摘 要：為探討何首烏飲介導基因表觀遺傳（DNA甲基化）的改變對大鼠睪丸間質細胞（Leydig）分泌睪酮的影響，選用12、18月齡 Wistar雄性大鼠睪丸組織，甲基化芯片篩選出受何首烏飲調控并與精子發(fā)生功能密切的基因AXL、Ttc29、wnt2b、MAPK10、C-myb，甲基化特異性PCR（MSP）與實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術檢測基因甲基化水平及mRNA表達水平；BrdU熒光染色觀察細胞增殖情況；慢病毒轉染敲低Leydig細胞DNMT1，分析wnt2b、C-myb甲基化程度和睪酮分泌水平是否受DNMT1影響.結果顯示：何首烏飲可調控衰老大鼠睪丸組織中關鍵基因DNA甲基化和mRNA水平，促進細胞增殖和睪酮分泌；敲低Leydig細胞DNMT1后，細胞分泌睪酮水平降低，同時wnt2b和C-myb DNA甲基化水平也明顯下降.這表明何首烏飲可能介導基因DNA甲基化程度促進大鼠Leydig細胞分泌睪酮，進而提高生精功能.

關鍵詞：何首烏飲；睪丸組織；DNA甲基化；睪酮

中圖分類號：

Q291"" 文獻標志碼：

A"" 文章編號：

1000-1565（2024）03-0301-11

Heshouwuyin mediates DNMT1 to regulate DNA methylation to promote rat Leydig cell function

SHI Bingye1，2， LIU Xinru2， WU Tian2， YANG Yujiao2， ZHEN Xiaolan3， NIU Siyun2

（1. Department of Ultrasound Diagnosis， Afiliated Hospital of Hebei University，Baoding 071000， China;2. School of Basic Medical Sciences， Hebei University， Baoding 071000， China;

3. In Vitro Diagnostic Reagent Room， Hebei Pharmaceutical and Medical Device Inspection and Research Institute， Shijiazhuang 050000， China）

Abstract：" To investigate the effect of Heshouwuyin-mediated gene epigenetic （DNA methylation） changes on testosterone secretion in rat Leydig cells， the testicular tissues of 12-month-old and 18-month-old Wistar male rats were selected. The genes AXL，" Ttc29， wnt2b， MAPK10 and C-myb regulated by Heshouwuyin and closely related to spermatogenesis were screened by methylation chip. MSP and RT-qPCR were used to detect gene methylation level and mRNA expression level. BrdU fluorescence staining

was used to observe cell proliferation. DNMT1 was knocked down by lentivirus transfection in Leydig cells， and the effects of DNMT1 on wnt2b and C-myb methylation and testosterone secretion were analyzed. The results showed that Heshouwuyin could regulate the DNA methylation and mRNA levels of key genes in testicular tissue of aging rats， and promote cell proliferation and testosterone secretion. After knocking down DNMT1 in Leydig cells， the level of testosterone secretion was decreased， and the levels of wnt2b and C-myb DNA methylation were also significantly decreased， indicating that Heshouwuyin may improve the ability of rat testicular cells to secrete testosterone by regulating the level of gene DNA methylation， thereby improving the spermatogenic function.

Key words： Heshouwuyin; testicular tissue; DNA methylation; testosterone

增齡過程中男性性腺軸激素分泌水平下調，使精子質量顯著下降［1］.睪酮是重要的男性性激素，由睪丸間質細胞（Leydig）分泌，體內睪酮水平的下降與多種老年疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關.目前，晚婚晚育成為普遍的社會現(xiàn)象，晚育直接或間接地影響男性生育力.輔助生殖技術（ART）是目前改善不孕不育的有效手段，但中國ART市場總體仍供不應求［2］，且近年來接受ART

治療患者年齡分布向高齡偏移，男方精子質量的下降成為影響ART結果的重要因素［3］.目前常使用睪酮替代療法治療男性衰老過程中的相關疾病，但副作用會超過其潛在的健康益處［4］，而補腎中藥對不育不孕和延緩衰老有獨到作用［5］，但其生物學物質基礎及其作用機制尚未被闡明.

本課題組研究證實，補腎中藥何首烏飲可提高老齡大鼠血清睪酮水平、精子密度和精子活力［6-7］，文獻［11］研究證實DNA甲基化與精子發(fā)生、衰老密切相關.本課題組通過基因芯片篩查發(fā)現(xiàn)，老齡大鼠睪丸組織中有912個基因受何首烏飲調控，其中包含大量與睪丸發(fā)育、精子發(fā)生和機體衰老密切相關的DNA甲基化調控基因.基于此，本實驗進一步探討何首烏飲改善睪丸生殖功能的DNA甲基化機制，為補腎類中藥防治衰老及提高男性生殖功能的作用機制提供可靠的實驗數(shù)據(jù).

1 材料和方法

1.1 實驗動物及藥物制備

選用SPF級雄性Wistar大鼠30只（350～390 g），實驗動物使用許可證號碼為SCXK（京）2016-0006，由河北醫(yī)科大學動物實驗中心提供.

何首烏飲由制首烏、淫羊藿、丹參、懷牛膝、茯苓和肉蓯蓉以3∶2∶5∶2∶3∶2的質量比組成.本實驗使用廣東一方有限公司生產(chǎn)的中藥顆粒，由單味中藥飲片按傳統(tǒng)標準炮制后經(jīng)提取濃縮制成，成分與中藥飲片一致.顆粒與中藥飲片的物質的量比為制首烏1∶9.1，淫羊藿1∶20，丹參1∶5.6，懷牛膝1∶4，茯苓1∶20，肉蓯蓉1∶20.

何首烏飲大鼠灌胃量：依據(jù)大鼠和人給藥換算比例，結合前期研究結果，中劑量的何首烏飲對大鼠的最佳給藥量為0.048 g/g［9］.根據(jù)廣東一方有限公司生產(chǎn)的配方顆粒的生藥飲片與顆粒物質的量比換算，大鼠給藥量（顆粒）為7.3 mg/g，生理鹽水溶解顆粒后，灌胃質量濃度為0.9 g/mL.

含藥血清制備：雄性Wistar大鼠，何首烏飲組灌胃何首烏飲（空白組為同體積生理鹽水），2次/d，相同時間進行，連續(xù)灌胃7 d，第7天給藥1 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉溶液（0.05 mg/g）麻醉內眥取血，離心取血清，-80 ℃保存.

1.2 主要試劑與儀器

鼠源BrdU單克隆抗體（美國Sigma公司）;PrimeScript RT reagent Kit with Gdna Eraser（日本TaKaRa公司）;TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒（日本TaKaRa公司）;TRIzol Reagent試劑盒（美國Ambion公司）;基因組DNA快速提取Kit（山東艾德森生物科技股份公司）;安捷倫Mx 3000P熒光定量PCR儀（美國AgiLent technoLogies公司）;全波長酶標儀（美國BioTek Epoch公司）.

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組和取材

SPF級Wistar雄性大鼠12月齡30只，正常飲食、飲水，動物房溫度控制在（22±0.2） ℃.動物使用均按照中華人民共和國國家科學技術委員會頒布的《中國實驗動物管理條例》進行，適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗.

實驗動物隨機分為3組：1）青年組（YG）；2）老齡組（NAG）；3）何首烏飲組（SWYG）；每組10只.YG組于12月齡取材，SWYG組和NAG組于12月齡分別灌胃何首烏飲（顆粒）7.3 mg/g和等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)60 d，于18月齡取材.BrdU（50 μg/g，Solarbio，China）注射，每4 h注射1次，共3次，最后1次注射4 h后取材.腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉，左側睪丸放入40 g/L的多聚甲醛固定液中，4 ℃過夜，常規(guī)制備石蠟切片，右側睪丸立即投入液氮中，-80 ℃保存待用.

1.3.2 細胞培養(yǎng)和衰老模型構建

選用17～21 d的幼年雄性Wistar大鼠，分離、培養(yǎng)原代Leydig細胞.細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)10%的胎牛血清（Biological Industries）、100 U/mL青鏈霉素的Gibcos DMEM/F12完全培養(yǎng)基.細胞置于培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃，體積分數(shù)5%的CO2培養(yǎng)箱內，第3天細胞融合度為80%左右時進行傳代，傳代后培養(yǎng)3 d，繼續(xù)傳至第3代，培養(yǎng)2 d，將其分為正常對照組（NCG）、衰老模型組（AG）與何首烏飲組（HSWY），待用.采用自由基氧化損傷刺激構建Leydig細胞衰老模型［10］：傳至第3代的Leydig細胞培養(yǎng)2 d后，給予AG與HSWY組細胞300 μmol/L H2O2（2 μL）以及100 μmol/L FeSO4（1 μL）進行刺激，NCG組給與同等體積PBS溶液，作用2 h，每天同一時間進行，連續(xù)4 d，更換新鮮的培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)3 d；之后HSWY組細胞在體積分數(shù)5%胎牛血清＋體積分數(shù)10%含藥血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d，其余組細胞在體積分數(shù)5%的胎牛血清＋體積分數(shù)10%的大鼠空白血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d.

1.3.3 DNA甲基化芯片檢測

各組取睪丸組織提取基因組DNA（gDNA），首次回收并標記（NimbleGen Dual-Color DNA Labeling Kit， Roche，Switzerland）MeDIP DNA，二次回收標記的DNA和芯片（上?？党缮锛夹g有限公司）在42 ℃下雜交16 ～20 h，雜交完成后清洗芯片.對芯片數(shù)據(jù)進行中值標準化、quantile標準化和線性平滑處理.標準化后的log2-ratio數(shù)據(jù)用于尋找差異甲基化峰，

從中選取5個與睪丸精子發(fā)育有密切關系的受何首烏飲差異表達基因AXL、Ttc29、wnt2b、MAPK10、C-myb，通過甲基化特異性PCR（MSP）與實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術檢測基因甲基化水平及mRNA表達水平.

1.3.4 甲基化特異性PCR（MSP）

采用DNA提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA kit，天根公司，中國）提取基因組DNA，采用轉化試劑盒（ZYMO EZ DNA Methylation-Gold kit，ZYMO RESEARCH，美國）進行DNA亞硫酸鹽轉化，利用Methprimer在線軟件（http：//www.urogene.org）對挑選的目的基因進行引物設計（表1），確定合適的引物，由Invitrogen公司合成設計引物.然后采用MSP甲基化試劑盒（ZymoTaq PreMix kit，ZYMO RESEARCH，美國）試劑盒以亞硫酸鹽轉化的DNA為模板進行MSP實驗.根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結果，分析啟動子區(qū)CpG島甲基化情況，并對結果進行半定量分析：Image J軟件測量各核酸條帶光密度值，計算各基因啟動子區(qū)DNA甲基化程度，即

甲基化百分比=DNA甲基化核酸光密度值/（未DNA甲基化核酸光密度值+DNA甲基化核酸光密度值）×100%.

1.3.5 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）

睪丸組織和Leydig細胞中的總RNA使用TRIZOL法進行提取，提取完成后的RNA利用酶標儀進行檢測.通過普通PCR儀反轉錄成cDNA，SYBR作為熒光染料進行RT-qPCR檢測，各組均以β-actin為內參，引物設計見表2. 2-△△Ct計算方法對各組Ct值進行計算后，使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析.

1.3.6 慢病毒轉染敲低Leydig細胞DNMT1基因

將傳至第3代的Leydig細胞培養(yǎng)2 d后，PBS清洗1遍，6孔板各孔均加入1 mL 5 μg/mL的Polybrene液，同時加入pSicoR-DNMT1慢病毒（中國吉瑪基因公司）懸液（滴度為7×108 TU/mL），通過熒光顯微鏡觀察細胞中綠色熒光的強度和位置，計算最佳作用時長和轉染效率.DNMT1敲低組（DNMT1-sh-RNA）、陰性對照組（nc）和DNMT1敲低+HSWY組（DNMT1-shRNA+HSWY）均在第3天加入30 μL慢病毒懸液，其中陰性對照組或正常組分別加入30 μL 陰性質粒病毒或PBS，作用8 h.正常組、DNMT1敲低組和陰性對照組在體積分數(shù)5%、10%胎牛血清和空白血清混合培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)7 d，DNMT1敲低+HSWY組在體積分數(shù)5%的胎牛血清＋體積分數(shù)10%的大鼠含藥血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d.

1.3.7 β-半乳糖苷酶染色

采用β-半乳糖苷酶染色鑒定細胞衰老狀態(tài).每組隨機選取3只大鼠睪丸組織，沿睪丸組織橫軸正中位置進行連續(xù)切片，厚4 μm.切片梯度酒精水化.采用β-半乳糖苷酶染色試劑盒（碧云天生物技術有限公司）對切片進行染色，陽性產(chǎn)物呈藍色，定位于間質細胞細胞質.每只大鼠選用相近的部位染色觀察，每張切片隨機選取10個視野，計算每個視野內β-半乳糖苷酶陽性細胞率.

1.3.8 睪酮含量測定

使用ELISA檢測試劑盒（Cayman，美國）分別檢測各組大鼠血清和Leydig細胞培養(yǎng)液的上清液睪酮含量（嚴格按試劑盒說明操作）.

1.3.9 免疫組化與熒光染色

每組隨機選取3只大鼠睪丸組織，沿睪丸組織橫軸正中位置進行連續(xù)切片，厚4 μm.切片梯度酒精水化，熱抗原修復，H2O2封閉.

DNMT1一抗（1∶1 000，abways，兔源）4 ℃孵育過夜.采用SP兩步法試劑盒（中杉金橋）以及DAB顯色（中杉金橋）；陰性對照加入不含抗體的一抗稀釋液.每只大鼠選用相近的部位染色觀察，隨機選擇10個視野，顯微鏡拍照（Nikon），利用Image J軟件的IHC Profiler插件進行統(tǒng)計分析，按照不同的染色強度等級進行評分，每個視野內的強陽性：3分，陽性：2分，弱陽性：1分，陰性：0分.每個視野的得分指數(shù)為各等級細胞所占的百分比×相應評分.IHC得分為各組中所有視野得分指數(shù)的平均值.

BrdU一抗（1∶100，Abcam）4 ℃孵育過夜.熒光二抗（1∶1 000）室溫孵育后DAPI染色（避光）.熒光顯微鏡下觀察拍照，每只大鼠選用相近的部位染色觀察，每張切片隨機選取10個視野，計算每個視野內BrdU陽性細胞數(shù).

1.3.10 統(tǒng)計分析

通過SPSS軟件（22.0版本）對文中所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和差異分析.最終結果使用均值±標準差（SDS）形式，數(shù)據(jù)需要經(jīng)正態(tài)性檢驗，保證數(shù)據(jù)能夠滿足正態(tài)分布密度曲線后進行比較，采用單因素方差分析或獨立樣本T檢驗，若方差齊用LSD法，不齊則用Dunnett’s T3法.檢驗水準α=0.05.

2 結果

2.1 血清睪酮測定結果

為驗證衰老與生精功能間的關系，檢測各組大鼠血清睪酮水平.

結果表明，與青年組（YG）相比，老齡組（NAG）血清睪酮水平明顯下降（Plt;0.05），何首烏飲可顯著提高老齡大鼠血清睪酮水平（Plt;0.05）（圖1）.

2.2 睪丸組織β-半乳糖苷酶染色結果

在細胞衰老進程中β-半乳糖苷酶活性增加，β-半乳糖苷酶染色是目前公認的衰老染色金標準之一.結果（圖2）顯示，β-半乳糖苷酶陽性細胞呈藍綠色，主要定位于間質細胞細胞質中.隨著增齡大鼠睪丸組織β-半乳糖苷酶活性明顯增高，NAG組明顯高于YG組（Plt;0.05）；何首烏飲干預后β-半乳糖苷酶表達明顯低于NAG組（P lt;0.05）.

2.3 睪丸組織BrdU熒光染色結果

熒光染色結果（圖3）顯示，BrdU陽性產(chǎn)物位于細胞核中，呈散點或紅色斑塊狀，各組中BrdU陽性細胞均位于精原小管基底膜附近的精原細胞中，核DAPI顏色為藍色.統(tǒng)計分析表明，與YG組相比，NAG組睪丸組織中Brdu陽性細胞數(shù)量顯著減少（Plt;0.05），而給予何首烏飲作用后陽性細胞數(shù)明顯增加（Plt;0.05）.

2.4 睪丸組織DNMT1免疫組化結果

DNMT1陽性產(chǎn)物定位于睪丸細胞核和細胞質中.蛋白表達顯示棕黃色，在生精小管內的精原細胞、精母細胞以及小管間的間質細胞內表達（圖4）.NAG組DNMT1表達量明顯低于YG組（Plt;0.05）；何首烏飲干預后DNMT1表達量明顯高于NAG組（Plt;0.05）.

2.5 甲基化芯片篩選結果

采用甲基化芯片分析了YG組、NAG組以及SWYG組大鼠睪丸組織中15 987個基因的啟動子（圖5a～c），篩選出NAG組與YG組差異甲基化基因1 728個，其中受何首烏飲調控的差異甲基化基因共有238個（圖5d～e），其中：NAG組中有552個基因啟動子的甲基化程度降低，何首烏飲干預后可使103個基因甲基化水平上調；NAG組有1 176個基因啟動子的甲基化程度升高，而何首烏飲用藥后，使其中135個基因的甲基化水平出現(xiàn)下降.通過GO分析，何首烏飲調控的差異甲基化基因群體涉及701個生物學過程，54個細胞組分和76個分子功能.主要包括生物調節(jié)過程、代謝過程、大分子代謝過程等生物學過程（圖5f）.何首烏飲調控的差異甲基化基因主要涉及細胞內組分、細胞器組分、細胞核組分及胞漿組分等（圖5g）和金屬離子結合、蛋白質結合、核酸結合等分子功能（圖5h）.受何首烏飲調控的238個基因分布在23條信號通路上，這些信號通路與代謝、腫瘤、疾病、細胞增殖和凋亡、細胞黏附、性腺發(fā)育、炎癥、基因轉錄等有關，從中選取5個與睪丸精子發(fā)育有密切關系的受何首烏飲調控的差異表達基因AXL、Ttc29、wnt2b、MAPK10、C-myb，通過MSP與qRT-PCR技術檢測基因甲基化水平及mRNA表達水平.

2.6 差異基因甲基化水平及mRNA表達水平

采用MSP檢測基因在各組睪丸組織的甲基化水平（圖6a），半定量分析（圖6b）表明，與YG組相比，NAG組AXL、Wnt2b及MAPK10啟動子區(qū)甲基化水平均顯著下降（Plt;0.05），而Ttc29、C-myb啟動子區(qū)甲基化水平均顯著升高（Plt;0.05），何首烏飲作用后可提高AXL、Wnt2b及MAPK10的甲基化水平并降低Ttc29、C-myb的甲基化水平.RT-qPCR檢測結果（圖6c）顯示，與YG組相比，NAG組AXL、Ttc29、C-myb的mRNA表達水平明顯降低（Plt;0.05）；而wnt2b及MAPK10的mRNA表達水平明顯升高（Plt;0.05），何首烏飲作用后可提高AXL、Ttc29、C-myb的mRNA表達水平及降低wnt2b及MAPK10的mRNA表達水平；YG組與SWYG組之間無顯著性差異（Pgt;0.05）.對基因甲基化程度及mRNA表達水平進行相關性分析（表3），結果顯示：AXL和Ttc29的甲基化程度和mRNA表達水平的相關系數(shù)無統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；而Wnt2b、MAPK10、C-myb的甲基化程度和mRNA表達水平呈高度的負相關（Plt;0.05）.

2.7 Leydig細胞C-myb及wnt2b甲基化水平

為驗證何首烏飲是否介導DNMT1改善衰老Leydig細胞DNA甲基化和睪酮分泌，采用慢病毒轉染敲低Leydig細胞DNMT1，熒光拍照、RT-qPCR及WB結果發(fā)現(xiàn)，30 μL病毒懸液與Leydig細胞作用8 h，轉染敲低效率最高（圖7）.選取C-myb及wnt2b基因檢測其在Leydig細胞中的甲基化程度.實驗結果（圖8）表明，與正常對照組相比，衰老模型組wnt2b與C-myb甲基化水平均顯著降低（Plt;0.05），何首烏飲顯著提高wnt2b與C-myb甲基化水平，與衰老模型組相比有顯著性差異（Plt;0.05）.與正常對照組相比，DNMT1敲低組wnt2b與C-myb DNA甲基化程度均明顯下調（Plt;0.05），DNMT1敲低＋HSWY組wnt2b與C-myb甲基化水平顯著升高，與DNMT1敲低組相比有顯著性差異（Plt;0.05），陰性對照組與正常對照組無統(tǒng)計學差異（Pgt;0.05）.

2.8 Leydig細胞培養(yǎng)液睪酮質量濃度檢測結果

為驗證DNMT1對生精功能的作用，檢測了DNMT1敲低及何首烏飲干預對Leydig細胞睪酮生成的影響，結果（圖9）表明，與正常對照組相比，衰老模型組和DNMT1敲低組細胞培養(yǎng)液中睪酮水平均顯著降低（Plt;0.05），何首烏飲可部分改善細胞衰老模型及DNMT1敲低導致的睪酮水平下降（與衰老模型組和DNMT1敲低組相比Plt;0.05）.

3 討論

隨著年齡的增長，男性生殖系統(tǒng)的結構和功能退化，出現(xiàn)睪酮水平降低、睪丸體積減少、精子密度和活力降低，精子發(fā)生能力減弱以及精子染色體異常等現(xiàn)象.文獻［11］已證明男性衰老之后血睪屏障發(fā)生異常，睪丸支持細胞數(shù)量減少，生精細胞增殖和凋亡的穩(wěn)態(tài)受到干擾，進而導致男性生殖功能的下降.目前針對男性生殖衰老尚無有效的治療策略.大量研究表明中藥在延緩衰老過程中發(fā)揮重要作用，何首烏飲是中醫(yī)臨床中常用的補腎類方劑，由制首烏、淫羊藿、茯苓、丹參、懷牛膝和肉蓯蓉組成，具有充髓生精、延年黑發(fā)等作用，臨床用于“腎精虧虛”致不孕不育和衰老等，其組方精當，療效卓著.前期研究證明何首烏飲能改善衰老大鼠血清睪酮水平、精子密度、精子活力和生育能力，還可以調節(jié)衰老大鼠睪丸組織中與精子發(fā)生和衰老相關的表觀遺傳基因的表達［6，9-10］.

個體的衰老進程與哺乳動物體內的DNA甲基化變化密切相關，當個體處于胚胎期時，體內的5-甲基胞嘧啶（5-Methylcytosine）水平達到頂點，隨著年齡的增長其水平逐漸下降［12］.為了探究基因DNA甲基化程度與衰老大鼠睪丸生殖功能關系，本實驗以大鼠睪丸組織為材料，通過DNA甲基化測序，發(fā)現(xiàn)自然衰老組大鼠睪丸組織中有1 728個基因DNA甲基化水平發(fā)生改變，其中，552個基因DNA甲基化程度下降，1 176個基因DNA甲基化程度上升，而何首烏飲可直接調控238個基因的甲基化水平，且大量基因與睪丸的生精功能及衰老相關，如AXL、Ttc29、wnt2b、MAPK10、C-myb對睪丸的生精功能有重要調控作用.因此，推測何首烏飲可通過介導關鍵基因的DNA甲基化水平和表達水平延緩睪丸組織衰老過程.

AXL（anexelekto）是受體酪氨酸激酶家族TAM受體的成員之一，它與Mer和Tyro3一起形成TAM受體，于成年小鼠睪丸組織的巨噬細胞和樹突狀細胞中高表達，在維持睪丸組織穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用.GAS6是TAM受體的共同配體，在小鼠睪丸組織中可介導暴露在凋亡細胞表面的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）與巨噬細胞的TAM受體形成AXL-GAS6-PS復合物，促進巨噬細胞對細胞凋亡的吞噬作用，有利于維持睪丸組織的免疫穩(wěn)態(tài)，為精子發(fā)生提供穩(wěn)定的內環(huán)境［13］.本研究發(fā)現(xiàn)，衰老大鼠睪丸組織AXL啟動子甲基化水平及mRNA表達水平下降，給予何首烏飲后能提高AXL的啟動子甲基化水平及mRNA表達水平，從而提高了精子發(fā)生的內環(huán)境穩(wěn)定性.Wnt家族是一種睪丸組織原癌基因，在胚胎發(fā)育、組織干細胞更新、分化過程中起關鍵調控作用，促進睪丸組織的發(fā)育［14］.睪丸組織啟動減數(shù)分裂時，經(jīng)典的Wnt信號傳導激活，進而粗促進未分化的精原細胞更新［15］，而過量的wnt2b會抑制細胞增殖和分化并導致組織的畸形生長［16］.本研究發(fā)現(xiàn)，衰老大鼠睪丸組織及Leydig細胞的wnt2b啟動子甲基化水平下降而mRNA表達水平增高，何首烏飲作用后可能通過提高其DNA甲基化水平和表達水平促進細胞周期和分化，促進精子發(fā)生.MAPK10（JNK3）是JNK家族的重要成員，它通過激活c-jun/AP1來促進細胞凋亡蛋白的表達，同時又可以激活p53，從而導致p53依賴的細胞發(fā)生凋亡.前期研究［17］已證明何首烏飲可以使衰老大鼠睪丸組織中p53蛋白的表達下調，抑制睪丸組織細胞的凋亡.本實驗發(fā)現(xiàn)衰老大鼠睪丸組織MAPK10啟動子甲基化水平降低，mRNA表達水平增高，何首烏飲作用后可提高大鼠睪丸組織MAPK10的啟動子甲基化水平，降低mRNA表達水平，從而抑制細胞凋亡，促進精子的發(fā)生.C-myb是一種在睪丸組織中高度表達的原癌基因，對睪丸組織的功能有調節(jié)作用.研究［18］表明C-myb可調控支持細胞功能，促進生精微環(huán)境穩(wěn)定.另外，C-myb還可以促進在體外培養(yǎng)的大鼠Leydig細胞分泌睪酮［19］.且前期基礎研究［20］已證明何首烏飲可提高衰老大鼠的血清睪酮含量.本研究發(fā)現(xiàn)與青年對照組相比，NAG組大鼠睪丸組織C-myb的啟動子甲基化水平增高，mRNA表達水平降低，給予何首烏飲后提高mRNA的表達水平，可能與何首烏飲促進Leydig細胞分泌睪酮，提高精子質量有關.Ttc29是一種在睪丸組織階段特異性表達的基因，主要在成熟大鼠睪丸組織的粗線期精母細胞中表達，在減數(shù)分裂及精母細胞向精子細胞的轉化中發(fā)揮重要作用.由Ttc29編碼的動力蛋白可以與其他功能蛋白結合，促進正常的精子發(fā)生過程［21］.本研究發(fā)現(xiàn)，衰老大鼠睪丸組織Ttc29的啟動子甲基化水平增高，mRNA的表達水平降低，何首烏飲作用后提高mRNA的表達水平，從而影響睪丸生精微環(huán)境，促進生精進程.上述實驗證明幾個與生精功能密切相關的基因可在何首烏飲的作用下調控其DNA甲基化和表達水平從而調節(jié)精子發(fā)生，進而調控生精過程.

細胞分裂標記物BrdU是一類胸腺嘧啶核苷類似物，細胞有絲分裂時可代替胸腺嘧啶（T）參與DNA分子的復制，可通過Apollo熒光染料檢測，反映細胞增殖率.統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，何首烏飲使衰老大鼠睪丸組織精原細胞BrdU陽性數(shù)明顯增多，說明何首烏飲能促進衰老大鼠睪丸組織精原細胞的DNA復制.

睪酮由Leydig細胞分泌，可促進男性性腺發(fā)育并調控精子發(fā)生，對男性的生長發(fā)育繁殖起著重要作用，但體內睪酮含量會隨年齡的增長而減低.衰老導致的Leydig細胞功能退化是體內睪酮含量降低的主要原因［22］.DNMT1是維持整個基因甲基化模式的主要酶類，且在多種細胞中調控衰老進程的發(fā)生［23-24］.為了探究DNMT1與Leydig細胞衰老及基因DNA甲基化水平的關系，采用DNMT1低表達慢病毒載體，MSP技術檢測了Leydig細胞敲低DNMT1基因后wnt2b和C-myb的甲基化程度.結果發(fā)現(xiàn)，DNMT1敲低后leydig細胞中wnt2b和C-myb DNA甲基化水平降低，變化趨勢與自然衰老組一致.該研究表明DNMT1通過調節(jié)wnt2b和C-myb DNA甲基化水平，進而影響Leydig細胞的功能.

綜上所述，何首烏飲可能通過調控表觀遺傳基因DNA甲基化和表達水平提高大鼠睪丸組織增殖能力，具體機制有待進一步研究.

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（責任編輯：趙藏賞）

收稿日期：2023-08-11；修回日期：2023-11-10

基金項目：

國家自然科學基金資助項目（81673714）;河北省重點研發(fā)計劃項目-中醫(yī)藥創(chuàng)新專項（223777134D）;河北省高等學?？茖W技術研究項目（ZD2022060）;河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃項目（2022115）

第一作者：石炳燁（1983—），男，河北大學附屬醫(yī)院主治醫(yī)師，河北大學在讀碩士研究生，主要從事男性生殖衰老研究.E-mail：2435231348@qq.com

通信作者：牛嗣云（1967—），女，滿族，河北大學教授，博士，博士生導師，主要從事生殖衰老方向研究.

E-mail：nsy1688@163.com

甄曉蘭（1976—），女，河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院副主任藥師，主要從事生殖衰老方向研究.E-mail：zhenxlan2007@163.com