高效液相色譜法在茶葉有機酸檢測中的應用研究進展

基金項目：2021年度雅安市高層次人才科研項目（科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)苗子工程重點項目）資助

作者簡介：胡燕，女，高級工程師，主要從事茶葉資源開發(fā)與利用及茶葉檢測研究工作，E-mail：xiaowei401@sohu.com

摘要：茶葉中的有機酸是影響茶葉香氣和滋味的主要成分之一，高效液相色譜法是食品中有機酸檢測的常用方法，具有操作簡單、靈敏度高、分離效果好等特點。文章綜述了有機酸對茶葉風味品質(zhì)的影響、高效液相色譜法目前能測定出的茶葉中有機酸種類以及采用高效液相色譜法測定茶葉中有機酸的研究進展，總結(jié)了測定茶葉中有機酸的高效液相色譜條件，包括檢測波長、流動相、柱溫和流速等，并對采用高效液相色譜法測定茶葉中有機酸存在的困難及該方法的應用前景進行了展望，以期促進茶葉中有機酸檢測技術(shù)的發(fā)展，為茶葉的品質(zhì)特征及保健功效研究提供指導，為茶葉中有機酸組分檢測方法標準的制定提供參考。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；茶葉；有機酸；應用

中圖分類號：TS272.7；O657.72? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1000－3150（2024）06-11-7

Progress in the Application of High Performance Liquid

Chromatography in the Detection of Organic Acids in Tea

HU Yan

Ya'an Quality Inspection and Testing Institute （Ya'an Institute for Food and Drug Control）/National Tea Product

Quality Inspection and Testing Center （Sichuan）， Ya'an 625000， China

Abstract： Organic acids are the main components affecting tea aroma and taste. High performance liquid chromatography is a commonly used method for detecting organic acids in food， which has the characteristics of simple operation， high sensitivity， and good separation effect. The article reviewed the effects of organic acids on the flavor and quality of tea， the types of organic acids that could be determined in tea using high-performance liquid chromatography， as well as relative research progress. It summarized the conditions for determining organic acids in tea using high performance liquid chromatography， including the selection of detection wavelength， mobile phase， flow rate， and column temperature. The difficulties in using high performance liquid chromatography to determine organic acids in tea and the application prospects of the method were discussed， in order to promote the development of organic acid detection technology in tea. This paper provided guidance for the study of quality characteristics and health benefits of tea， and provided a reference for the formulation of detection method standards for organic acid components in tea.

Keywords： high performance liquid chromatography， tea， organic acid， application

有機酸是茶葉中的主要活性成分之一，主要功能鍵為羧基（-COOH），具有軟化血管，促進人體對鈣、鐵等元素的吸收和對蛋白質(zhì)、淀粉的消化等功能[1-2]，可通過改善腸道微環(huán)境的pH來調(diào)節(jié)腸道免疫力，抑制致病菌的生長繁殖[3-5]。茶葉中有機酸的含量約為干物質(zhì)總量的3%[6]，其種類和含量與茶樹品種、茶葉嫩度、產(chǎn)地、加工工藝、儲藏條件等有關(guān)[7]。有機酸影響著茶樹體內(nèi)的物質(zhì)形成與轉(zhuǎn)化，參與茶樹的新陳代謝，是茶葉中一些滋味成分和香氣成分的前體或中間產(chǎn)物，影響著茶葉品質(zhì)的形成，但迄今為止對茶葉中有機酸組分及含量、茶葉加工過程中有機酸的變化規(guī)律等方面還缺乏系統(tǒng)研究。

茶葉中有機酸的測定方法主要有電位滴定法、毛細管電泳法、離子色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和高效液相色譜法等[8]。電位滴定法是利用電位的變化來確定滴定終點，適用于對茶葉中總有機酸進行測定；毛細管電泳法以石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分的差異來實現(xiàn)分離，具有操作簡單、高效快速、試劑與樣品消耗少等優(yōu)點，但重現(xiàn)性較差；離子色譜法對樣品的凈化要求高，對于成分復雜的茶葉樣品的分析難度較大，且當樣品中有大量無機陰離子與有機酸同時存在時，對低分子量有機酸的檢測難度會增加；氣相色譜法適用于測定低分子量的有機酸，對于揮發(fā)性較低的有機酸需要進行衍生化處理，操作繁瑣；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有色譜的高分離度和質(zhì)譜的高靈敏度，準確性高、特異性好，但儀器昂貴；高效液相色譜法具有操作簡單、靈敏度高、分離效果好等特點，更適合對復雜基質(zhì)中的有機酸進行測定，是目前最廣泛使用的有機酸測定方法[9]。

本文綜述有機酸對茶葉風味品質(zhì)的影響和適用于高效液相色譜測定的茶葉中主要有機酸組分，總結(jié)采用高效液相色譜法測定茶葉中有機酸組分及含量的研究進展，分析測定茶葉中有機酸的高效液相色譜條件，展望今后的研究方向，以期為深入研究茶葉中有機酸的組成及含量奠定理論基礎(chǔ)，為茶葉品質(zhì)風味及保健功效的研究提供參考。

1? 有機酸對茶葉風味品質(zhì)的影響

茶葉作為一種風味飲料，其品質(zhì)優(yōu)劣取決于風味品質(zhì)成分的組成，風味品質(zhì)成分包括香氣成分和滋味成分，有機酸種類與含量的變化會對茶葉的香氣和滋味產(chǎn)生不同程度的影響，其中芳香族有機酸主要影響茶葉的香氣，而脂肪族有機酸是茶葉中重要的滋味成分，主要包括二元羧酸和羥基多元羧酸，如琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸等，以及環(huán)狀結(jié)構(gòu)的脂肪酸，如奎尼酸等[10]。謝嬌枚等[11]的研究表明，祁門紅茶在存放過程中，酸類物質(zhì)如草酸、乙酸等的含量隨存放時間延長呈增加趨勢，而檸檬酸含量的下降對其茶湯滋味品質(zhì)的影響較大。琥珀酸等有機酸本身無味，但與谷氨酸結(jié)合后，對茶湯中的鮮味具有重要貢獻[8]。有機酸參與了茶葉香氣的形成與轉(zhuǎn)化，其中脂肪酸是影響茶葉香氣組分形成的重要成分之一，這是因為某些脂肪酸自身就具有一定的香氣，是構(gòu)成茶葉香氣的組分之一，而且茶葉中的亞麻酸、亞油酸等可通過氧化反應轉(zhuǎn)變?yōu)榧合┐嫉确枷阄镔|(zhì)[12]。

2? 茶葉中可采用高效液相色譜法測定的主要有機酸組分

茶葉中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的有機酸有40余種，其中香氣成分有30余種[13]，可用高效液相色譜法測定的茶湯中的有機酸組分主要有10余種，包括抗壞血酸、乙酸、酒石酸、琥珀酸、蘋果酸、檸檬酸、α-酮戊二酸、丙酮酸、乳酸、水楊酸、草酸、富馬酸、馬來酸、奎尼酸等，其化學結(jié)構(gòu)式見圖1。茶葉中有機酸的高效液相色譜分析色譜圖見圖2[7]?？箟难崾且环N含有6個碳原子的酸性多羥基化合物，由于具有烯二醇結(jié)構(gòu)，化學性質(zhì)不穩(wěn)定，容易被氧化，因此具有很強的還原性[14]，具有清除自由基的能力，能夠阻止自由基的損害，延緩衰老[15]。乙酸中的乙?；绻c輔酶A結(jié)合就可成為碳水化合物和脂肪新陳代謝的中心。酒石酸的酸味強烈；蘋果酸的酸味爽口、略帶刺激性，有略微的苦澀感；檸檬酸呈現(xiàn)出一種清新的酸味；琥珀酸除酸味外還有咸苦味。蘋果酸、琥珀酸和檸檬酸均參與了三羧酸循環(huán)，蘋果酸在蘋果酸脫氫酶的作用下合成草酰乙酸，草酰乙酸在檸檬酸合酶的作用下合成檸檬酸；琥珀酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，可由檸檬酸先生成α-酮戊二酸，進而合成琥珀酸[16]；檸檬酸在順烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶和琥珀酸-CoA合成酶的作用下也可合成琥珀酸；蘋果酸可由琥珀酸在琥珀酸脫氫酶和富馬酸酶的作用下合成。丙酮酸是糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝的中間產(chǎn)物，是重要的生物活性中間體[17]。相關(guān)研究表明，經(jīng)微生物發(fā)酵的茶葉中有機酸含量大于非發(fā)酵茶[4]，例如根霉可分泌凝乳酶使脂類物質(zhì)匯集生成乳酸，從而使茶湯順滑甘醇[18]。水楊酸是重要的調(diào)控植物免疫反應的植物激素之一，具有清熱、解毒和殺菌等作用。草酸能使多酚氧化酶的活性降低，可作為天然抗氧化劑使用[15]；富馬酸即反丁烯二酸，酸味很強，并具有澀味，與馬來酸（順丁烯二酸）互為順反異構(gòu)體，馬來酸經(jīng)催化氫化或化學還原可生成琥珀酸。茶鮮葉在揉捻、渥堆等過程中，脫氫奎尼酸在奎尼酸脫氫酶的催化作用下可產(chǎn)生奎尼酸，導致奎尼酸含量上升[19]。

3? 高效液相色譜法測定茶葉中有機酸的研究進展

茶葉依據(jù)其產(chǎn)品特質(zhì)、加工工藝及在加工過程中的“發(fā)酵程度”分為綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶、紅茶和黑茶六大類，不同茶類的主要有機酸組成及其含量有所差異，具體見表1[6，20-27]。由于茶葉的內(nèi)含成分復雜，目前采用高效液相色譜法對茶葉中有機酸進行研究還處于起步階段，主要集中于對白茶和黑茶中的有機酸組分和含量進行測定，對其他茶類中有機酸的研究較少。

3.1? 綠茶中有機酸的測定

綠茶是我國產(chǎn)量最大的茶類，由茶鮮葉經(jīng)殺青、揉捻、干燥等工藝制作而成。陸敏等[28]運用高效液相色譜法測定了綠茶中檸檬酸、蘋果酸、草酸、酒石酸、丁二酸、乳酸等有機酸的含量。劉爽等[29]對名優(yōu)綠茶與大宗綠茶中有機酸的研究表明，抗壞血酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸等的含量會隨著綠茶品質(zhì)的下降而下降，名優(yōu)綠茶的有機酸總量高于大宗綠茶。劉盼盼等[20]測定了不同茶樹品種、不同葉位的鮮葉原料加工的烘青綠茶的有機酸含量，結(jié)果表明在有機酸組成中奎尼酸、蘋果酸、檸檬酸和草酸的含量較高，隨著鮮葉嫩度的下降，草酸的含量下降明顯，不同茶葉品種對有機酸含量有較大影響。

3.2? 白茶中有機酸的測定

白茶屬于微發(fā)酵茶，不炒不揉，成茶具有外形滿身披毫，毫香清鮮，湯色黃綠清澈，滋味清淡回甘的品質(zhì)特點[30]。Marat等[31]采用高效液相色譜法分析了白茶加工過程中有機酸組分的含量，結(jié)果表明白茶中的有機酸組分主要有檸檬酸、草酸、水楊酸、抗壞血酸等，其中檸檬酸的含量最高，白茶加工過程中總有機酸含量呈遞增趨勢。何水平[15]建立了測定白茶中有機酸的高效液相色譜分析方法，測定了白茶中的草酸、乙酸、抗壞血酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸、琥珀酸和富馬酸含量，結(jié)果表明乙酸是所測白茶樣品中的主要有機酸，乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸含量隨鮮葉等級的降低而下降，蘋果酸的含量則隨著鮮葉等級的降低而增加。呂海鵬等[30]的研究表明，白茶茶湯中的有機酸組分以奎尼酸、草酸和酒石酸為主。田宇倩等[7]采用高效液相色譜法分析了不同嫩度白茶及其萎凋過程中的草酸、酒石酸、奎尼酸、丙酮酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸等9種有機酸的含量，結(jié)果表明白牡丹的有機酸含量最高，壽眉的有機酸含量最低，檸檬酸、奎尼酸是影響有機酸總量變化的主要組分。

3.3? 黃茶中有機酸的測定

黃茶屬于輕發(fā)酵茶，獨特的“悶黃”工藝使黃茶具有“黃湯黃葉、味甘鮮爽”的品質(zhì)特征[32]。謝關(guān)華[10]采用高效液相色譜法對梅占品種加工而成的六大茶類的有機酸組分進行了測定，結(jié)果表明黃茶的有機酸總量最高，黃茶中含量最高的有機酸為乙酸，草酸、酒石酸、蘋果酸含量較高。

3.4? 烏龍茶中有機酸的測定

烏龍茶屬于部分發(fā)酵的茶類，經(jīng)過萎凋、搖青與涼青、殺青、揉捻、干燥等主要加工工藝制成[33]。劉盼盼等[20]對紅茶、烏龍茶、綠茶和普洱茶中有機酸的研究表明，不同茶類間有機酸含量的差異較大，其中烏龍茶中含量較高的有機酸為檸檬酸、奎尼酸和抗壞血酸。莫潤明等[21]采用高效液相色譜法研究了鐵觀音陳化過程中10種有機酸組分的變化規(guī)律，結(jié)果表明乳酸和琥珀酸是陳化過程中的主要有機酸。王麗麗等[6]對清香型鐵觀音的研究表明，含量最高的有機酸是乳酸，其次為草酸和乙酸，在所測茶樣中未檢出琥珀酸。

3.5? 紅茶中有機酸的測定

紅茶屬于全發(fā)酵茶，由茶鮮葉經(jīng)過萎凋、揉捻、發(fā)酵和干燥等一系列加工工藝制作而成[34]。紅茶經(jīng)過萎凋、揉捻、發(fā)酵等加工工序后，有機酸含量呈增長趨勢，如草酸、琥珀酸、蘋果酸等有機酸含量增加較為明顯，直至干燥時才有所降低[15]。宋楚君等[35]采用高效液相色譜法測定了大葉種紅茶中的有機酸，結(jié)果表明富馬酸和檸檬酸的含量較高。張靜等[22]測定了紅茶中的草酸、酒石酸、乳酸、乙酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、丙酮酸和抗壞血酸等有機酸的含量，結(jié)果表明所測紅茶中的有機酸以草酸為主，乳酸和乙酸的含量在不同產(chǎn)地紅茶中的差異較大。謝子譞[36]采用高效液相色譜法從工夫紅茶中鑒定出13種有機酸，結(jié)果表明提香工藝能夠顯著影響工夫紅茶貯藏過程中有機酸含量的變化，推測草酸、蘋果酸和奎尼酸含量的增加可能是提香茶葉貯藏過程中滋味酸化的重要原因。

3.6? 黑茶中有機酸的測定

茶葉中有機酸的種類和含量與茶葉發(fā)酵程度有關(guān)，一般發(fā)酵程度越重，有機酸含量越高。黑茶屬于后發(fā)酵茶，制茶工藝一般包括殺青、揉捻、渥堆和干燥4道主要工序，其渥堆工序中微生物代謝可產(chǎn)生大量的有機酸，同時，各種物化動力使茶葉在渥堆時新陳代謝加快，而有機酸作為糖、脂等多種物質(zhì)代謝的中間產(chǎn)物，其含量會隨代謝加快而上升[37]。袁玲等[38]利用高效液相色譜法測定了茯磚茶樣品中的草酸、α-酮戊二酸、檸檬酸、蘋果酸、富馬酸、乳酸、乙酸的含量。丁玲等[23]利用高效液相色譜法測定了緊壓茶中的草酸、α-酮戊二酸、蘋果酸、抗壞血酸等10種有機酸。諶瀅[18]對不同年份六堡茶、茯磚茶、千兩茶、普洱熟茶中的有機酸組分及含量進行了分析，結(jié)果表明茶樣中草酸的含量較高，茯磚茶、千兩茶中含有較多的乳酸和檸檬酸，六堡茶、普洱熟茶中含有較多的蘋果酸。呂海鵬等[24]的研究表明，普洱茶中的有機酸成分以草酸、蘋果酸等為主。舒娜[39]測定了六堡茶中7種有機酸組分，其中含量最高的是草酸，而后為乙酸、琥珀酸、奎尼酸，僅在部分茶樣中檢出了檸檬酸。

4? 測定茶葉中有機酸的高效液相色譜條件

目前采用高效液相色譜法測定茶葉中的有機酸主要集中在奎尼酸、乳酸、乙酸、草酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、富馬酸、馬來酸、抗壞血酸等組分。常用的高效液相色譜柱為C18色譜柱。對高效液相色譜條件的優(yōu)化主要包括檢測波長的選擇、流動相的選擇、柱溫和流速的選擇等。

4.1? 檢測波長的選擇

對茶葉中常見的有機酸組分在紫外波長下進行光譜掃描，結(jié)果表明大部分有機酸在210 nm處有較大吸收[23]，但抗壞血酸在245 nm處有最大吸收，因此對茶葉中的有機酸進行測定時，檢測波長一般選擇210 nm，對抗壞血酸選擇在245 nm波長下進行檢測。

4.2? 流動相的選擇

對有機酸的測定一般選擇在紫外區(qū)幾乎無吸收的磷酸鹽溶液作為流動相，目前常用的流動相為磷酸二氫鉀[23]。有機酸為弱酸，在水溶液中存在解離平衡，解離程度受溶液pH控制，為了使有機酸能夠以分子形式在反相柱上保留，可通過調(diào)節(jié)流動相的pH，提高H+濃度來達到抑制解離、改善分離效果的作用[28]。一般采用磷酸來調(diào)節(jié)流動相的pH，現(xiàn)有研究表明，當pH>3.0時，一些有機酸組分不能完全分開，但pH太低時大部分有機酸的保留時間縮短，同樣會影響分離效果，而且低pH的流動相會影響色譜柱的柱效及使用壽命[1]，因此需根據(jù)所測有機酸的種類來確定流動相的最適pH，一般選擇pH為2.6～2.8。磷酸鹽濃度的高低直接影響其緩沖容量的大小，影響有機酸存在形式的穩(wěn)定性，從而影響分離效果，磷酸鹽濃度越高，有機酸的存在形式越穩(wěn)定，但濃度過高時離子強度增大，對有機酸的分離不利，同時，磷酸鹽濃度太高會對泵和色譜柱的壽命產(chǎn)生影響，因此磷酸二氫鉀的濃度一般選擇0.01～0.05 mol/L。有研究表明在流動相中添加適量的甲醇可有效改善峰形，有利于有機酸組分的分離，但隨著甲醇含量的增加，有機酸的疏水基與固定相的相互作用減弱，保留時間下降，可能會造成部分有機酸組分的分離度降低[38]。

4.3? 柱溫和流速的選擇

隨著柱溫的升高，檢測時間縮短[6]，部分有機酸的分離度可能會降低；隨著流速的提高，各有機酸組分的保留時間縮短，但流速過高會使柱壓升高，影響有機酸組分的分離度，而且不利于色譜柱的保護與長期使用，而流速過低時會導致色譜峰的峰形較寬，部分有機酸可能會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，因此需根據(jù)所測有機酸的種類進行綜合考慮。

5? 展望

高效液相色譜法是目前常用的有機酸測定方法，《食品安全國家標準 食品中有機酸的測定》（GB 5009.157—2016）規(guī)定了采用高效液相色譜法檢測食品中酒石酸、乳酸、蘋果酸、檸檬酸、丁二酸、富馬酸和己二酸的測定方法，但該標準只適用于對果汁及果汁飲料、碳酸飲料、固體飲料、膠基糖果、餅干、糕點、果凍、水果罐頭、生濕面制品和烘焙食品餡料中的有機酸進行測定[40]。目前高效液相色譜法也逐步應用于對茶葉中的有機酸進行分析，但茶葉的基質(zhì)復雜，其中的很多組分可能會干擾目標物的測定，因此選擇合適的樣品前處理方法是采用高效液相色譜法測定茶葉樣品中有機酸的關(guān)鍵。此外，有機酸在紫外波段基本無特征吸收，因此常選擇在210 nm附近檢測，但在該波段靈敏度相對較差，因此需要針對不同的茶類不斷優(yōu)化高效液相色譜條件，建立適用的有機酸檢測方法，并制定相應的檢測標準。

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