富血小板血漿-80 ℃深低溫短期保存后細(xì)胞因子的變化

藺錫桐 劉加秀 張樹(shù)超

［摘要］ 目的

分析富血小板血漿（PRP）-80 ℃深低溫短期保存以后，其內(nèi)P-選擇素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF）濃度及其pH值等重要指標(biāo)的變化，為PRP低溫儲(chǔ)存提供理論依據(jù)。

方法

取30例健康供者血液制備的PRP，每份樣本分裝成5份，每份留取0.5 mL，分別為A組（新鮮組）和B～E組（分別凍存5、10、15、20 d）。測(cè)定各組PRP的pH值；ELISA法測(cè)定各組PRP中P-選擇素、PDGF和VEGF的水平；血管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A組和E組對(duì)HUVEC細(xì)胞血管形成能力的影響。

結(jié)果 各組pH值比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05）；各組PRP中P-選擇素、PDGF、VEGF的濃度比較，差異均無(wú)顯著性（P＞0.05）；A組和E組中HUVEC血管形成數(shù)量比較差異無(wú)顯著意義（P＞0.05）。

結(jié)論 -80 ℃深低溫保存PRP對(duì)其pH值、P-選擇素、VEGF和PDGF濃度變化無(wú)顯著影響，可延長(zhǎng)PRP臨床應(yīng)用時(shí)間。

［關(guān)鍵詞］ 富血小板血漿；低溫保存；P選擇素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子類(lèi)；血小板源性生長(zhǎng)因子；氫離子濃度

［中圖分類(lèi)號(hào)］ R457.14;R318.52??? ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

富血小板血漿（PRP）是自體全血經(jīng)由離心濃縮制得的血液制品，其主要成分為濃縮后的血小板[1]。血小板內(nèi)含有多種細(xì)胞器，包括α-顆粒、致密顆粒和溶酶體等，其中α-顆粒中包含大量生長(zhǎng)因子。PRP受刺激后會(huì)脫顆粒釋放大量的生長(zhǎng)因子，如P-選擇素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF）等[2]，這些因子通過(guò)相互介導(dǎo)，可形成廣泛且多層次的信號(hào)分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、上皮以及內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，加速傷口愈合和組織修復(fù)[3]。目前PRP多用于退行性疾病、難愈性創(chuàng)面修復(fù)、急慢性損傷、燒傷和角膜損傷等多種臨床疾病的治療，已被廣泛應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科、康復(fù)醫(yī)學(xué)科、心臟外科、婦科、整形外科和眼科等多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域[4]。PRP治療的一個(gè)療程多為1～3周，但其常規(guī)保存期只有5 d，超過(guò)保存期以后的PRP由于理化性質(zhì)等方面的改變會(huì)導(dǎo)致PRP失活，致血液浪費(fèi)。因此，如何長(zhǎng)期保存PRP是目前臨床的一大難題。本研究通過(guò)將PRP在-80 ℃深低溫短期保存后，比較冷凍前后其pH值的變化，以及其內(nèi)P-選擇素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF）等重要生長(zhǎng)因子濃度的變化，為PRP低溫儲(chǔ)存提供理論依據(jù)。 現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

多功能酶標(biāo)分析儀、-80 ℃冰箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），正置倒置一體熒光顯微鏡（美國(guó)Discover Echo公司），筆式pH計(jì)（上海般特儀器有限公司），凝血酶（批號(hào)No.721N031，北京索萊寶公司，終濃度為1×105 U/L）；ABW基質(zhì)膠（批號(hào)20223019ZHA，上海諾娃醫(yī)藥科技有限公司）；VEGF-ELISA試劑盒（批號(hào)25319591007，武漢博士德生物工程有限公司）；PDGF-ELISA試劑盒（批號(hào)7WKTNPQ1JD）和P-選擇素-ELISA試劑盒（批號(hào)KL048RN06998）均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 對(duì)象及其分組

選取30例自愿獻(xiàn)血者的PRP樣本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)獻(xiàn)血者的體檢以及血液檢查的要求；②年齡18～55歲者；③體質(zhì)量50～82 kg者；④身體健康無(wú)傳染病，并在1周內(nèi)未服用過(guò)干擾血小板的藥物者；⑤PRP的計(jì)數(shù)納入標(biāo)準(zhǔn)約為（1 081.30±115.66）×109/L者。將每例PRP分裝成5份，每份0.5 mL，分別為A～E組。A組為新鮮PRP，B～E組分別置于-80 ℃凍存5、10、15、20 d的PRB。

1.3 研究方法

1.3.1 各組PRP的pH值測(cè)定 使用筆式pH計(jì)測(cè)定A～E組PRP的pH值。其中B～E組PRP在從冰箱取出以后，需要先解凍至室溫狀態(tài)，再進(jìn)行測(cè)量。

1.3.2 ELISA方法測(cè)定各組PRP中P-選擇素、PDGF和VEGF的水平 將凝血酶用生理鹽水配成濃度為1×105 U/L的溶液，加入無(wú)水氯化鈣溶解，按照Ca2＋∶凝血酶為40 g/L∶1×105 U/L的比例配置激活溶液。分別取A～E組PRP樣品，按照1 mL的PRP中加入40 μL激活溶液配比激活PRP，靜置2 h后，以15 000 r/min離心10 min，取上層血清。嚴(yán)格按照各細(xì)胞因子的ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)中的要求進(jìn)行操作，在加入終止液后立即用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值，并根據(jù)各自標(biāo)準(zhǔn)曲線，帶入所測(cè)得吸光度值，計(jì)算血清中P-選擇素、PDGF和VEGF水平。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將HUVEC細(xì)胞置于含有10%的FBS的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行換液傳代，傳至第三代的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 HUVEC細(xì)胞血管形成實(shí)驗(yàn) ①將ABW基質(zhì)膠和不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液按照1∶2比例稀釋?zhuān)?4孔板，每孔加入200 μL基質(zhì)膠稀釋液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中45 min使其凝固；②取A組與E組PRP血清分別加入到含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中混勻，留待備用；③將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第三代HUVEC細(xì)胞以胰酶消化，分為兩份，以1 000 r/min離心5 min后棄上清液，分別用配制好的含有A組與E組PRP血清的混合培養(yǎng)基重懸，調(diào)整HUVEC細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，待基質(zhì)膠凝固后于24孔板中每孔中加入200 μL細(xì)胞重懸液，使得每孔中細(xì)胞數(shù)量約為2×105個(gè)，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，使用正置顯微鏡觀察HUVEC細(xì)胞血管形成的數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 9.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖像處理，計(jì)量資料以[AKx-D]±s表示，各組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。A組和E組HUVEC細(xì)胞的血管形成數(shù)量比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 各組PRP的pH值以及PDGF、P-選擇素、VEGF水平比較

A～E組PRP的pH值比較差異無(wú)顯著意義（P＞0.05），各組中P-選擇素、PDGF和VEGF的水平比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 PRP中的生長(zhǎng)因子對(duì)于HUVEC血管形成的影響

A組和E組中HUVEC的血管形成數(shù)量分別為（49.67±3.79）、（50.00±1.00）個(gè)，兩組比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。見(jiàn)圖1。

3 討? 論

PRP中血小板的濃度遠(yuǎn)高于生理基線，在受到刺激后血小板會(huì)釋放大量與創(chuàng)傷愈合相關(guān)的生長(zhǎng)因子和黏附蛋白，從而啟動(dòng)細(xì)胞和組織的修復(fù)并加快其進(jìn)程[5-7]。PRP釋放的大量生長(zhǎng)因子能通過(guò)自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌等機(jī)制啟動(dòng)損傷修復(fù)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)刺激細(xì)胞的遷移和增殖、血管生成和基質(zhì)的合成等途徑，啟動(dòng)和促進(jìn)傷口的愈合和修復(fù)[8]。

近些年來(lái)PRP已被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于臨床中的多個(gè)學(xué)科[9-14]。PRP治療每療程多不超過(guò)3次，時(shí)間間隔多為1～3周。據(jù)此，本研究探索-80 ℃凍存5、10、15、20 d后PRP的pH值及其內(nèi)各種細(xì)胞因子的變化，研究結(jié)果可為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

離體后的血小板失去細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的保護(hù)作用會(huì)變得極其脆弱，容易受劇烈震蕩、溫度和pH值變化等影響而引起血小板的聚集和碎裂，從而影響其生物學(xué)功能。常規(guī)在臨床上PRP多在（22±2）℃的恒溫振蕩箱中保存，并且保存時(shí)間不超過(guò)5 d[13]。依靠這種常溫振蕩保存方法，PRP保存時(shí)間短、易污染和功效易降低或失活等缺點(diǎn)給臨床治療帶來(lái)諸多不便，還需要對(duì)患者進(jìn)行頻繁血液樣本采集，為患者帶來(lái)巨大精神和經(jīng)濟(jì)壓力。因此，在不損害PRP功能的前提下對(duì)其進(jìn)行凍存也已成為關(guān)注熱點(diǎn)之一。隨著深低溫冰箱的推廣，本研究分析PRP儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱后其pH值及各種因子水平的變化，以探索延長(zhǎng)PRP臨床應(yīng)用時(shí)間的方法。

PRP發(fā)揮生理功能的最適pH值約為6.5～7.2，在常溫保存過(guò)程中，PRP仍會(huì)進(jìn)行有氧代謝和糖酵解等新陳代謝，糖酵解產(chǎn)生的乳酸和氫離子積累到一定濃度時(shí)會(huì)使得PRP的pH值迅速下降，當(dāng)pH值下降至6.0～6.1時(shí)，血小板形態(tài)由圓盤(pán)狀變?yōu)閳A球狀，并且此不可逆的形態(tài)變化伴隨血小板數(shù)量下降和釋放的各類(lèi)生長(zhǎng)因子生物學(xué)功能的完全喪失[15]。低溫能夠減慢其新陳代謝進(jìn)程，降低乳酸的生成和積累，維持血漿緩沖作用。本研究結(jié)果顯示，新鮮PRP及-80 ℃凍存5、10、15、20 d的PRP比較，各組的pH值不存在顯著差異，說(shuō)明在-80 ℃凍存條件下能夠延緩PRP糖酵解作用引起的乳酸堆積，延緩pH下降的速度，延長(zhǎng)保存時(shí)間。

血小板釋放的各種生長(zhǎng)因子中，PDGF是一種刺激組織細(xì)胞生長(zhǎng)的肽類(lèi)調(diào)節(jié)分子，生理狀態(tài)下存在于血小板α顆粒中[16]。有研究表明，PDGF在早期發(fā)育階段能通過(guò)結(jié)合PI3K/Akt、JAK/STAT和Src等多條跨膜酪氨酸通路促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂和趨化，從而刺激傷口處成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和其他細(xì)胞的分裂增殖[17-18]。在后期成熟期，PDGF則可促進(jìn)組織重塑以及特殊細(xì)胞的分化[19]。本研究結(jié)果顯示，新鮮PRP及-80 ℃凍存5、10、15、20 d的PRP比較，各組中PDGF含量無(wú)顯著差異，提示凍存的PRP在PDGF水平釋放上可以滿(mǎn)足臨床應(yīng)用需求。

VEGF是一類(lèi)重要的具有促血管生成活性的生長(zhǎng)因子，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有促進(jìn)有絲分裂和抗凋亡作用，能夠增加血管通透性，促進(jìn)細(xì)胞遷移[20]。既往研究顯示，VEGF可以通過(guò)PLCγ-ERK和PLCγ-PKC通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[21]。同時(shí)，VEGF是促進(jìn)血管和淋巴管形成的重要因子，新生的血管和淋巴管可為創(chuàng)面組織的新生和修復(fù)供應(yīng)充足的養(yǎng)分，促進(jìn)傷口的愈合[22-23]。本研究中，新鮮PRP及-80 ℃凍存5、10、15、20 d的PRP比較，各組中VEGF含量比較無(wú)顯著差異；同時(shí)新鮮PRP和-80 ℃凍存20 d的PRP對(duì)HUVEC血管形成能力的影響也無(wú)顯著差異。提示凍存5、10、15、20 d并不會(huì)對(duì)PRP的VEGF濃度造成影響，在促進(jìn)新生血管的生成中的作用與新鮮PRP相近。

另外，血小板中的P-選擇素作為黏附分子家族一員，能夠介導(dǎo)粒細(xì)胞和單核細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞表面的滾動(dòng)以及血小板之間的黏附作用，不僅能夠參與細(xì)胞間和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，調(diào)節(jié)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和炎癥的發(fā)生發(fā)展[24]，而且是在血栓形成和凝血過(guò)程中發(fā)揮有重要作用[25]。P-選擇素能夠易位到活化后的血小板表面，支持血小板-血小板之間的相互作用，促進(jìn)血栓形成和凝血[26]。不僅如此，P-選擇素還能夠促進(jìn)損傷部位對(duì)白細(xì)胞的募集，此行為能夠加速炎癥的早期進(jìn)程[27]。本研究中，PRP在-80 ℃凍存5、10、15、20 d后，與新鮮PRP釋放的P-選擇素比較，并無(wú)顯著差異?？梢?jiàn)，P-選擇素在冰凍20 d后仍能發(fā)揮其正常生物學(xué)功能。

綜上所述，-80 ℃凍存5、10、15、20 d均不影響PRP中PDGF、P-選擇素和VEGF等重要生長(zhǎng)因子的含量及其生物學(xué)功能，同時(shí)能夠顯著延緩其pH值下降的速度，較長(zhǎng)時(shí)間維持PRP功能。該研究結(jié)果為臨床長(zhǎng)時(shí)間保存PRP提供了一定的理論依據(jù)。

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗(yàn)均已通過(guò)青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（文件號(hào)QYFYWZLL28419）。所有試驗(yàn)過(guò)程均遵照《實(shí)驗(yàn)室安全管理守則》的條例進(jìn)行。受試對(duì)象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書(shū)。

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