美味獼猴桃MYB家族鑒定及其對(duì)水淹脅迫的響應(yīng)

樂有章 王建軍 戢小梅 遲文超 林之希

摘要：基于美味獼猴桃（Actinidia deliciosa）二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，通過多種生物信息學(xué)手段鑒定和分析了AcMYB家族基因。結(jié)果表明，在美味獼猴桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共獲得64個(gè)具有完整ORF序列的AcMYB家族成員，將其分成4個(gè)亞族，其中亞族Ⅰ共34個(gè)成員，亞族Ⅱ共18個(gè)成員，亞族Ⅲ共10個(gè)成員，亞族Ⅳ共2個(gè)成員。水淹處理前后表達(dá)分析顯示，AcMYB_214187、AcMYB_25788等AcMYB成員美味獼猴桃根中的表達(dá)水平明顯降低，快速響應(yīng)水淹脅迫，而葉中的表達(dá)水平差異不明顯。AcMYB_19450、AcMYB_30021等AcMYB成員根中的表達(dá)水平差異不明顯，但葉中的表達(dá)水平明顯降低，可能原因是根接收到低氧脅迫信號(hào)后，將其傳遞到地上部并發(fā)揮作用，通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控美味獼猴桃對(duì)低氧脅迫的響應(yīng)。研究結(jié)果為后續(xù)開展美味獼猴桃MYB轉(zhuǎn)錄因子研究、促進(jìn)抗逆境育種、提高產(chǎn)量提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：美味獼猴桃（Actinidia deliciosa）；AcMYB；鑒定；水淹脅迫；響應(yīng)

中圖分類號(hào)：S663.4???????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）05-0215-08

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.05.037??????????? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Identification of the MYB family of Actinidia deliciosa and its response to flooding stress

YUE You-zhang1，WANG Jian-jun2， JI Xiao-mei1， CHI Wen-chao2，LIN Zhi-xi2

（1.Wuhan Academy of Agricultural Sciences，Wuhan? 430075，China；

2. College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing? 210095，China）

Abstract： Based on the second-generation transcriptome sequencing data of Actinidia deliciosa， AcMYB family genes were identified and analyzed using various bioinformatics methods. The results showed that a total of 64 AcMYB family members with complete ORF sequences were obtained from the transcriptome data of Actinidia deliciosa， which were divided into 4 subgroups. Among them， subgroup I had 34 members， subgroup II had 18 members， subgroup III had 10 members， and subgroup IV had 2 members. Expression analysis before and after waterlogging treatment showed that the expression levels of AcMYB members such as AcMYB214187 and AcMYB25788 were significantly reduced in the roots of Actinidia deliciosa， responding quickly to waterlogging stress， while there was no significant difference in expression levels in the leaves. The expression levels in the roots of AcMYB members such as AcMYB19450 and AcMYB30021 were not significantly different， but the expression levels in the leaves were significantly reduced. This might be due to the fact that the roots， upon receiving hypoxic stress signals， transmitted them to the aboveground parts and exerted their effects， regulating the response of Actinidia deliciosa to hypoxic stress at the transcriptional level. The research results provided a basis for further research on MYB transcription factors in Actinidia deliciosa， promoting stress resistance breeding， and improving yield.

Key words： Actinidia deliciosa； AcMYB； identification； flooding stress； response

收稿日期：2023-07-29

作者簡(jiǎn)介：樂有章（1966-），男，湖北通山人，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事獼猴桃資源搜集、評(píng)價(jià)及獼猴桃栽培育種工作，（電話）13986282616（電子信箱）390086056@qq.com；通信作者，王建軍（1969-），男，浙江嵊州人，副教授，碩士，主要從事園藝作物遺傳與育種工作，（電話）13951709767（電子信箱）1991009@njau.edu.cn。

樂有章，王建軍，戢小梅，等. 美味獼猴桃MYB家族鑒定及其對(duì)水淹脅迫的響應(yīng)［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，63（5）：215-222．

MYB是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，且廣泛存在與真核生物中，功能豐富，參與植物多種生物學(xué)途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［1］。MYB轉(zhuǎn)錄因子N端存在高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-binding domain，DBD），該結(jié)構(gòu)域通常由4個(gè)約52個(gè)氨基酸的不完全氨基酸重復(fù)序列（R）組成，這些重復(fù)序列被重命名為R1、R2和R3，在植物中，MYB轉(zhuǎn)錄因子包含1～4個(gè)DNA結(jié)合重復(fù)序列。然而，大多數(shù)MYB蛋白包含2個(gè)重復(fù)序列，屬于R2R3-MYB亞家族［2］。許多植物中的MYB家族成員已被鑒定，擬南芥中共鑒定到196個(gè)MYB成員，其中包含126個(gè)R2R3-MYB亞家族，水稻中共鑒定到185個(gè)MYB成員，包含109個(gè)R2R3-MYB亞家族［3］。

多項(xiàng)研究表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。過表達(dá)OsMYB48-1增強(qiáng)了水稻的耐旱性和耐鹽性，且通過ABA途徑參與干旱和鹽脅迫的調(diào)控［4］。R2R3類型的MYB成員OsMYB2可以調(diào)控水稻的耐鹽性、耐旱性和耐冷性［5］。過表達(dá)獼猴桃中AcMYB3R增強(qiáng)了擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性和耐鹽性［6］。

獼猴桃因富含高維生素C而享譽(yù)全球，廣受消費(fèi)者的喜愛。近年來，隨著中國(guó)獼猴桃產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，其栽培面積和產(chǎn)量居世界前列。獼猴桃對(duì)澇害脅迫敏感［7］，同時(shí)由于南方年均降雨較多，北方短期內(nèi)強(qiáng)降雨導(dǎo)致積水，在獼猴桃種植過程中易發(fā)生澇害，嚴(yán)重阻礙了獼猴桃穩(wěn)定生產(chǎn)［8］。通過深入研究獼猴桃耐澇性的生理和分子機(jī)制，可以減少澇害造成的損失［9］。因此，通過生物信息學(xué)分析手段挖掘獼猴桃對(duì)水淹脅迫的響應(yīng)基因，對(duì)培育耐澇獼猴桃品種具有重要意義。本研究基于美味獼猴桃（Actinidia deliciosa）的轉(zhuǎn)錄組分析鑒定AcMYB家族成員，并分析水淹處理后AcMYB的逆境響應(yīng)模式，對(duì)后續(xù)開展AcMYB轉(zhuǎn)錄因子功能研究，推進(jìn)獼猴桃抗逆境育種，提高獼猴桃產(chǎn)量具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

獼猴桃品種為美味獼猴桃；對(duì)美味獼猴桃水淹處理2周左右，收集根和葉片組織，置于液氮快速冷凍，-80 ℃中保存用于RNA提取。

1.2 RNA-Seq測(cè)序

按照Trizol試劑盒說明書提取美味獼猴桃各組織的總RNA，經(jīng)檢測(cè)合格后等量混合，基于Illumina公司 Hiseq 4000（Illumina， San Diego， USA）平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并采用Trinity軟件［10］拼接獲取Unigenes。

1.3 AcMYB轉(zhuǎn)錄因子基因篩選

利用EMBOSS軟件［11］預(yù)測(cè)美味獼猴桃Unigenes的開放閱讀框（ORF），獲取美味獼猴桃Unigenes編碼蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)。從EMBL-EBI網(wǎng)站（https：//pfam.xfam.org/）下載MYB保守域種子序列（序列號(hào)PF000249），利用HMMER 3.0軟件建立隱馬可夫模型（Profile HMM），檢索美味獼猴桃Unigenes編碼蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。根據(jù)MYB保守結(jié)構(gòu)域序列覆蓋度和E值等參數(shù)，利用Perl腳本篩選獲得覆蓋度高、置信度高的AcMYB轉(zhuǎn)錄因子序列。

1.4 AcMYB轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化分析

運(yùn)用MEGA-X對(duì)篩選到的AcMYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì)，采用鄰接法（Neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（參數(shù)設(shè)置：Poisson model、Pairwise deletion和Bootstrap，1 000次重復(fù)）。

1.5 AcMYB蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域分析

利用DNAMAN 7.0軟件對(duì)篩選到的AcMYB蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，獲得保守結(jié)構(gòu)域區(qū)域。利用MEME（http：//meme-suite.org/）和WebLogo 3（http：//weblogo.threeplusone.com/）對(duì)AcMYB保守結(jié)構(gòu)域序列標(biāo)簽進(jìn)行分析。

1.6 AcMYB理化性質(zhì)分析

AcMYB氨基酸序列長(zhǎng)度、分子大小和理論等電點(diǎn)等信息采用ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）分析。二級(jí)結(jié)構(gòu)采用SOPMA（htttp：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/nps）獲取相關(guān)信息。

1.7 AcMYB基因的逆境響應(yīng)模式分析

利用Bowtie 2.0軟件（http：//bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml）將下載的轉(zhuǎn)錄組reads數(shù)據(jù)與篩選到的AcMYB基因進(jìn)行映射分析。使用Trinity包的Perl腳本語言，計(jì)算每個(gè)AcMYB基因的FPKM（Reads per kilobase of exon model per million mapped reads），分析AcMYB基因家族在水淹處理前后對(duì)水淹脅迫響應(yīng)的表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA-Seq測(cè)序及組裝

通過Illumina HiSeq？對(duì)混合RNA樣品進(jìn)行二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，經(jīng)組裝、聚類后得到美味獼猴桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，其中Unigenes為541 285條，總長(zhǎng)度為275 938 171 bp，如表1所示。

2.2 AcMYB家族成員鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化分析

541 285條美味獼猴桃Unigenes經(jīng)預(yù)測(cè)獲取了170 578條蛋白序列（長(zhǎng)度≥150 aa），利用Pfam獲取MYB轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域序列，序列號(hào)為PF00249。共篩選到64條AcMYB蛋白序列。

利用MEGA-X對(duì)AcMYB蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，使用Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。根據(jù)AcMYB家族成員的親緣關(guān)系和保守結(jié)構(gòu)域?qū)?4個(gè)AcMYB成員分成4個(gè)亞族。亞族Ⅰ共34個(gè)成員，亞族Ⅱ共18個(gè)成員，亞族Ⅲ共10個(gè)成員，亞族Ⅳ共2個(gè)成員，如圖1所示。

2.3 AcMYB保守結(jié)構(gòu)域分析

對(duì)美味獼猴桃AcMYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，共預(yù)測(cè)到3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別為AcMYB domain1、AcMYB domain2、AcMYB domain3。AcMYB domain1成員共27個(gè)，該結(jié)構(gòu)域由29個(gè)氨基酸組成，其中有非常保守的甘氨酸（G）、脯氨酸（P）、甲硫氨酸（M）、絲氨酸（S）、組氨酸（H），以及較保守的賴氨酸（K）、亮氨酸（L）、纈氨酸（V）；AcMYB domain1主要存在于亞族Ⅰ。AcMYB domain2成員共29個(gè)，由15個(gè)氨基酸組成，其中色氨酸（W）和苯丙氨酸（F）較保守；AcMYB domain2主要存在于亞族Ⅰ和亞族Ⅱ。AcMYB domain3成員共6個(gè)，該結(jié)構(gòu)域由50個(gè)氨基酸組成且大部分氨基酸極為保守，如圖2所示。

隨后對(duì)AcMYB家族中不同成員的保守基序（motif）進(jìn)行分析，共預(yù)測(cè)到19個(gè)motif，其中27個(gè)AcMYB成員都包含motif5，17個(gè)成員都包含motif2，13個(gè)成員都包含motif8（圖3），表明motif5、motif2、motif8對(duì)AcMYB的功能起較為關(guān)鍵的作用。

2.4 AcMYB蛋白序列的理化性質(zhì)分析

對(duì)AcMYB蛋白序列的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果（表2）表明，不同亞族之間的等電點(diǎn)、相對(duì)分子質(zhì)量和氨基酸長(zhǎng)度等理化性質(zhì)存在差異。亞族Ⅲ與其他亞族之間的差異較大，其等電點(diǎn)較低、相對(duì)分子質(zhì)量較大、氨基酸長(zhǎng)度較長(zhǎng)、α-螺旋占比較高、β-折疊占比較低。亞族Ⅰ和亞族Ⅱ的蛋白序列具有較高的相似性。

2.5 AcMYB家族對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)模式

為了探究AcMYB家族基因?qū)λ兔{迫的表達(dá)模式，對(duì)美味獼猴桃水淹處理前后的根、葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。美味獼猴桃中大多數(shù)AcMYB轉(zhuǎn)錄因子在水淹處理后均顯示差異表達(dá)，說明AcMYB家族作為上游調(diào)節(jié)因子在水淹低氧脅迫中發(fā)揮重要功能。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析，結(jié)果（圖4）顯示，聚類Ⅰ中AcMYB轉(zhuǎn)錄因子主要在根中高表達(dá)，主要包括AcMYB_288897、AcMYB_159495、AcMYB_29425等亞族Ⅰ成員，AcMYB_44795、AcMYB_38321等亞族Ⅱ成員和少部分AcMYB_37746、AcMYB_22621等亞族Ⅲ成員。通過水淹處理后，聚類Ⅰ中AcMYB成員在根中表達(dá)明顯降低。

在水淹處理后，聚類Ⅱ中AcMYB_1672/AcMYB_2171等AcMYB成員根、葉的表達(dá)水平明顯升高，可能在低氧脅迫中發(fā)揮正調(diào)節(jié)作用。在水淹處理后，聚類Ⅲ中AcMYB_1002、AcMYB_20041、AcMYB_15669等AcMYB成員根中的表達(dá)水平明顯降低，而在葉中的表達(dá)水平明顯升高；在水淹處理后，聚類Ⅲ中AcMYB_214187、AcMYB_25788等AcMYB成員根中的表達(dá)水平明顯降低，而葉中的表達(dá)水平差異不明顯。在水淹處理后，聚類Ⅳ中AcMYB_37906、AcMYB_17409、AcMYB_28885等AcMYB成員根、葉中的表達(dá)水平明顯降低；聚類Ⅳ中AcMYB_19450、AcMYB_30021等AcMYB成員根中的表達(dá)水平差異不明顯，但葉中的表達(dá)水平明顯降低，可能原因是根接收到低氧脅迫信號(hào)后，將其傳遞到地上部并發(fā)揮作用，通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控獼猴桃對(duì)低氧脅迫的響應(yīng)。

以上結(jié)果表明，美味獼猴桃中的大部分AcMYB轉(zhuǎn)錄因子均參與水淹脅迫響應(yīng)，有些AcMYB成員在根中快速響應(yīng)水淹脅迫，有些AcMYB成員在葉中接受到來自根的脅迫信號(hào)后產(chǎn)生相應(yīng)的響應(yīng)。

3 小結(jié)與討論

水淹脅迫本質(zhì)是根系缺氧誘發(fā)的一系列生理變化，如光合作用抑制、無氧呼吸［12，13］。長(zhǎng)時(shí)間的厭氧呼吸會(huì)導(dǎo)致有害物質(zhì)（如乙醛、乙醇和重金屬離子）在根際中積累，導(dǎo)致根部損傷甚至植物死亡［14，15］。擬南芥中VII族乙烯響應(yīng)因子（ERF-VIIs）參與水淹脅迫信號(hào)傳遞的內(nèi)在機(jī)制逐漸被解析［16］。同時(shí)，SR1-WRKY33-RAP2.2模塊開關(guān)與N端降解因子（N-degron）途徑存在串?dāng)_，調(diào)節(jié)擬南芥對(duì)水淹脅迫的響應(yīng)［17，18］。獼猴桃中耐澇相關(guān)基因的鑒定集中于ERF家族。通過轉(zhuǎn)錄組分析，獼猴桃KR5中鑒定了131個(gè)ERF基因，發(fā)現(xiàn)ERF-VIIs中6個(gè)AvERF基因在水淹處理12 h后表達(dá)顯著上升［19］。有研究發(fā)現(xiàn)ERF-VIIs亞家族的2個(gè)成員AcERF75和AcERF1直接調(diào)控乙醇脫氫酶AcADH74的表達(dá)［20］。然而關(guān)于MYB參與水淹脅迫響應(yīng)的研究較少。

本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)從美味獼猴桃中篩選鑒定出了64個(gè)AcMYB家族成員。通過生物信息學(xué)分析，明確了64個(gè)AcMYB基因家族成員的基本信息，包括保守結(jié)構(gòu)域、蛋白理化特性等，并初步獲得了參與水淹脅迫響應(yīng)的成員，為進(jìn)一步研究這些響應(yīng)基因的功能奠定了基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的深度、拼接效果等諸多原因可能會(huì)導(dǎo)致MYB家族成員鑒定的缺失，其準(zhǔn)確性還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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