謝和能量平衡方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，還參與了伴隨情感活動而出現(xiàn)的機體自主性活動、軀體活動及內(nèi)分泌活動，與情緒反應有著密切關(guān)系[11]。研究顯示，在慢性壓力刺激下，下丘腦腹內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元的簇狀放電也同時參與了焦慮與能量代謝的調(diào)控過程[12]。但本研究結(jié)果表明，GHS-R1a敲除對小鼠自發(fā)活動及焦慮情緒無明顯影響。推測原因可能是由于焦慮的產(chǎn)生通常在短期實驗中較易觀察，而本研究實驗周期較長，小鼠對環(huán)境已經(jīng)適應，因此小鼠的焦慮狀況不明顯。

小膠質(zhì)細胞作為CNS中最重要的組織特異性巨噬細胞，可動態(tài)檢測腦組織環(huán)境變化中的病原體及危險信號，保護正常細胞的生理功能[13]。此外，小膠質(zhì)細胞還能與神經(jīng)元交互作用，在神經(jīng)元早期發(fā)育過程中修剪多余突觸，去除神經(jīng)元之間的多余連接[14]。當CNS受到急性損傷時，發(fā)揮防御保護功能的小膠質(zhì)細胞在數(shù)分鐘內(nèi)被激活，然后增殖、遷移到病變部位[15]，從分支較多的形態(tài)變?yōu)閳A形或阿米巴樣形態(tài)[16]，同時釋放相關(guān)炎癥因子，使得自身進一步被激活，吞噬能力增強。但是在阿爾茨海默?。ˋD）和帕金森病等神經(jīng)退行性疾病過程中，慢性持續(xù)性炎癥會使小膠質(zhì)細胞被過度激活，造成機體正常組織受損[17-18]。研究顯示，小膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元樹突棘的吞噬有助于消除由急性應激引起的焦慮樣行為，但是目前對神經(jīng)元-小膠質(zhì)細胞相互作用的動態(tài)機制及其在急性應激所致焦慮的恢復中的作用機制仍未明確[8]。本研究中組織免疫熒光染色及qRT-PCR技術(shù)檢測結(jié)果均顯示，下丘腦中小膠質(zhì)細胞的數(shù)量因GHSR-1a敲降而明顯上調(diào)，這可能與GHSR-1a缺失造成的小膠質(zhì)細胞重編程有關(guān)，具體機制仍待進一步探索。

Trem2屬于免疫球蛋白超家族成員，為一種單次跨膜受體，在CNS中特異性表達于小膠質(zhì)細胞膜表面[19]，其配體包括陰離子、兩性離子、磷脂、糖脂、凋亡細胞、脂質(zhì)化顆粒和脂蛋白等[20-21]。研究顯示，Trem2缺乏與AD早期β-淀粉樣蛋白負荷的降低有關(guān)，Trem2在AD代謝穩(wěn)態(tài)當中發(fā)揮著重要的作用[22]。另有研究顯示，Trem2的缺失可降低小膠質(zhì)細胞對凋亡細胞、細胞碎片和細菌的吞噬作用[23]。

Iba1是一種相對分子量為17 000的鈣結(jié)合蛋白，在CNS中特異表達，通常在活化的小膠質(zhì)細胞中表達增加，是小膠質(zhì)細胞的標志物。

CD68是一種相對分子質(zhì)量為110 000跨膜糖蛋白，主要在小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞溶酶體中表達，不僅能作為小膠質(zhì)細胞被激活的標志，還在腫瘤的免疫調(diào)節(jié)及預后中起重要作用[24]。本研究結(jié)果顯示，GHS-R1a敲除可使Iba1、Trem2基因表達水平上調(diào)，CD68基因表達水平下調(diào)，表明GHS-R1a受體可能抑制小鼠下丘腦小膠質(zhì)細胞的吞噬功能，并促進小膠質(zhì)細胞的活化。盡管GHS-R1a在CNS中廣泛分布，但是目前在小膠質(zhì)細胞中未檢測到其表達[25]。因此我們猜測GHS-R1a敲除可能通過影響神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細胞與小膠質(zhì)細胞之間的相互作用，造成小膠質(zhì)細胞數(shù)量的上調(diào)，但具體機制仍需進一步探討。

綜上所述，GHS-R1a敲除對小鼠的自發(fā)焦慮水平無明顯影響，但能引起下丘腦小膠質(zhì)細胞數(shù)量及Iba1、CD68及Trem2表達水平的變化，GHS-R1a可能在抑制小膠質(zhì)細胞增殖及吞噬功能、促進小膠質(zhì)細胞活化的過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

倫理批準和動物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學實驗動物福利倫理委員會的審核批準（文件號20220701Ghs-R1aKO2620231120101）。所有實驗過程均遵照《倫理委員會標準》條例進行。

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