尿液基細胞熒光原位雜交檢測對膀胱尿路上皮癌的診斷價值

摘要：目的探討尿液基細胞學（LBC）靶向的熒光原位雜交（FISH）對膀胱尿路上皮癌（BUC）的診斷價值。方法回顧性收集2020年10月—2022年10月于首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院泌尿外科行膀胱鏡檢查的128例患者的臨床資料。所有患者在行膀胱鏡檢查前進行尿核基質蛋白22（NMP22）檢測、尿LBC檢測與尿LBC靶向的FISH檢測，以術后病理結果為標準，分析3種檢查方法的靈敏度和特異度。結果NMP22、尿LBC與LBC靶向的FISH的靈敏度分別為61.11%、79.17%、82.46%，特異度分別為57.14%、73.21%、86.67%；NMP22、尿LBC的靈敏度在檢測高級別BUC時優(yōu)于低級別，差異有統(tǒng)計學意義（P=001，P=0.03）；3種方法對肌層浸潤性膀胱癌與非肌層浸潤性膀胱癌檢測的靈敏度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P≥0.05）。結論尿LBC靶向的FISH對BUC診斷的靈敏度和特異度較高，尤其是對于低級別BUC，可以作為BUC早期篩查、診斷的重要方法。

關鍵詞：膀胱尿路上皮癌；熒光原位雜交；尿核基質蛋白22；尿液基細胞學檢測

中圖分類號：R737.14文獻標志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2024.06.007

膀胱尿路上皮癌（bladderurothelialcarcinoma，BUC）是泌尿外科常見的惡性腫瘤之一，指南推薦的診斷“金標準”為膀胱鏡檢查及活檢[1]。膀胱鏡檢查作為一種有創(chuàng)操作，會給患者帶來麻醉風險、手術并發(fā)癥、經濟消耗及軀體痛苦等負擔[2]，因此需要一種臨床上公認，同時安全、方便、有效的無創(chuàng)檢查方式以有效檢測出BUC及其復發(fā)情況，為患者的早期診斷、評估和改善疾病預后提供支持。

目前，臨床中不斷嘗試使用多種無創(chuàng)檢查方法[3]，如熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization，FISH）、膀胱腫瘤抗原（bladdertumorantigen，BTA）、核基質蛋白22（nuclearmatrixprotein22，NMP22）、尿液基細胞學（liquid-basedcytology，LBC）檢測、ImmunoCyt/uCyt+試驗等作為膀胱鏡的輔助檢查[4]，希望在某種程度上代替膀胱鏡，減少患者的痛苦。但是單一的NMP22檢測、尿LBC檢測、FISH技術對BUC的診斷在靈敏度和特異度上存在一定的局限性[5]。本研究將尿LBC檢測和FISH相結合，形成尿LBC靶向的FISH檢測，通過對比NMP22、尿LBC檢測與尿LBC靶向的FISH檢查的靈敏度和特異度，分析尿LBC靶向的FISH對BUC的診斷價值，為臨床提供參考。

1資料與方法

1.1一般資料

回顧性分析2020年10月—2022年10月于首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院泌尿外科行膀胱鏡檢查的128例患者的臨床資料，納入標準：①年齡＞18歲；②因血尿、影像檢查發(fā)現膀胱占位性病變等行膀胱鏡檢查及活檢；③患者意識清晰，診治過程中配合。排除標準：①合并嚴重精神疾病者；②合并自身免疫系統(tǒng)疾病者；③合并心、肺、肝、腎功能不全者；④合并其他系統(tǒng)腫瘤者;⑤臨床資料不全者。

所有研究對象均簽署知情同意書。本研究已通過首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院倫理委員會倫理審查（KY2022-070）。

收集入組患者的一般臨床資料，所有患者在膀胱鏡檢查前1d留取清潔晨尿，進行NMP22、尿LBC檢查、尿LBC靶向的FISH檢查，行膀胱鏡檢查，對活檢組織進行病理檢查。

1.2尿LBC檢測方法

采用上海基恩科技有限公司生產的CellDetect高敏檢測技術配套的細胞染色液（貨號：BLC0050、BLC0100），進行CellDetect染色下的尿LBC檢查。每個患者采集尿樣至少50mL，離心后通過尿LBC技術處理涂抹在載玻片上，按照CellDetect說明書進行染色。非典型細胞的細胞核呈紅色或紫色，胞質呈透明、粉色或綠色，惡性細胞經染色后細胞核為紅色或紫色，偶見細胞質[6]（圖1A）。正常的尿路上皮細胞的細胞核呈藍色、綠色或深紫色，核不濃染，炎癥細胞的細胞核呈紫色，胞質呈紅色（圖1B），可在形態(tài)學上區(qū)分。每個載片由2例細胞學醫(yī)師分別在顯微鏡下進行閱片（如結果出現分歧，則由第3位細胞學醫(yī)師閱片），并將其分類為陰性和陽性，對陽性標本中的惡性細胞或可疑細胞做出標記，待后續(xù)行FISH檢測。

1.3NMP22檢測方法

采用美國Alere公司生產的尿NMP22檢測試劑盒（BladderChek，膠體金法）作為檢測工具，取患者4滴新鮮晨尿滴于試劑盒上，等待30min后在顯色區(qū)判讀結果。由2例醫(yī)生分別判讀，結果分為陰性和陽性。

1.4尿LBC靶向的FISH檢測方法

取CellDetect染色下的LBC檢查中有標記的玻片，用雅培公司的UroVysion原位雜交按試劑盒說明書操作流程操作后，將制備好的玻片在熒光顯微鏡下進行觀察，每例標本分析100個細胞核，標準至少是以下之一[6]：①16%以上的細胞在同一細胞中獲得≥2染色體；②40%以上細胞為單個染色體；③40%以上細胞出現四倍體；④在20%或更多的細胞中9p21位點純合缺失。統(tǒng)計出現在3、7、17號染色體的數目及形態(tài)異常情況及抑癌基因p16的9p21位點的缺失，陽性結果如圖2A、B所示，陰性結果如圖2C、D所示。每例標本分析100個細胞核，統(tǒng)計出現不同類型的細胞數目及多倍體信號數目，記錄結果。

1.5組織學檢查方法

由2位以上經驗豐富的病理學醫(yī)師對切除的樣本進行組織學細胞類型的確定，亞組分析按照國際癌癥控制聯(lián)盟2017年TNM分級系統(tǒng)評估腫瘤分期，最終分成肌層浸潤性膀胱癌（muscle-invasivebladdercancer，MIBC）與非肌層浸潤性膀胱癌（non-muscle-invasivebladdercancer，NMIBC），按照世界衛(wèi)生組織2004尿路上皮癌分級系統(tǒng)評估組織學分級，最終分為低度惡性潛能尿路上皮乳頭狀瘤（papillaryurothelialneoplasmoflowmalignantpotential，PUNLMP）/低級別BUC與高級別BUC。

1.6依病理結果分組

本研究共納入128例患者，經病理檢查最終確診為BUC的患者72例，其中PUNLMP/低級別BUC26例，高級別BUC46例，非BUC組56例。

1.7統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0處理數據，計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，P值為雙向，計量資料以均數（范圍）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1BUC與非BUC組患者的基線資料患者的基線資料見表1。

2.2NMP22、尿LBC和尿LBC靶向的FISH對BUC檢測的靈敏度和特異度分析

3種方法檢測BUC的靈敏度分別為61.11%、79.17%、82.46%，方差為7.91，大于臨界值0.45，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩兩分析時發(fā)現尿LBC和尿LBC靶向的FISH檢測的靈敏度均顯著高于NMP22（P均＜0.05）。NMP22和尿LBC在檢測高級別BUC的靈敏度均優(yōu)于PUNLMP/低級別BUC（7609%vs.34.62%，P=0.01；84.78%vs.6923%，P=0.03），差異有統(tǒng)計學意義。尿LBC靶向的FISH檢測的靈敏度在PUNLMP/低級別時為80.77%，高級別時為83.87%，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.76）。3種方法在檢測NMIBC和MIBC的靈敏度差異均無統(tǒng)計學意義（P≥0.05，表2）。

3種方法檢測BUC的特異度分析中，NMP22、尿LBC、尿LBC靶向的FISH的特異度分別為5714%（32/56）、73.21%（41/56）和86.67%（13/15），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.047）。進行兩兩分析，尿LBC靶向FISH檢測的特異度優(yōu)于NMP22（P＜0.05）。

3討論

WANG等[7]的一項Meta分析結果顯示NMP22檢測BUC的靈敏度為56%，特異度為88%。該研究納入的文獻差距較大，NMP22的靈敏度范圍為556%～100%，特異度為40%～100%。在本研究中，單一NMP22診斷BUC的整體靈敏度為6111%，整體的特異度為5714%。NMP22在MIBC與NMIBC之間靈敏度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。MATI等[8]提出NMP22并非在膀胱癌組織中都有表達，其表達程度與膀胱癌病理分級相關，而與腫瘤的TNM分期無明顯相關性，該結論與本研究結果可相互印證。多項研究表明，相較于普通的尿細胞學檢查，尿LBC檢查具有更高的靈敏度[9-11]。在SHANG等[12]的研究中，尿LBC檢查對于膀胱癌檢查的整體靈敏度、特異度分別為82.8%和88.2%，與本研究的結果相近。

自20世紀90年代開始，國外陸續(xù)開展FISH檢測膀胱癌的臨床研究。LIANG等[13]的Meta分析得出，FISH診斷膀胱癌的整體敏感度為79%，特異度為85%。國內的一項研究使用FISH技術分別檢測血尿標本和非血尿標本的結果顯示，血尿標本的靈敏度顯著高于非血尿標本（81.44%vs.53.45%，P＜0.05）。但FISH單獨用于膀胱癌檢測也具有一定局限性，早期膀胱癌腫瘤細胞浸潤組織較淺，單次檢查在尿液標本中找到陽性脫落細胞概率較低，檢測的靈敏度較低。FISH的原理是利用熒光標記進行檢測，易受患者個體因素影響，如患者存在泌尿系統(tǒng)感染，可能出現自發(fā)熒光現象，會增加假陽性率等。

本研究中使用尿LBC靶向的FISH對CEP3、CEP7、CEP17及9號染色體GLP9p16基因進行檢查，提示與其他兩種檢測方法相比，尿LBC靶向的FISH對于BUC檢出的靈敏度和特異度均有優(yōu)勢。本研究根據膀胱癌世界衛(wèi)生組織分級的亞組研究顯示，尿LBC靶向的FISH在低級別BUC和高級別BUC中的靈敏度分別為80.77%和83.87%；而在MIBC與NMIBC中的靈敏度分別為88.89%和7333%。本研究尿LBC靶向的FISH技術的靈敏度和特異度對比上述文獻報道均有提升?；贑ellDetect染色技術優(yōu)異的顏色特性，檢測結果提供了較以往LBC更多的形態(tài)學特征，使病理醫(yī)師可以更容易地分辨出正常上皮細胞、炎性細胞與腫瘤細胞，提高尿LBC檢測本身的靈敏度。同時也能夠提高尿LBC靶向的FISH檢測的靈敏度，并減少假陽性率。在實際制備玻片的過程中，通過CellDetect染色下的尿LBC檢查發(fā)現可疑膀胱癌組織后，在玻片上標記，此時細胞經過了CellDetect的篩選，分布均勻、密度適中且不重疊，隨后進行FISH檢查，既完成了FISH和LBC的聯(lián)合檢查，增加了靈敏度和特異度，還能使得病理科醫(yī)生的操作流程得到簡化，達到最佳的檢測效率，上述流程曾在宮頸癌的檢查中得到應用[14]。

E-cadherin在高級別、侵襲性及遠處轉移性的BUC中表達下降，這種粘附相關蛋白表達的下調降低了細胞間的粘附并促進了腫瘤的轉移[15-16]，也在一定程度上解釋了多種基于尿脫落細胞的診斷方式中高級別的BUC檢出率普遍高于低級別的原因。而尿LBC靶向的FISH在高級別與低級別BUC檢測中，靈敏度差異無統(tǒng)計學意義，可見尿LBC靶向的FISH在敏感度較高的同時，對于低級別和高級BUC的檢出效率相近，且對低級別BUC的靈敏度優(yōu)于NMP22檢測。由此可以看出，區(qū)別于其他單一檢測方式，尿LBC靶向的FISH通過液基細胞聚焦于“熱點”細胞，提高了對低級別BUC的檢測靈敏度，更適合作為BUC的早期診斷工具。

本研究仍存在一定的局限性，由于樣本量的限制，特別是本研究進行FISH檢測的標本均來自CellDetect染色下的尿LBC檢查陽性結果的標本，減少了可供分析靈敏度和特異度的樣本量，同時有增加偏倚的風險，結果仍需多中心、大樣本、隊列或隨機對照研究的支持。在檢測方法上，CellDetect染色的尿LBC檢查與FISH兩種檢測手段相較于傳統(tǒng)的NMP22檢測方式，經濟成本高、實施步驟多、標本需多次采集，在膀胱癌的診治與長期隨訪中對患者造成負擔，因而NMP22仍然具有經濟、易行等優(yōu)勢。

綜上所述，BUC是一種高發(fā)病率、高復發(fā)率的腫瘤，而尿LBC靶向的FISH檢測作為一種無創(chuàng)檢測，對BUC的診斷有較高的靈敏度和特異度，特別是低級別BUC，此檢測方法可能成為膀胱癌早期篩查、診斷的重要方法，將有助于臨床上對BUC患者的精確診斷、評估，從而改善疾病預后。

參考文獻：

[1]TENKEP，FBINN，NMETHZ.Modernsurgicaltreatmentofurothelialtumors[J].MagyOnkol，2021，65（4）：307-311.

[2]SAJIDM，ZAFARM，AHMADH，etal.DiagnosticaccuracyofNMP22andurinecytologyfordetectionoftransitionalcellcarcinomaurinarybladdertakingcystoscopyasgoldstandard[J].PakJMedSci，2020，36（4）：705-710.

[3]陳韻，趙斯明，張學峰，等.尿液中膀胱腫瘤標志物研究進展[J].國際醫(yī)藥衛(wèi)生導報，2020，26（2）：293-296.

[4]NGK，STENZLA，SHARMAA，etal.Urinarybiomarkersinbladdercancer：areviewofthecurrentlandscapeandfuturedirections[J].UrolOncol，2021，39（1）：41-51.

[5]BEREZNEYR.Thenuclearmatrix：aheuristicmodelforinvestigatinggenomicorganizationandfunctioninthecellnucleus[J].JCellBiochem，1991，47（2）：109-123.

[6]王克杰.CellDetect專利高敏檢測技術在尿脫落細胞學檢測中的應用[J].診斷病理學雜志，2022，29（4）：373-375.

[7]WANGZ，QUEH，SUOC，etal.EvaluationoftheNMP22bladderchektestfordetectingbladdercancer：asystematicreviewandmeta-analysis[J].Oncotarget2017，8（59）：100648-100656.

[8]MATIQ，QAMARS，ASHRAFS，etal.Tissuenuclearmatrixproteinexpression22invariousgradesandstagesofbladdercancer[J].JCollPhysiciansSurgPak，2020，30（12）：1321-1325.

[9]SONS.Evaluationofurinecytologyinurothelialcarcinomapatients：acomparisonofCellprepPlusliquid-basedcytologyandconventionalsmear[J].KoreanJPathol，2012，46（1）：68-74.

[10]張進生，渠淵，安紅雷.尿液標本液基細胞薄層涂片檢查在膀胱癌診斷中的應用[J].北京醫(yī)學，2011，33（7）：563-565.

[11]葉見波，朱有凱，周祥禎.尿液基細胞學與傳統(tǒng)細胞學對膀胱癌診斷價值的比較[J].現代腫瘤醫(yī)學，2010，18（11）：2209-2211.

[12]SHANGD，LIUY，XUX，etal.DiagnosticvaluecomparisonofCellDetect，fluorescentinsituhybridization（FISH），andcytologyinurothelialcarcinoma[J].CancerCellInt，2021Sep6，21（1）：465.

[13]LIANGQ，ZHANGG，LIW，etal.Comparisonofthediagnosticperformanceoffluorescenceinsituhybridization（FISH），nuclearmatrixprotein22（NMP22），andtheircombinationmodelinbladdercarcinomadetection：asystematicreviewandmeta-analysis[J].OncoTargetsTher，2018，12：349-358.

[14]陳順平，宋嶼娜.FISH技術在宮頸液基細胞學實驗操作中應用[J].臨床與實驗病理學雜志，2009，25（1）：102-103.

[15]BALCIMG，TAYFURM.LossofE-cadherinexpressioninrecurrentnoninvasiveurothelialcarcinomaofthebladder[J].IntJClinExpPathol，2018，11（8）：4163-4168.

[16]LUOY，ZHUYT，MALL，etal.CharacteristicsofbladdertransitionalcellcarcinomawithE-cadherinandN-cadherindoublenegativeexpression[J].OncolLett，2016，12（1）：530-536.

Diagnosticvalueofliquid-basedcytologytargetedFISHforurothelialcarcinomaofthebladder

HUANGYongjin1，LIUZhibin1，DONGGehong2，CHEXuanyan1，ZHANGYong1

（1.DepartmentofUrology；2.DepartmentofPathology，BeijingTiantanHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100070，China）

ABSTRACT：ObjectiveToexplorethediagnosticvalueofurinaryliquid-basedcytology（LBC）targetedfluorescenceinsituhybridization（FISH）forurothelialcarcinomaofthebladder.MethodsNuclearmatrixprotein22（NMP22）detection，urinaryLBCandFISHwereperformedin128patients.Thesensitivityandspecificityofthethreekindsoftestswereanalyzedwithpostoperativepathologicalresultsasthegoldstandard.ResultsThesensitivityofNMP22，urinaryLBCandFISHwas61.11%，79.17%and82.46%，thespecificitywas57.14%，73.21%and86.67%，respectively.ThesensitivityofNMP22andurinaryLBCindetectinghighBUCwasbetterthanthatoflowBUC，andthedifferencewasstatistically

significant（P=0.01，P=0.03）.Therewasnosignificantdifferenceinthesensitivityofthethreetestsforthediagnosisofmuscle-invasivebladdercancerandnonmuscle-invasivebladdercancer（P≥0.05）.ConclusionUrinaryLBCtargetedFISHhashighsensitivityandspecificityinthediagnosisofurothelialcarcinomaofthebladderandlow-gradeurothelialcarcinoma.Itcanbeanimportantmethodfortheearlyscreeninganddiagnosisofbladdercancer.

KEYWORDS：urothelialcarcinomaofthebladder；fluorescenceinsituhybridization；nuclearmatrixprotein22；urinaryliquid-basedcytology

（編輯閆玉梅）