?湖南多花黃精快速繁殖體系的建立?

? 唐銘鑫　符天昊　楊韜壇　沈子豪　龔海健　歐躍紅　劉葉蔓　寧露云

摘要：該研究分別以葉片、根狀莖、芽以及種子為外植體，基于前人研究對培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，共確定了21種培養(yǎng)基配方，從中篩選適用于湖南多花黃精的最佳萌發(fā)培養(yǎng)基、最佳增殖培養(yǎng)基以及最佳生根培養(yǎng)基配方，建立了湖南多花黃精快速繁殖體系。結(jié)果表明：以當(dāng)年采收的種子為外植體，消毒后縱切再接種培養(yǎng)效果較好；最佳萌發(fā)培養(yǎng)基配方為：B5+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+30 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂+2.0 mg/L GA3；最佳增殖培養(yǎng)基配方為：MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂；最佳生根培養(yǎng)基配方為：1/2 MS+1.0 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。該研究為湖南多花黃精組培苗的生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步擴(kuò)大多花黃精的人工種植規(guī)模提供了技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：多花黃精；組織培養(yǎng)；萌發(fā)；增殖；生根

中圖分類號：S567.239文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1006-060X（2024）05-0007-06

A Rapid Propagation System for Polygonatum cyrtonema in Hunan

TANG Ming-xin1，F(xiàn)U Tian-hao1，YANG Tao-tan1，SHEN Zi-hao1，GONG Hai-jian1，OU Yue-hong2，

LIU Ye-man1，NING Lu-yun1

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， PRC; 2. Loudi Zhifang Biotechnology Co.， Ltd.， Loudi 417000， PRC）

Abstract： This study aimed to establish a rapid propagation system for Polygonatum cyrtonema in Hunan. With the leaves， rhizomes， buds， and seeds as explants， 21 media were designed based on the available studies， and the optimal media for germination， propagation， and rooting of P. cyrtonema were selected. The results indicated the fresh seeds harvested in the current year were the best explants， and those disinfected and cut longitudinally showcased good performance in tissue culture. The optimal medium for germination was B5 + 1.0 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L KT + 30 g/L sucrose + 6.0 g/L agar + 2.0 mg/L GA3. The optimal medium for propagation was MS + 4.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA + 30 g/L sucrose + 6.5 g/L agar. The optimal medium for rooting was 1/2 MS +

1.0 mg/L NAA + 30 g/L sucrose + 6.5 g/L agar. The findings lay a theoretical foundation for producing tissue culture seedlings and provide technical support for expanding the planting scale of P. cyrtonema in Hunan.

Key words： Polygonatum cyrtonema; tissue culture; germination; propagation; rooting

中藥黃精味甘性平，具有養(yǎng)陰潤肺、補(bǔ)氣健脾的功效，主治心悸氣短、肺燥干咳、久病津虧口干、體虛乏力以及糖尿病、高血壓等癥，屬于常用的藥食同源植物[1]。據(jù)《中華人民共和國藥典》記載，中藥黃精為百合科（Liliaceae Juss）黃精屬（Polygonatum Mill）植物黃精（Polygonatum sibiricum Red.）、滇黃精（Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.）或多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）的干燥根莖[2]。其中，黃精在內(nèi)蒙古武川、卓資、涼城和河北遵化、興隆、承德等地區(qū)分布較多；滇黃精主要分布于云南、四川及貴州等地；多花黃精則主要集中在湖南、安徽、湖北、浙江等南方地區(qū)[3]。湖南省內(nèi)分布的黃精資源十分豐富，有多花黃精、卷葉黃精、輪葉黃精、滇黃精、二苞黃精、長梗黃精、湖北黃精和垂葉黃精等，其中分布最廣的為多花黃精，品質(zhì)上乘且蘊(yùn)藏量大，是我國多花黃精的主要產(chǎn)地之一[4]。隨著對多花黃精的開發(fā)利用，其野生資源遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場需求，發(fā)展人工栽培技術(shù)、擴(kuò)大多花黃精的人工種植規(guī)模具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

多花黃精結(jié)實(shí)量大，但種子存在形態(tài)休眠和生理休眠現(xiàn)象[5-6]，成苗率低，育苗周期長（播種后2 a才能長出真葉）[7]，在一定程度上限制了多花黃精的栽培和應(yīng)用。在多花黃精常規(guī)栽種中，通常以根狀莖進(jìn)行繁殖，一般選用長勢好且具有健康芽頭的根狀莖做種[8]，也可以選擇1～2年生且健壯、無病害的根狀莖先端的幼嫩部分栽種[9]。但由于移栽時(shí)期、種苗標(biāo)準(zhǔn)不一，成活率不高，需要大量補(bǔ)苗，并且成活后的植株生長不一致，嚴(yán)重制約了多花黃精的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。此外，雖然根狀莖繁殖取材方便、操作簡便，但是需要耗費(fèi)大量的藥用部位，成本較高，并且長期利用無性繁殖容易造成感染病害、品種退化等問題。

隨著植物生物技術(shù)的快速發(fā)展，科研工作者對多花黃精的高效再生體系進(jìn)行了積極探索，目前已取得了一些進(jìn)展：王輝等[10]以多花黃精種子萌發(fā)后的幼芽為啟動(dòng)材料進(jìn)行組織培養(yǎng)，選出了最佳愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽增殖及生根培養(yǎng)方案；莫勇生等[11]以多花黃精無菌種子為外植體，選出了多花黃精組培過程中啟動(dòng)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)及生根壯苗的最佳培養(yǎng)基配方；陳松樹等[12]則建立了以葉片為起始材料的多花黃精再生體系，在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加不同濃度的2，4-D、NAA和6-BA，成功篩選出誘導(dǎo)愈傷組織、叢生芽以及生根的最佳培養(yǎng)基配方；吳宇函等[13]以未成熟的多花黃精果實(shí)為外植體，成功建立了植株組培快繁體系；劉芳源等[14]以多花黃精根狀莖為外植體篩選出芽增殖系數(shù)較高的配方。此外，還有一些以種子、根狀莖為外植體的多花黃精組培體系的報(bào)道[15-18]。但是，不同地區(qū)的多花黃精種質(zhì)資源遺傳背景存在差異，故其組織培養(yǎng)體系可能不能通用。

湖南省為多花黃精的主要產(chǎn)地之一，栽培規(guī)模大，亟需大量種苗，導(dǎo)致目前多花黃精種苗價(jià)格居高不下。該研究分別以葉片、根狀莖、芽以及種子為外植體，基于前人研究對培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，篩選適用于湖南多花黃精的最佳萌發(fā)培養(yǎng)基、最佳增殖培養(yǎng)基以及最佳生根培養(yǎng)基配方，建立湖南多花黃精快速繁殖體系，旨在為多花黃精組培苗的工廠化生產(chǎn)以及穩(wěn)定供應(yīng)奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，為擴(kuò)大多花黃精的人工栽培提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究所用多花黃精外植體材料均來自湖南省懷化市雪峰山林場，于2022年9月收集成熟的多花黃精果實(shí)，人工去除果皮、清洗晾干后將種子保存于4 ℃冰箱備用，視為當(dāng)年采收種子。同時(shí)，冰箱里保存有2021年采收的種子，視為往年種子。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體處理 首先將外植體（葉片、根狀莖、芽和種子）用清水洗凈，并放到流水下沖洗過夜，之后在超凈工作臺中操作：75%酒精潤洗45 s，0.1%升汞消毒7 min，無菌水沖洗5遍，置于無菌濾紙上吸干備用。將消毒后的葉片切成0.8 cm×0.8 cm的小塊；將根狀莖切成長0.8 cm、寬0.8 cm、厚0.3 cm的小塊；將帶芽根狀莖切去多余部分，保留芽頭；將種子直接接種到培養(yǎng)基中，或沿種孔和種臍的方向縱切，保留含有白色胚的部分（圖1）；將上述處理后的外植體放到對應(yīng)的培養(yǎng)基中。

1.2.2 培養(yǎng)基配方 該研究共確定了21種培養(yǎng)基配方，其中萌發(fā)培養(yǎng)基配方見表1，增殖和生根培養(yǎng)基配方見表2。MS、1/2 MS以及B5培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司，所有激素均購自Sigma公司，蔗糖、瓊脂和肌醇購自上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.2.3 培養(yǎng)方法 配方1～6：以葉片和根狀莖為外植體分別培養(yǎng)3批，每批12個(gè)皿，每個(gè)皿接種12～15塊外植體；配方7：以基地采的地下根狀莖芽為外植體培養(yǎng)3批，每批12瓶，每瓶接種2～3個(gè)芽；配方8～11：以完整種子和縱切種子作為外植體分別培養(yǎng)3批，每批12個(gè)皿，每個(gè)皿接種6～12顆種子；配方12～15：將種子縱切后接種，分別培養(yǎng)3批，每批12個(gè)皿，每個(gè)皿接種6～12顆種子；配方16～18：以無菌種子萌發(fā)的初生根狀莖為外植體，每個(gè)配方培養(yǎng)3批，每批15瓶，每瓶接種1～3個(gè)芽；配方19～21：將增殖培養(yǎng)得到的叢生芽按單個(gè)生長點(diǎn)切下（同時(shí)帶有部分根狀莖組織），垂直插入培養(yǎng)基中，每個(gè)配方接種3批，每批15瓶，每瓶2～3棵。

1.2.4 滅菌與培養(yǎng)條件 所有培養(yǎng)器皿、接種工具以及不同配方的培養(yǎng)基均在121 ℃、0.125 MPa條件下滅菌25 min后使用（其中GA3為抽濾滅菌）；所有培養(yǎng)基pH調(diào)至5.8～6.0；組培室培養(yǎng)條件設(shè)置為：光照強(qiáng)度2 000 lx、溫度25 ℃、濕度80%、白天和黑夜各12 h。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 萌發(fā)培養(yǎng)基配方的篩選

2.1.1 以葉片、根狀莖和芽為外植體的培養(yǎng)情況 在配方1～6號培養(yǎng)基中，葉片及根狀莖都在培養(yǎng)30 d內(nèi)褐化死亡；在配方7號培養(yǎng)基中，根狀莖芽陸續(xù)污染死亡（可能是使用的地下根狀莖芽攜帶大量土壤微生物，外植體消毒難度較高導(dǎo)致消毒不徹底），而未出現(xiàn)污染的材料直至60 d后也無任何生長跡象，芽頭一直處于休眠狀態(tài)?？梢?，配方1～7號培養(yǎng)基不適用于湖南多花黃精的培養(yǎng)。

2.1.2 以種子為外植體的培養(yǎng)情況 在配方8號培養(yǎng)基中，完整種子和縱切種子在培養(yǎng)40 d后均未萌發(fā)；在配方9～11號培養(yǎng)基中，完整種子培養(yǎng)40 d后未萌發(fā)，但縱切種子培養(yǎng)20 d即生出初生根狀莖和芽，開始萌發(fā)，以多花黃精種子為外植體的組織培養(yǎng)過程見圖2。培養(yǎng)40 d后對縱切種子萌發(fā)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖3），結(jié)果表明，配方9～11號培養(yǎng)基中的萌發(fā)率都比較低。為了提高萌發(fā)率，該研究在配方11的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，得到了配方12～15。同樣將種子縱切后接種，培養(yǎng)至40 d統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。如圖3所示，在添加GA3后，多花黃精種子萌發(fā)率有了顯著提高，尤其是配方14和配方15。以上結(jié)果均來自當(dāng)年采收的新鮮種子。同時(shí)，該研究對保存在冰箱的往年種子進(jìn)行了相同的萌發(fā)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)往年種子內(nèi)生菌較多，污染嚴(yán)重，無法進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。由此可知，往年種子不適合作為外植體進(jìn)行多花黃精的快速繁殖，應(yīng)以當(dāng)年采收的新鮮種子為宜。

2.2 增殖培養(yǎng)基配方的篩選

為了篩選適合湖南多花黃精芽增殖的培養(yǎng)基配方，該研究在前人研究結(jié)果（配方16）的基礎(chǔ)上另外設(shè)計(jì)了配方17和18，并以由種子萌發(fā)后分化的帶芽初生根狀莖為材料進(jìn)行增殖培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在18號培養(yǎng)基中，10 d后便可看到初生根狀莖明顯膨大，并伴隨多個(gè)芽生長點(diǎn)的分化，之后陸續(xù)長出葉片。根據(jù)圖4可知，與另外2個(gè)配方相比，配方18的芽長勢最旺，葉片肥厚濃綠。最后對培養(yǎng)40 d的材料進(jìn)行芽增殖倍數(shù)的統(tǒng)計(jì)（圖5），發(fā)現(xiàn)配方18的芽增殖倍數(shù)最高，可達(dá)19.48倍，顯著高于配方16和配方17。這些結(jié)果說明配方18比較適合湖南多花黃精芽的增殖培養(yǎng)。

2.3 生根培養(yǎng)基配方的篩選

生根培養(yǎng)是生產(chǎn)組培苗的一個(gè)重要過程。1/2 MS培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中常用的生根培養(yǎng)基，與MS培養(yǎng)基相比，1/2 MS培養(yǎng)基中大量元素減半，更有利于生根。該研究在1/2 MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加不同濃度的NAA，設(shè)計(jì)了配方19～21，探討多花黃精芽的生根情況。培養(yǎng)10 d后，配方21中出現(xiàn)根的分化，其他配方在15～20 d后才陸續(xù)出現(xiàn)根的分化。30 d后觀察3個(gè)配方中芽的生根情況，根據(jù)圖6可知，配方21中的根系明顯比另外2個(gè)配方發(fā)達(dá)，更有利于后續(xù)的煉苗移栽。對3個(gè)配方中芽的生根率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，根據(jù)圖7可知，配方21的生根率高達(dá)90.62%，顯著高于配方19和20。

3 討論與結(jié)論

湖南省內(nèi)分布的黃精資源豐富，其中多花黃精分布最廣、品質(zhì)上乘且蘊(yùn)藏量大[4]。近年來，人們對多花黃精的需求持續(xù)增高，湖南各地區(qū)開始大量種植多花黃精，如婁底新化、懷化洪江、益陽安化等地。大規(guī)模的種植需要大量的種苗，而多花黃精種子存在休眠機(jī)制，因而繁殖難度較大，且長期利用根狀莖繁殖易造成品種退化[19]，這些不利因素極大地制約了湖南多花黃精種植規(guī)模的擴(kuò)大。植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖速度快、脫毒、占用空間小等優(yōu)勢，目前已經(jīng)成功應(yīng)用到多種植物的種苗生產(chǎn)

中[20-22]。目前，植物組織培養(yǎng)技術(shù)也已經(jīng)開始應(yīng)用到多花黃精的種苗研究中[10-18]，但是鮮有關(guān)于湖南多花黃精組織培養(yǎng)體系的報(bào)道。因此，該研究在前人的研究基礎(chǔ)上對不同階段的培養(yǎng)基配方進(jìn)行了優(yōu)化，以期建立適用于湖南多花黃精的快速繁殖體系。

首先，該研究發(fā)現(xiàn)配方1～8均不能誘導(dǎo)愈傷組織與芽的萌發(fā)，其中葉片和根狀莖最終都褐化死亡，而芽和種子均不能解除休眠。配方1～8所參考的研究中的試驗(yàn)材料均來自不同地區(qū)，可見由于材料的遺傳背景不同，使用同一配方進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果也會存在差異。此外，參考鐘燦等[15]的配方9～11進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)種子萌發(fā)率較低。GA3常用于解除種子休眠[23]，因此，該研究基于配方11進(jìn)行改良，在配方中添加了不同濃度的GA3，結(jié)果配方14和15中種子萌發(fā)率顯著高于其它配方。但是，目前配方中最高的萌發(fā)率還不到20%，故后續(xù)還需要進(jìn)一步優(yōu)化配方，提高種子萌發(fā)率。

在增殖培養(yǎng)中，3個(gè)配方都能促進(jìn)初生根狀莖中芽的增殖并形成愈傷組織，但配方18的增殖倍數(shù)顯著高于其他2個(gè)配方?？梢姡?，4-D和NAA雖然都是生長素類的植物激素，但是在湖南多花黃精芽的增殖過程中NAA效果更好。在生根培養(yǎng)中，設(shè)計(jì)了3個(gè)配方，其中配方19的生根率明顯低于配方20和21，且長出的根系稀疏；而配方21中多花黃精根系發(fā)達(dá)且生根率高達(dá)90.62%。而根據(jù)王輝等[10]的研究：1/2 MS+0.1 mg/L NAA為最適宜的生根培養(yǎng)基配方，這個(gè)配方中NAA的濃度低于筆者研究設(shè)計(jì)配方的NAA濃度，出現(xiàn)這種差異的原因可能是試驗(yàn)材料的產(chǎn)區(qū)不同，說明湖南多花黃精的生根誘導(dǎo)需要較高濃度的NAA。

綜上所述，基于前人研究經(jīng)驗(yàn)，該研究對培養(yǎng)基配方進(jìn)行了優(yōu)化，最終成功建立了湖南多花黃精快速繁殖體系：以當(dāng)年采收的種子為外植體，消毒后進(jìn)行縱切再接種培養(yǎng)；最佳萌發(fā)培養(yǎng)基配方為：B5+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+30 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂+2.0 mg/L GA3；最佳增殖培養(yǎng)基配方為：MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂；最佳生根培養(yǎng)基配方為：1/2 MS+1.0 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。該研究為湖南多花黃精組培苗的生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步擴(kuò)大湖南多花黃精的人工種植規(guī)模提供了技術(shù)支撐。

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（責(zé)任編輯：王婷）

收稿日期：2023-12-18

基金項(xiàng)目：湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2023JJ40482）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)2022年度校級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目；湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（22C0189）；2023年湖南省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2023SK2046）；2022年度中醫(yī)藥民族醫(yī)藥國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室開放基金（2022GJSYS09）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)校級科研項(xiàng)目（2021XJJJ015）

作者簡介：唐銘鑫（2002—），男，湖南衡陽市人，本科生，研究方向?yàn)橹参锷锛夹g(shù)。

通信作者：劉葉蔓，寧露云