STX5對肝細胞癌轉移的影響及其機制

郭婷婷 趙梓吟 何明陽 吳天松 徐斌 張斌 吳澤華 韓冰

［摘要］ 目的

探討[STBX]STX5對肝細胞癌（HCC）轉移的影響及其機制。

方法 收集2015年1—12月我院確診為HCC的36例患者的臨床資料，分析腫瘤組織中STX5表達水平與HCC患者臨床病理特征的相關性。將人肝癌細胞MHCC97H分為A、B組，分別轉染陰性對照質粒、過表達STX5質粒，將人肝癌細胞Huh7分為C、D組，分別轉染陰性對照慢病毒、STX5敲減慢病毒，采用Western blot實驗檢測A～D組細胞內STX5蛋白表達水平，采用劃痕實驗檢測A～D組細胞的遷移能力，采用Transwell實驗檢測A～D組細胞的遷移能力。對A、B組細胞經轉錄組學測序分析獲得的差異基因進行GO功能和KEGG信號通路富集分析，實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測A、B組細胞最顯著差異表達基因的水平。將MHCC97H細胞分為E～H組，分別轉染陰性對照質粒、過表達STX5質粒、陰性對照質粒＋Sarilumab、過表達STX5質粒＋Sarilumab，采用劃痕實驗檢測E～H組細胞的遷移能力，采用Transwell實驗檢測E～H組細胞的遷移能力。

結果 腫瘤組織中STX5表達水平與患者的BMI、有無乙型肝炎病毒感染、腫瘤數量有關（P<0.05）。Western blot檢測結果顯示，B組與A組、C組與D組比較，細胞中STX5的表達顯著增高（t=48.86、31.09，P<0.05）。Transwell實驗和劃痕實驗結果顯示，B組與A組、C組與D組比較，細胞遷移能力和劃痕愈合百分比顯著升高（t=7.95～31.09，P<0.05）。GO和KEGG富集分析顯示，A、B組細胞差異基因主要富集在細胞遷移、炎癥等相關功能和通路上；RT-qPCR實驗結果顯示，B組細胞中IL-6 mRNA的表達水平顯著高于A組細胞（t=23.69，P<0.05）。Transwell和劃痕實驗結果顯示，G組和E組、H組和F組比較，細胞遷移能力和劃痕愈合百分比均顯著降低（t=2.94～24.39，P<0.05）。

結論 STX5可能通過上調IL-6 mRNA表達來促進肝細胞癌細胞的轉移。

［關鍵詞］ Qa-SNARE蛋白質類；白細胞介素6；癌，肝細胞；基因表達調控，腫瘤；腫瘤浸潤；腫瘤轉移

［中圖分類號］ R735.7;R730.261??? ［文獻標志碼］ A

目前，在全球范圍內，原發(fā)性肝癌中肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）約占90%，因為HCC細胞具有高侵襲性和易轉移性，致患者的5年存活率較低[1]，即使近年來在肝癌的診斷和治療方法上取得了一定的進展，但患者術后復發(fā)率和轉移率仍然居高不下[2]。因此，臨床迫切需要開發(fā)有效的HCC治療靶點，以改善患者的預后，延長患者的生存期。

STX5為一種單向Ⅳ型膜蛋白，幾乎在機體的所有的細胞中均有表達，是syntaxin家族的重要成員，其主要功能是作為受體，與可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子結合，在細胞內轉運囊泡[3-4]。本課題組先前的研究發(fā)現，STX5可以通過介導PI3K/mTOR信號通路抑制HCC細胞的黏附，進而促進HCC轉移[5]。研究表明，促炎細胞因子如IL-1β、TNF-α和IL-6等在腫瘤微環(huán)境中有助于腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸，促進腫瘤的進展及其轉移，尤其是IL-6被認為是促進多種惡性腫瘤侵襲轉移的慢性炎癥細胞因子[6-8]。然而STX5促進HCC轉移是否有IL-6的參與目前尚不明確。本研究擬通過探究STX5與IL-6之間的調控關系，探討STX5對于HCC細胞轉移的影響及其機制，并為進一步尋找HCC的診斷和治療靶點奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝癌細胞系Huh7和MHCC97H細胞（中國上?？茖W院細胞庫），STX5敲減慢病毒、陰性對照慢病毒、過表達STX5質粒、陰性對照質粒和病毒感染試劑（上海吉凱基因科技有限公司），STX5抗體（英國Abcam公司），GAPDH、β-actin（美國CST公司）。STX5、IL-6、PDL-1、CD36、SLC2A14、GAPDH引物（上海生工生物工程股份有限公司），全波長多功能酶標儀（瑞士Tecan公司），PrimeScrip RT試劑盒（日本TaKaRa公司）以及沙利魯單抗（美國MCE生物科技公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 腫瘤組織中STX5表達水平與HCC患者臨床病理特征的相關性分析 選取我院2015年1—12月確診為HCC行手術治療的患者36例，術前均未進行放化療治療，并均簽署知情同意書。收集所有患者的臨床資料，包括年齡、性別、BMI、甲胎蛋白（AFP）、腫瘤直徑、有無肝硬化、有無酒精史、有無乙型肝炎病毒感染以及腫瘤數量等。根據患者HCC組織中的STX5染色評分結果，將36例患者分為STX5高表達組18例（6～10分）和STX5低表達組18例（<6分）。分析腫瘤組織中STX5表達水平與HCC患者臨床病理特征的相關性。

1.2.2 細胞的培養(yǎng)和轉染 在6孔板上分別接種Huh7細胞和MHCC97H細胞，加入全營養(yǎng)培養(yǎng)基（DMEM、10%的胎牛血清和1%的青霉素/鏈霉素雙抗），于37 ℃、含體積分數0.05的CO2的培養(yǎng)箱當中進行培養(yǎng)。當MHCC97H細胞的融合度達到70%～90%時，分為A、B兩組，A組細胞轉染陰性對照質粒，B組細胞轉染過表達STX5質粒。當Huh7細胞的融合度達30%～50%時，分為C、D兩組，C組細胞轉染陰性對照慢病毒，D組細胞轉染STX5敲減慢病毒。4組細胞轉染完成后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h用于后續(xù)實驗。

1.2.3 蛋白免疫印跡（Western blot）實驗檢測細胞中STX5的相對表達量 提取轉染后培養(yǎng)48 h的A～D組細胞中的總蛋白，并用RIPA裂解緩沖液進行分解。用BCA試劑盒和酶標記儀測定蛋白質濃度。95 ℃下孵育10 min后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白裂解產物（20SymbolmA@g），并轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉后，用特異性一抗在4 ℃條件下孵育12 h，然后與二抗在室溫下孵育約1.5 h，用增強型化學發(fā)光系統(tǒng)讀取蛋白質條帶。最后使用Image J軟件分析目的條帶STX5及內參β-actin灰度值，以STX5/β-actin灰度值表示相對表達水平。實驗重復3次并計算均值。

1.2.4 Transwell實驗檢測HCC細胞的遷移能力

將轉染后培養(yǎng)48 h的A～D組細胞中的培養(yǎng)基，更換為無血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后將各組5×104個細胞種植于不含血清的DMEM培養(yǎng)基的Transwell上室（每孔8 μm），下室為含有30%胎牛血清的DMEM，于37 ℃、含體積分數0.05的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用多聚甲醛將遷移到下室的細胞在室溫下固定30 min，然后再用0.5%的結晶紫染色30 min，最后用PBS清洗去除多余的結晶紫。使用光學顯微鏡對染色細胞進行拍照，使用Image J軟件對遷移細胞進行計數。

1.2.5 細胞劃痕實驗檢測HCC細胞的遷移能力

將轉染完成后培養(yǎng)48 h的A～D組細胞接種于6孔板中，當細胞融合率達90%以上時，采用200 μL濾芯吸頭尖端在6孔板上劃痕，隨后，更換為含有2%胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用電子顯微鏡拍攝劃痕區(qū)域，分別于劃痕后第0、48小時時采集圖像，計算劃痕愈合百分比。劃痕愈合百分比=（0 h劃痕寬度－48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度。

1.2.6 轉錄組學測序及富集分析 將轉染后培養(yǎng)48 h的A、B組MHCC97H細胞，委托上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司進行轉錄組學測序以及富集分析，每組設置3個樣本。對兩組基因表達的結果進行分析，獲得兩組間的差異基因（P<0.05），對差異基因進行GO功能富集分析（http：//geneontology.org）以及KEGG通路富集分析（https：//www.genome.jp/kegg/pathway.html）。將兩組的差異基因按照P值進行排序，選取前5個基因為最顯著差異基因，為后續(xù)實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測的目標基因。

1.2.7 RT-qPCR檢測IL-6等mRNA表達水平

將轉染后培養(yǎng)48 h的A、B組MHCC97H細胞，用RNA-easy分離試劑提取全細胞RNA后，使用紫外分光光度計測定260、280 nm波長處的RNA樣本濃度以及吸光度（A）值，將RNA質量在1.8

1.2.8 MHCC97H細胞回復實驗檢測抑制劑處理后HCC細胞的遷移能力 取融合度達70%～90%的MHCC97H細胞，分為E～H組，E組和G組細胞分別轉染陰性對照質粒，F組和H組細胞分別轉染過表達STX5質粒，轉染成功以后均再繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，G組和H組細胞棄去原培養(yǎng)基，加入IL-6的抑制劑沙利魯單抗6 μmol，再培養(yǎng)24 h；E組和F組細胞，棄去原培養(yǎng)液后，再培養(yǎng)24 h。通過Transwell遷移實驗檢測各組細胞的遷移細胞數量（參照1.2.4中的方法），通過劃痕實驗觀察各組細胞劃痕后第0、48小時時劃痕愈合情況，并計算劃痕愈合百分比（參照1.2.5中的方法）。

1.3 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 23.0軟件進行數據的統(tǒng)計分析。計量數據以[AKx-D]±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料以例表示，兩組之間的比較用確切概率法，STX5在腫瘤組織中的表達水平與HCC患者的臨床病理特征之間的關系使用Pearson方法分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結? 果

2.1 腫瘤組織中STX5表達水平與HCC患者臨床病理特征的相關性

腫瘤組織中STX5表達水平與患者的性別、年齡及腫瘤直徑、血液AFP水平、有無肝硬化、有無飲酒史等指標均無關（P＞0.05），而與患者BMI、有無乙型肝炎病毒感染以及腫瘤數量等顯著相關（P<0.05）。見表2。

2.2 A～D組細胞遷移侵襲能力的比較

Western blot檢測的結果顯示，A、B組MHCC97H細胞中STX5相對表達量分別為1.00±0.00、3.60±0.09，兩組間比較差異有顯著意義（t=48.86，P<0.05）；C、D組Huh7細胞中STX5相對表達量分別為1.00±0.00、0.11±0.03，兩組間比較差異有顯著性（t=31.09，P<0.05），見圖1。Transwell實驗檢測結果顯示，A、B組細胞遷移數目分別為（101.00±2.65）、（234.00±10.15）個，兩組比較差異有顯著性（t=21.96，P<0.05）；C、D組細胞遷移數目分別為（482.70±18.61）、（141.00±4.00）個，兩組比較差異有顯著性（t=31.09，P<0.05），見圖2。劃痕實驗檢測的結果顯示，A、B組細胞的劃痕愈合百分比分別達到（29.03±1.76）%、（47.07±3.51）%，兩組比較差異具有顯著意義（t=7.95，P<0.05）；C、D組細胞劃痕愈合百分比分別為（44.37±1.70）%、（27.07±2.80）%，兩組比較差異有顯著性（t=9.13，P<0.05），見圖3。

2.3 A、B組MHCC97H細胞差異基因分析和檢測

轉錄組學測序結果顯示，A組與B組中的差異基因共387個，其中196個差異基因上調，191個差異基因下調。GO功能富集分析結果顯示，差異基因顯著參與了炎癥的調控、細胞黏附等生物學功能。KEGG通路富集分析結果顯示，差異基因主要參與mTOR、JAK-STAT等通路的調控。對差異最顯著的前5個基因進行RT-qPCR檢測，結果顯示，A組和B組細胞中STX5、IL-6 mRNA相對表達量比較差異具有顯著性（t=24.38、23.69，P<0.05），兩組間PDL-1、CD36、SLC2A14 mRNA相對表達量比較差異無顯著性（P＞0.05）。見表3。

2.4 MHCC97H細胞的回復實驗結果

劃痕實驗檢測的結果顯示，E、G組細胞的劃痕愈合百分比分別達到（32.00±2.00）%、（25.00±3.61）%，兩組比較差異具有顯著意義（t=2.94，P<0.05）；F組和H組劃痕愈合百分比分別為（45.33±2.08）%、（35.67±3.22）%，兩組比較差異有顯著性（t=4.37，P<0.05），見圖4。Transwell實驗結果顯示，E、G組細胞遷移數目分別為（186.00±6.00）、（102.70±2.52）個，兩組比較差異具有顯著意義（t=22.18，P<0.05）；F組和H組細胞遷移數目分別為（453.30±14.19）、（235.00±6.25）個，兩組比較差異有顯著性（t=24.39，P<0.05），見圖5。

3 討? 論

目前，肝癌常見的治療方法主要包括手術切除、消融、肝移植、TACE、放化療、免疫療法、中藥治療等，但患者的長期存活率仍不理想。主要原因是由于肝細胞癌患者術后的高復發(fā)率和高轉移率[9]。因此，降低患者術后的復發(fā)和轉移，探索導致肝細胞癌復發(fā)轉移的治療靶點具有重要的臨床和社會意義。

STX5主要調控真核細胞中的分泌蛋白從內質網到高爾基體的早期運輸。內質網中有著嚴格的質量控制系統(tǒng)，新蛋白質往往在內質網中合成加工，形成具有一定空間功能的蛋白質[10]；而STX5的功能主要是保證蛋白分子正確折疊并且離開內質網輸送到高爾基體，防止蛋白質功能的異?；蚴Щ頪11]，而腫瘤主要發(fā)病機制多是由于一些促癌分子或抑癌分子的錯誤折疊和異常轉運，致功能異常所致[12]。由mTOR通路降低肝癌細胞與細胞外基質之間的黏附，致肝癌細胞從原發(fā)部位脫落，從而促進了腫瘤細胞的轉移[5]。進一步提示STX5可能作為促癌基因參與了腫瘤的侵襲和轉移過程。

本研究首先收集了我院HCC患者的臨床病理組織標本，對腫瘤組織STX5的表達水平與患者的臨床病理特征進行了相關性分析，結果顯示腫瘤組織中STX5的表達水平與患者的BMI、有無乙型肝炎病毒感染和腫瘤數量顯著相關，提示STX5在HCC的發(fā)生和進展中可能發(fā)揮著重要作用。本研究通過在MHCC97H細胞中構建STX5過表達質粒，在Huh7細胞中構建敲減STX5慢病毒，并用Western blot實驗驗證其轉染效率，結果顯示B組細胞中STX5的蛋白表達顯著高于A組細胞，D組細胞中STX5蛋白表達量顯著低于C組。然后本研究又進一步探究STX5對HCC細胞遷移的影響，結果顯示，上調STX5后，B組細胞比A組細胞的遷移能力明顯增強，下調STX5后，D組細胞比C組細胞的遷移能力明顯減弱，進一步提示STX5可促進HCC細胞的轉移。

為了探討STX5調控HCC細胞轉移的機制，通過轉錄組學測序，本研究GO功能富集分析發(fā)現，A組和B組細胞的差異基因顯著參與了炎癥的調控、細胞黏附等生物學功能，提示STX5可能通過影響炎癥的調控，進一步影響HCC的進展。通過KEGG通路富集分析發(fā)現，A組和B組細胞的差異基因主要參與mTOR、JAK-STAT等通路的調控，提示STX5可能通過影響PI3K/mTOR等炎癥相關通路促進HCC的轉移。慢性炎癥已被公認為是引起腫瘤侵襲轉移的重要原因之一[10]，而其中的細胞因子是腫瘤微環(huán)境（TME）的主要調節(jié)者，是癌細胞、腫瘤間質和免疫系統(tǒng)之間的主要溝通橋梁[13-14]。研究發(fā)現，PI3K/mTOR通路不僅參與調節(jié)癌細胞的增殖、生長、代謝和運動[15-16]，還參與了炎癥因子IL-6的調控。因此，對炎癥因子的調控可以作為腫瘤治療的有效介入策略。本研究結果顯示，STX5與炎癥調控相關，并可能通過這一途徑促進HCC的轉移。

本研究對轉錄組測序獲得的前5個最為顯著的差異基因進行RT-qPCR檢測，結果顯示B組細胞中STX5、IL-6 mRNA的表達水平顯著高于A組細胞，而兩組間PDL-1、CD36、SLC2A14 mRNA的表達水平比較無顯著差異，提示STX5可能參與了調控IL-6 mRNA的表達。IL-6及其相關細胞因子被認為是炎癥和腫瘤之間的關鍵因子[17]。IL-6家族包含多個成員：IL-6、抑癌素M（OSM）、白血病抑制因子（LIF）、IL-11、IL-27以及IL-31等[18]。大多數IL-6家族的細胞因子與腫瘤患者的不良預后顯著相關[19-20]。腫瘤的進展、轉移和抗藥性的關鍵環(huán)節(jié)是上皮間質轉化（EMT），IL-6可以通過激活STAT3和Snail等轉錄因子來促進EMT，進一步推動腫瘤的轉移[19]。為了進一步研究STX5是否通過調控IL-6的mRNA水平促進HCC的轉移，本研究通過對G、H組細胞經沙利魯單抗處理，E、F組細胞不處理，進行回復實驗，結果顯示，加入抑制劑后，G組細胞比E組細胞的遷移能力明顯減弱，H組細胞比F組細胞的遷移能力明顯減弱。本課題組先前的研究也表明，STX5促進HCC轉移的作用與促進EMT是密切相關的[5]。結合本研究的結果，提示STX5可能是通過上調IL-6的mRNA水平促進EMT，并進一步促進HCC細胞的轉移。

綜上所述，STX5具有促進HCC轉移的作用，其機制不僅與EMT和PI3K/mTOR通路相關，還與上調IL-6 mRNA的水平密切相關。未來應進一步探究STX5、IL-6與腫瘤微環(huán)境之間調控的具體機制，為HCC的治療提供新思路。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的審核批準（文件號QYFYWZLL26906）。所有試驗過程均遵照《赫爾辛基宣言（1996版）》和中國有關臨床試驗研究規(guī)范法規(guī)進行。受試對象及其親屬已經簽署知情同意書。

［參考文獻］

[1]LI X， RAMADORI P， PFISTER D， et al. The immunological and metabolic landscape in primary and metastatic liver cancer[J]. Nat Rev Cancer， 2021，21（9）：541-557.