苦瓜皂苷L調控PI3K/AKT通路促進內皮祖細胞增殖能力和內皮功能的實驗研究

黃建明 劉滴 金道群 朱定君

摘要 目的： 探討苦瓜皂苷L對內皮祖細胞（EPC）增殖能力和內皮功能的作用及機制。 方法： 體外分離、培養(yǎng)、鑒定外周血EPC。使用不同濃度苦瓜皂苷L處理EPC 24 h后，應用細胞計數試劑盒（CCK.8）法檢測各組細胞活力。使用AutoDock Tools 5.6軟件，分別以磷脂酰肌醇3.激酶（PI3K）和蛋白激酶B（AKT）為受體， 以藥物分子苦瓜皂苷L為配體采用盲對接法進行分子對接。使用PI3K/AKT 抑制劑LY294002和最佳使用濃度的苦瓜皂苷L單獨或同時處理EPC 24 h后檢測各組細胞活力和磷酸化PI3K（p.PI3K）、磷酸化AKT（p.AKT）及磷酸化內皮型一氧化氮合酶（p.eNOS）表達水平。 結果： 與對照組比較，苦瓜皂苷L呈劑量依賴性地促進EPC增殖，且40 μmol/L的苦瓜皂苷L是最佳藥物濃度。與對照組比較，LY294002可下調EPC細胞活力，苦瓜皂苷L可上調細胞活力。與苦瓜皂苷L組比較，共同使用苦瓜皂苷L和LY294002可降低細胞活力。分子對接結果顯示，苦瓜皂苷L與PI3K和AKT均存在直接作用，形成穩(wěn)定的鎖鑰結構。與對照組比較，LY294002可顯著下調p.PI3K、p.AKT和 p.eNOS蛋白水平；苦瓜皂苷L可上調p.PI3K、 p.AKT和p.eNOS蛋白水平。與苦瓜皂苷L組比較，使用苦瓜皂苷L和LY294002可降低p.PI3K、p.AKT和p.eNOS蛋白水平。 結論： 苦瓜皂苷L通過PI3K/AKT信號通路靶向調節(jié)EPC的增殖能力，進而上調內皮型一氧化氮合酶（eNOS）活化水平以促進EPC內皮功能。

關鍵詞 ?內皮祖細胞；苦瓜皂苷L；細胞增殖；內皮功能；實驗研究

doi： ?10.12102/j.issn.1672.1349.2024.10.006

Experimental Study on the Regulation of PI3K/AKT Pathway by Momordicoside L ?Promoting Endothelial Progenitor Cell Proliferation and Endothelial Function

HUANG Jianming， LIU Di， JIN Daoqun， ZHU Dingjun

Huangshi Central Hospital， Affiliated Hospital of Hubei Polytechnic University， Huangshi 435000， Hubei， China

Corresponding Author ?ZHU Dingjun， E.mail： djzhu2005@163.com

Abstract Objective： To explore the effect of Momordicoside L on endothelial progenitor cells（EPC） proliferation and endothelial function and its mechanism. ?Methods： Peripheral blood EPCs were isolated，cultured，and identified in vitro.After EPC was treated with different concentrations of Momordicoside L for 24 h，cell viability was detected by cell count（CCK.8）.By AutoDock Tools 5.6 software，the molecular docking was performed by blind docking method with phosphatidylinositol 3.kinase（PI3K） and protein kinase B（AKT） as receptors，and the drug molecule Momordicoside L as ligand.The cell viability and the expressions of phosphorylated PI3K（p.PI3K），phosphorylated AKT（p.AKT） and phosphorylated endothelial nitric oxide synthase（p.eNOS） in each group were detected，when EPC was treated with PI3K/AKT inhibitor LY294002 and the optimal concentration of Momordicoside L alone or simultaneously for 24 h. ?Results： Compared with control group，Momordicoside L could promote EPC proliferation in a dose.dependent manner，and 40 μmol/L was the optimal concentration.Compared with the control group，LY294002 could down.regulate EPC cell viability，and Momordicoside L could up.regulate EPC cell viability.Compared with Momordicoside L group，the co.administration of Momordicoside L and LY294002 decreased cell viability.Molecular docking results showed that Momordicoside L had direct interaction with PI3K and AKT，and could form a stable lock key structure.Compared with the control group，LY294002 significantly down.regulated the protein levels of p.PI3K，p.AKT and p.eNOS.Momordicoside L up.regulated the protein levels of p.PI3K，p.AKT and p.eNOS. Compared with the Momordicoside L ?group，the administration of Momordicoside L and LY294002 decreased the protein levels of p.PI3K，p.AKT and p.eNOS. ?Conclusion： Momordicoside L could regulate the proliferation ability of EPC through the PI3K/AKT signaling pathway，and then up.regulate the activation level of endothelial nitric oxide synthase（eNOS） to promote endothelial function of EPC.

Keywords ?endothelial progenitor cells; Momordicoside L; cell proliferation; endothelial function; experimental study

內皮祖細胞（endothelial progenitor cell，EPC）是 起源于骨髓的多能干細胞，可定向分化為內皮細胞，參與血管生成和損傷修復 ?［1］ 。已證實在糖尿病、高血壓、冠心病等慢性疾病中EPC水平下降，且功能受損 ?［2.4］ 。Schmidt.Lucke等 ?［5］ 研究顯示，與穩(wěn)定性冠心病病人比較，急性冠脈綜合征病人循環(huán)血EPC數量顯著減少，提示心血管急性缺血性事件的發(fā)生可能與EPC的數量呈負相關。本研究團隊前期研究發(fā)現，與絕經前女性組比較，絕經后女性血清雌二醇水平與外周血EPC數量均明顯降低，這可能是女性絕經后心血管病風險升高的危險因素之一 ?［6］ 。目前尚無安全的治療措施顯著升高外周循環(huán)中EPC水平?？喙显碥誏是苦瓜總皂苷的主要活性成分，具有抗炎、降糖、調脂的作用，可能成為預防糖尿病、高血壓及高脂血癥的膳食補劑。有研究顯示，苦瓜皂苷L對細胞增殖、分化、遷移具有較好的作用 ?［7.8］ 。然而，苦瓜皂苷L對EPC增殖能力的影響研究較少。本研究結合生物信息學、細胞生物學及分子生物學綜合探討苦瓜皂苷L對EPC增殖能力和內皮功能的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

苦瓜皂苷L（T10N8Z47950）購自上海源葉生物科技有限公司；內皮細胞培養(yǎng)基（ECM，中喬新舟公司）；人纖維連接蛋白（Millipore Chemicon公司）；Dil標記的乙?；兔芏戎鞍祝╝c.LDL.Dil，Sigma公司）；圖譜FITC標記的荊豆凝集素Ⅰ（FITC.UEA.Ⅰ，Sigma公司）；細胞計數試劑盒8（CCK.8，Dojindo公司）；二甲基亞砜（DMSO，碧云天公司）；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS.PAGE）試劑盒（塞維爾公司）；磷酸化磷脂酰肌醇3.激酶（p.PI3K，#17366）、 磷酸化蛋白激酶B（p.AKT，#4060）、磷酸化內皮型一氧化氮合酶 （p.eNOS）（#9570）均購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 EPC培養(yǎng)及鑒定

本研究團隊前期已從兔 外周血中分離得到EPC，本次實驗繼續(xù)培養(yǎng)EPC并采用FITC.UEA.Ⅰ和ac.LDL.Dil 雙染法鑒定EPC純度 ?［9］ 。使用ac.LDL.Dil（10 μg/mL）于37 ℃下孵育細胞1 h后，使用2%多聚甲醛固定細胞10 min，使用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗3次。加入FITC.UEA.Ⅰ（10 g/mL）于37 ℃孵育1 h后，使用PBS清洗3次以減少假陽性。使用激光共聚焦顯微鏡分別激發(fā)綠色熒光（波長477 nm）和紅色熒光（波長543 mm），并保存照片。

1.3 細胞分組及處理

首先將貼壁的EPC隨機分為6組（對照組及不同濃度的苦瓜皂苷L組），以每孔1×10 4的密度均勻鋪于96孔板上，每組5個復孔。24 h后，分別使用0.1%DMSO和不同濃度的苦瓜皂苷L孵育24 h，檢測苦瓜皂苷L對EPC活力的影響。將貼壁的EPC隨機分為4組，分別以每孔1×10 4和5×10 5的密度均勻鋪于96孔板和6孔板。24 h后，分別使用DMSO（對照組）、磷脂酰肌醇3.激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）抑制劑LY294002（LY294002組）、苦瓜皂苷L（苦瓜皂苷L組）及苦瓜皂苷L＋LY294002（苦瓜皂苷L＋LY294002組）孵育24 h，進行細胞活力檢測和分子學分析。

1.4 增殖能力檢測

使用CCK.8測定細胞增殖能力，操作步驟按照說明書進行。于96孔板細胞孔內每孔勻速加入10 μL CCK.8試劑，于37 ℃、5%CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 h后，使用酶標儀于490 nm波長條件下檢測OD值。

1.5 生物信息學預測

使用AutoDock Tools 5.6軟件工具，分別以PI3K和AKT為受體，以藥物分子苦瓜皂苷L為配體采用盲對接法進行分子對接。根據蛋白活性口袋設置對接盒子坐標和大小，進行分子對接，其他按軟件默認設置，最終得到結合構象文件和結合能，并通過PyMOL 1.8軟件和Ligplot＋1.4對接構象進行可視化分析，得到相應的三維和二維結構圖。

1.6 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測

使用RIPA緩沖液、磷酸酶抑制劑A/B、苯甲基磺酰氟（PMSF）處理細胞30 min后于低溫高速離心機下以14 000 r/min條件離心10 min，取上層澄清液體，測量蛋白濃度。將細胞裂解物于金屬浴鍋內以95 ℃變性10 min后，于－20 ℃冷藏保存。使用SDS.PAGE試劑盒分別配置分離膠及濃縮膠，經上樣、電泳后，使用濕法轉膜將蛋白印跡轉移至硝酸纖維素膜。 將膜浸泡在封閉液內于室溫下封閉1 h后，使用TBST清洗3次。分別使用p.PI3K、p.AKT、p.eNOS一抗以1∶1 000 比例與一抗稀釋液配制成液體，將膜浸泡于相應的抗體液中，于4 ℃條件下搖床內孵育過夜。將已孵育好一抗的膜取出后清洗3次，于室溫下孵育二抗2 h。于避光條件下，使用化學發(fā)光試劑浸潤膜后于顯影儀器下進行顯像。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行數據處理及統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數±標準差（ x ?± s ）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用LSD法分析。以 P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 EPC的染色及鑒定結果

使用ac.LDL.Dil和FITC.UEA.Ⅰ雙染色鑒定分離培養(yǎng)的EPC，詳見圖1。其中綠色熒光代表EPC與凝集素結合，紅色熒光代表EPC攝取ac.LDL.Dil后，橙色熒光為雙染色陽性的EPC，陽性率達95%以上。

2.2 苦瓜皂苷L對EPC細胞增殖能力的影響

苦瓜皂苷L的結構分子式詳見圖2。檢測不同劑量苦瓜皂苷L對EPC細胞活力的影響，結果顯示，苦瓜皂苷L可顯著提高細胞活力，提示細胞增殖或功能顯著上調，且作用呈劑量依賴性，詳見圖3。當苦瓜皂苷L濃度為40 μmol/L時上調細胞活力的效果最佳，因此，選擇該濃度為后續(xù)實驗使用濃度。為探討苦瓜皂苷L發(fā)揮作用的具體機制，進一步使用LY294002作為PI3K/AKT抑制劑，結果顯示，與對照組比較，LY294002處理EPC后可顯著下調細胞活力，苦瓜皂苷L可顯著上調細胞活力。與單獨使用苦瓜皂苷L比較，共同使用苦瓜皂苷L和LY294002可降低苦瓜皂苷L對細胞活力的影響。詳見圖4。結果提示， 苦瓜皂苷L可有效促進EPC活力，其作用可能與PI3K/AKT 信號通路激活有關。

2.3 苦瓜皂苷L與PI3K、AKT的分子對接結果

使用生物信息學技術分析苦瓜皂苷L與PI3K、AKT之間的關系，明確作用靶點?？喙显碥誏與PI3K和AKT均可靶向結合，并形成結構穩(wěn)定的鎖鑰結構，詳見圖5。提示其可靶向作用于PI3K和AKT。

2.4 苦瓜皂苷L對PI3K、AKT、eNOS的表達影響

為進一步明確苦瓜皂苷L對PI3K/AKT信號通路的作用機制，采用Western Blot檢測PI3K、AKT及eNOS的磷酸化活化形式。與對照組比較，LY294002處理可下調p.PI3K、p.AKT 及p.eNOS水平，苦瓜皂苷L 處理可上調p.PI3K、p.AKT及p.eNOS水平。與單獨使用苦瓜皂苷L比較，同時使用苦瓜皂苷L和LY294002處理EPC將降低細胞活力。詳見圖6。上述結果提示，苦瓜皂苷L對EPC活力的影響可能通過PI3K/AKT信號通路發(fā)揮作用。

3 討 論

高血壓、糖尿病、高脂血癥及缺血性心肌病等急慢性疾病早期均導致內皮損傷或功能失調，進而影響臟器功能 ?［10］ 。EPC已證實是內皮修復和血管新生的關鍵因素，升高特定人群的EPC水平可能成為心血管疾病病人的防治措施 ?［11］ 。EPC增殖能力及其功能水平與細胞活力密切相關，促進其增殖水平和細胞功能可顯著減少心血管不良事件的發(fā)生。本研究結果顯示，苦瓜皂苷L可有效促進EPC增殖，通過生物信息學分析發(fā)現苦瓜皂苷L可靶向結合PI3K和AKT，促進兩者的磷酸化，進而激活下游信號分子eNOS活化水平升高。結果提示：苦瓜皂苷L通過PI3K/AKT信號通路靶向調節(jié)EPC的增殖能力并上調eNOS活化水平促進內皮功能。

苦瓜（momordica charantia L.）作為一種草本植物已被食用、藥用近千年，既往中醫(yī)認為其具有祛暑退熱、明目、解毒等功能，現代研究顯示，其具有降糖、降脂、抗炎、抗?jié)兗翱鼓[瘤等多種功效 ?［12.13］ 。隨著對其藥理學的研究發(fā)現，目前已鑒定出苦瓜的生物活性成分包括三萜類化合物、皂苷、多肽、類黃酮及生物堿等 ?［14］ 。苦瓜皂苷L主要存在于苦瓜根莖和果實中，是苦瓜皂苷類主要的葫蘆烷型三萜類化合物。既往研究顯示，苦瓜皂苷L可顯著促進成骨細胞的增殖 能力，提高細胞活性 ?［15］ 。本研究證實了苦瓜皂苷L經PI3K/AKT 信號通路促進EPC的增殖能力，其可上調eNOS水平，進而增強EPC細胞功能?？喙显碥誏可能成為升高EPC水平及功能的治療措施。

PI3K/AKT信號通路已被證實在細胞增殖、遷移、細胞凋亡和血管生成等生理過程中發(fā)揮重要作用 ?［16］ 。PI3K/AKT信號通路在動員和改善EPC的功能中發(fā)揮著重要作用 ?［17］ 。Liu等 ?［18］ 研究顯示，趨化因子受體4無論在常氧還是缺氧/復氧條件下均可促進EPC增殖，并抑制細胞凋亡，上述作用可被PI3K/AKT抑制劑LY294002削弱，提示PI3K/AKT是調控EPC增殖的關鍵信號通路。本研究結果顯示，使用苦瓜皂苷L可上調EPC的細胞活力， 使用LY294002可削弱苦瓜皂苷L 的促增殖作用，提示苦瓜皂苷L的促增殖作用可能依賴PI3K/AKT信號通路；生物信息學分析預測了其具有靶向調節(jié)PI3K和AKT的能力，進一步分子生物學分析證實了其作用依賴于PI3K/AKT信號通路的磷酸化激活。既往研究證明，激活PI3K/AKT信號通路可誘導下游eNOS磷酸化，進而促進EPC的細胞功能 ?［19］ 。eNOS活化后具有調節(jié)EPC功能的作用，可催化L.精氨酸生成一氧化氮，參與調節(jié)血管收縮、舒張等生理作用，還可促進血管生成以應對組織缺血 ?［20］ 。因此，eNOS認為是判斷EPC功能的關鍵指標。同時本研究結果還顯示，LY294002可抑制PI3K/AKT活性，降低eNOS活化水平，苦瓜皂苷L可顯著上調eNOS磷酸化水平，且該作用可被LY294002削弱。

綜上所述，苦瓜皂苷L通過PI3K/AKT信號通路靶向調節(jié)EPC的增殖能力，進而上調eNOS活化水平以促進EPC的內皮功能，這些作用可能對血管損傷修復和血管新生具有重要的臨床意義。

參考文獻：

［1］ ??MUDYANADZO T A. Endothelial progenitor cells and cardiovascular ?correlates［J］.Cureus，2018，10（9）：e3342.

［2］ ?LUO S Y， XIA W H，CHEN C， et al .Endothelial progenitor cells and hypertension：current concepts and future implications［J］.Clinical Science，2016，130（22）：2029.2042.

［3］ ?俞章平， 余晗俏，李俊，等.缺血再灌注對內皮祖細胞功能及iNOS、eNOS的影響［J］.中國醫(yī)師雜志，2018，20（9）：1327.1330.

［4］ ?PEYTER A C， ARMENGAUD J B，GUILLOT E， et al .Endothelial progenitor cells dysfunctions and cardiometabolic disorders：from mechanisms to therapeutic approaches［J］.International Journal of Molecular Sciences，2021，22（13）：6667.

［5］ ?SCHMIDT.LUCKE C， RSSIG L，FICHTLSCHERER S， et al .Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events：proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair［J］.Circulation，2005，111（22）：2981.2987.

［6］ ?朱定君， 陳志強，夏鴻莉，等.未絕經女性與同年齡段男性冠心病患者臨床特點及冠狀動脈病變的對比分析［J］.醫(yī)學研究生學報，2011，24（11）：1182.1184.

［7］ ?PERERA W H， SHIVANAGOUDRA S R，PREZ J L， et al .Anti.inflammatory，antidiabetic properties and in silico modeling of cucurbitane.type triterpene glycosides from fruits of an Indian cultivar of Momordica charantia L［J］.Molecules，2021，26（4）：1038.

［8］ ?LIU Y F， MU S M，CHEN W B， et al .Saponins of Momordica charantia increase insulin secretion in INS.1 pancreatic β.cells via the PI3K/Akt/FoxO1 signaling pathway［J］.Endocrinologia，Diabetes y Nutricion，2021，68（5）：329.337.

［9］ ?朱定君， 石蓓，夏鴻莉，等.兔外周血內皮祖細胞的分離培養(yǎng)、鑒定和體外標記［J］.國際生物醫(yī)學工程雜志，2010，33（4）：224.227.

［10］ ??MEDINA.LEYTE D J， ZEPEDA. GARCKKA O，DOMNGUEZ.PREZ M， ?et al .Endothelial dysfunction，inflammation and coronary artery disease：potential biomarkers and promising therapeutical approaches［J］.International Journal of Molecular Sciences，2021，22（8）：3850.

［11］ ?BIANCONI V， SAHEBKAR A，KOVANEN P， et al .Endothelial and cardiac progenitor cells for cardiovascular repair：a controversial paradigm in cell therapy［J］.Pharmacology & Therapeutics，2018，181：156.168.

［12］ ?劉馨澤， 吳新民，藺冬梅，等.苦瓜化學成分的提取分離及藥理活性研究進展［J］.中成藥，2022，44（1）：177.182.

［13］ ??IEK S S. Momordica charantia L..diabetes.related bioactivities， quality control，and safety considerations［J］.Frontiers in Pharmacology，2022，13：904643.

［14］ ?JIA S， SHEN M Y，ZHANG F， et al .Recent advances in Momordica charantia：functional components and biological activities［J］.International Journal of Molecular Sciences，2017，18（12）：2555.

［15］ ?楊志剛， 沈宗根，張燕萍.苦瓜皂苷對成骨細胞增殖能力和ALP的影響［J］.食品科學，2010，31（23）：383.385.

［16］ ?JAFARI M， GHADAMI E，DADKHAH T， et al .PI3K/AKT signaling pathway：erythropoiesis and beyond［J］.Journal of Cellular Physiology，2019，234（3）：2373.2385.

［17］ ?WU Y H， FU C，LI B， et al .Bradykinin protects human endothelial progenitor cells from high.glucose.induced senescence through B2 receptor.mediated activation of the Akt/eNOS signalling pathway［J］.Journal of Diabetes Research，2021，2021：6626627.

［18］ ?LIU Z Y， YANG Q X，CAO Y， et al .CXCR4 protects bone marrow.derived endothelial progenitor cells against hypoxia through the PI3K/Akt signaling pathway［J］.Experimental and Therapeutic Medicine，2021，22（5）：1200.

［19］ ?WANG M Q， YANG D，HU Z， et al .Extracorporeal cardiac shock waves therapy improves the function of endothelial progenitor cells after hypoxia injury via activating PI3K/Akt/eNOS signal pathway［J］.Frontiers in Cardiovascular Medicine，2021，8：747497.

［20］ ?EVERAERT B R， VAN CRAENENBROECK E M，HOYMANS V Y， et al .Current perspective of pathophysiological and interventional effects on endothelial progenitor cell biology：focus on PI3K/AKT/eNOS pathway［J］.International Journal of Cardiology，2010，144（3）：350.366.

（收稿日期：2023.02.09）

（本文編輯 薛妮）