骨寶膠囊對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度、骨微結(jié)構(gòu)的影響

郭金星，田增輝，盛夏，郝延科

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014）

糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥（glucocorticoidinduced osteoporosis，GIOP）是一種以骨丟失、骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特點(diǎn)的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，是長(zhǎng)期或高劑量糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids，GC）使用后最常見的不良反應(yīng)之一［1-2］。目前GIOP的治療以促進(jìn)骨生成，抑制骨破壞的西藥治療為主，但其弊端正逐漸被世人認(rèn)知，造成諸多不良反應(yīng)。流行病學(xué)調(diào)查顯示，風(fēng)濕性疾病患者骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率高達(dá)80%以上，且骨量下降與GC累積使用時(shí)間呈正相關(guān)，但我國(guó)GIOP患者使用抗骨質(zhì)疏松藥物尚未規(guī)范，約1/3的患者從未接受任何治療，從而導(dǎo)致骨折風(fēng)險(xiǎn)增加［3］。

中醫(yī)學(xué)對(duì)GC雖無明確記載，但《素問·陰陽應(yīng)象大論》中提到“壯火食氣，少火生氣”，意為“壯火之品”易致氣血虧虛，“少火之品”令人氣血旺盛［4］。中醫(yī)將GC歸為 “壯火之品”，初用耗氣傷津，久之則損傷臟腑、氣血、陰陽［5］。

關(guān)于GIOP的治療一直是藥物研究的熱點(diǎn)問題，骨寶膠囊作為山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑科經(jīng)典自制藥，已經(jīng)在臨床上得到廣泛應(yīng)用，早期研究表明，長(zhǎng)期服用可改善GIOP（肝腎不足證）［6］。本次實(shí)驗(yàn)研究旨在通過觀察骨寶膠囊對(duì)GC誘導(dǎo)下骨質(zhì)疏松大鼠的影響，進(jìn)一步明確骨寶膠囊在GIOP中對(duì)提高骨密度、改善骨微結(jié)構(gòu)的療效，為今后骨寶膠囊在臨床上對(duì)GIOP患者的應(yīng)用提供有力證據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3月齡SPF級(jí)雄性Wistar 大鼠40只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0006，體質(zhì)量（200±20）g。所有動(dòng)物均在山東中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，并且在清潔、干燥、通風(fēng)、恒溫、相對(duì)濕度（50±5）℃的適宜條件下進(jìn)行飲食，實(shí)驗(yàn)所需飼料、凈化水、墊料均由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本實(shí)驗(yàn)符合規(guī)范并通過了山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查，批準(zhǔn)文號(hào)：SDUTCM20220314001，并在實(shí)驗(yàn)中心指導(dǎo)下開展實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

骨寶膠囊（規(guī)格：0.25 g/粒、批號(hào)：Z01080550），由鹿角膠、骨碎補(bǔ)、淫羊藿、白芍、當(dāng)歸、甘草組成，上述藥材均由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑科嚴(yán)格按照工藝制備而成；地塞米松磷酸鈉注射液（規(guī)格：1 mL∶5 mg，批號(hào)：H14022567，石藥銀湖制藥有限公司）；鈣爾奇D（規(guī)格：600 mg/片、批號(hào)：H10950029，惠氏制藥有限公司）。

1.3 試劑與儀器

血清鈣、血清磷、堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒（批號(hào)：2022003、2022004、2021003，長(zhǎng)春匯力）；無水乙醇、二甲苯（批號(hào)：100092683、10023418，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

離心機(jī)（型號(hào)：Centrifuge 5810 R型，德國(guó)Eppendorf）；烤箱（型號(hào)：GFL-230型，天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司）；臥式冷凍箱（型號(hào)：BCD-318AT型，中科美菱）；Micro-CT（型號(hào)：SkyScan 1276型，德國(guó)Bruker）；全自動(dòng)生化分析儀（型號(hào)：Chemray 240型，深圳雷杜生命科技）；電子天平（型號(hào)：ME203E/02型，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)（型號(hào)：AK-RO-C2型，艾肯水精靈）；包埋機(jī)（型號(hào)：JB-P5型，武漢俊杰電子有限公司）；病理切片機(jī)（型號(hào)：RM2016型，上海徠卡儀器有限公司）；正置光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：Eclipse E100，日本尼康）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組、造模、給藥、取材

對(duì)40只健康3月齡的雄性Wistar大鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，1周內(nèi)無死亡及其他異常后，隨機(jī)分為空白組、模型組、給藥組（骨寶膠囊）和對(duì)照組（鈣爾奇D），每組10只。除空白組外，其余3組采用腹腔注射方式注射地塞米松磷酸鈉注射液（2.5 mg/kg），空白組予以等體積0.9%氯化鈉注射液（2.5 mL/kg）腹腔注射，每周2次（周二，周五），為期8周。8周后各組隨機(jī)選擇3只大鼠進(jìn)行CT檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)造模組較空白組骨密度較低，骨小梁稀疏，排列不均勻，提示造模成功。將藥物溶于蒸餾水配制相應(yīng)濃度的灌胃溶液，冷藏保存，上午8時(shí)給藥，1次/d，給藥劑量參照藥理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)體重動(dòng)物的mg/kg劑量折算表［7］，給藥組給予0.4 g/（kg·d）骨寶膠囊，對(duì)照組給予60 mg/（kg·d）鈣爾奇D，空白組、造模組予以等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)12周，所有動(dòng)物灌胃體積均為1 mL/kg。灌胃結(jié)束后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉，觀察大鼠，待大鼠對(duì)外界刺激無應(yīng)答麻醉完全后取材。

2.2 樣本采集及檢測(cè)

2.2.1 血清ELISA檢測(cè)

腹主動(dòng)脈取血，將全血標(biāo)本放于室溫靜置，2 h后置入離心機(jī)，4 ℃低溫離心30 min（3 000 r/min），移液槍提取上清，EP管密封后置于-20 ℃冰箱中待測(cè)。按血鈣、磷、堿性磷酸酶生化ELISA檢測(cè)試劑盒要求進(jìn)行檢測(cè)，用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.2.2 骨密度的測(cè)量和Micro-CT

取左側(cè)股骨，仔細(xì)剔除附著肌肉和軟組織，剝離完全后組織固定液固定，采用Micro-CT掃描，利用NRecon三維重建圖像，使用 CT Analyser分析選定區(qū)域。統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)后，測(cè)得骨密度（BMD）、骨體積比（BV/TV）、骨小梁數(shù)（Tb.N）和骨小梁分離度（Tb.Sp）等參數(shù)。

2.2.3 蘇木精-伊紅染色

取右側(cè)股骨，用生理鹽水清洗，并于甲醛溶液中固定48 h。脫鈣液脫鈣后每3 d更換一次液體，石蠟包埋后切片，按常規(guī)蘇木精-伊紅染色步驟：石蠟切片脫蠟、蘇木素染色、伊紅染色、脫水封片，顯微鏡下觀察分析組織病理學(xué)變化。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Microsoft Excel進(jìn)行記錄和格式整理，SPSS25.0和GraphPad Prism9.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用±s表示，判斷數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布，若具備正態(tài)分布且方差齊，則采用單因素方差分析（one-way-ANOVA），若服從正態(tài)分布但方差不齊則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組血清生化指標(biāo)的比較

模型組大鼠血鈣水平明顯低于空白組（P＜0.05），給藥組和對(duì)照組血鈣水平均有顯著提高（P＜0.05）。模型組血磷、堿性磷酸酶與空白組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），給藥組血磷、堿性磷酸酶與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表1。

表1 各組血清生化指標(biāo)比較（±s）

表1 各組血清生化指標(biāo)比較（±s）

注：與空白組比較，△P ＜ 0.05；與模型組比較，▲P ＜ 0.05。

組別空白組模型組給藥組對(duì)照組堿性磷酸酶/（U/mL）134.72±20.81 128.14±23.55 136.19±33.10 118.38±26.66 n7 7 7 7血鈣/（mmol/L）2.06±0.06 1.91±0.01△2.07±0.05▲2.09±0.05▲血磷/（mmol/L）1.86±0.15 1.82±0.11 1.78±0.18 1.84±0.20

3.2 各組骨密度相關(guān)參數(shù)

模型組大鼠BMD明顯低于空白組（P＜ 0.05），說明糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠模型成功。給藥組BMD較模型組有顯著提高（P＜ 0.05），而給藥組與對(duì)照組BMD水平比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），說明骨寶膠囊和鈣爾奇D對(duì)治療骨質(zhì)疏松均有不錯(cuò)療效。模型組大鼠BV/TV、Tb.N和Tb.Sp較空白組明顯降低（P＜ 0.05）。與模型組相比，給藥組BV/TV、Tb.N提升顯著（P＜ 0.05），Tb.Sp下降明顯（P＜ 0.05）。與對(duì)照組比較，給藥組BV/TV顯著升高 （P＜ 0.05），而Tb.N、Tb.Sp無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表2。

表2 各組大鼠股骨骨密度、骨相關(guān)參數(shù)比較（±s）

表2 各組大鼠股骨骨密度、骨相關(guān)參數(shù)比較（±s）

注：與空白組比較，△P ＜ 0.05；與模型組比較，▲P ＜ 0.05；與對(duì)照組比較，*P ＜ 0.05。

組別空白組模型組給藥組對(duì)照組n7 7 7 7 BMD/（g/cm3）0.41±0.06 0.15±0.06△0.38±0.06▲0.36±0.02▲BV/TV/%36.79±2.96 12.64±6.13△67.13±5.02▲*52.87±2.01▲Tb.N/（L/mm）2.85±0.57 0.91±0.44△3.81±0.21▲3.78±0.12▲Tb.Sp/mm 0.17±0.05 0.84±0.41△0.16±0.03▲0.18±0.03▲

3.3 Micro-CT掃描圖像

Micro-CT圖像顯示模型組骨小梁數(shù)目缺失、變細(xì)、形態(tài)不規(guī)則、連續(xù)性下降、排列稀疏、間距變大，總體呈稀疏狀骨微結(jié)構(gòu)。給藥組與對(duì)照組骨小梁數(shù)目增加、變粗、形態(tài)完整、連續(xù)性較好、排列緊密，間隙縮小，已接近空白組骨小梁微結(jié)構(gòu)，這說明骨寶膠囊和鈣爾奇D均能改善骨微結(jié)構(gòu)。見圖1。

圖1 各組Micro-CT股骨遠(yuǎn)端掃描圖像

3.4 Micro-CT三維重建

三維重建圖像顯示模型組骨小梁數(shù)量明顯減少、骨小梁排列稀疏，骨髓腔內(nèi)出現(xiàn)顯著空虛，骨小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)缺失。給藥組與對(duì)照組骨髓腔較為充實(shí)，骨小梁數(shù)量明顯增加，骨小梁排列緊密，骨小梁間隙較小，骨小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)重現(xiàn)，可見骨寶膠囊和鈣爾奇D均能顯著改善骨微結(jié)構(gòu)，其中給藥組改善效果整體略優(yōu)于對(duì)照組。見圖2。

3.5 蘇木精-伊紅染色

模型組的骨小梁數(shù)目減少、厚度變薄、面積比低、連續(xù)性差、排列紊亂、骨質(zhì)疏松特征顯著?？瞻捉M松質(zhì)骨豐富，骨小梁數(shù)目多、排列緊密、連續(xù)性好、骨組織結(jié)構(gòu)完整、壁厚均勻。與模型組相比，給藥組和對(duì)照組骨小梁結(jié)構(gòu)均較為完整，紋理排列緊密。總體而言，給藥組和對(duì)照組兩組的骨小梁和松質(zhì)骨的狀態(tài)均優(yōu)于模型組。見圖3。

圖3 各組HE染色結(jié)果（×100，標(biāo)尺200 mm）

4 討論

糖皮質(zhì)激素（GC）臨床上主要用于治療過敏性疾病、自身免疫性疾病、器官移植后狀態(tài)等。但長(zhǎng)期應(yīng)用容易導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松（GIOP）的發(fā)生，應(yīng)引起臨床醫(yī)生的重視［8］。近年來，GIOP受到廣泛關(guān)注，但是如何規(guī)范防治仍是目前亟待解決的難題。中醫(yī)學(xué)將GIOP歸為“骨痿”“骨痹”“腰痛”范疇，把外源性藥物GC歸為“藥邪”“壯火之品”。長(zhǎng)期大量使用外源性GC必然會(huì)傷及人體。初期會(huì)助陽生熱，日久則真陰損傷而表現(xiàn)為陰虛陽亢，虛火內(nèi)動(dòng)，灼傷陰精，精不足則化骨無源［9］；中期陰精耗損，陽隨陰衰，陽氣虛衰則筋骨痿軟［10］；后期則陰陽俱衰，正氣虧損，五臟六腑元?dú)馑ノ?，腎精化生無源，氣血精髓無法濡養(yǎng)筋骨而致骨枯而痿［11］。

山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌專家張洪，師從全國(guó)名老中醫(yī)程益春先生，作為學(xué)術(shù)繼承人研究老年人病理、生理和臨床特點(diǎn)，從肝腎入手，精選藥物研制成骨寶膠囊。骨寶膠囊方中鹿角膠為君，味咸性溫，能補(bǔ)肝腎、益精血、強(qiáng)筋骨；骨碎補(bǔ)為臣，入肝腎經(jīng)，長(zhǎng)于補(bǔ)腎壯骨，續(xù)筋止痛；白芍、當(dāng)歸為佐，其中白芍配甘草，酸甘化陰，既能制約壯火之品導(dǎo)致的陰陽失衡，又能緩急止痛。當(dāng)歸能養(yǎng)血補(bǔ)血，且兼能活血化瘀，通行血脈減輕肢體疼痛。諸藥配伍，補(bǔ)益肝腎，強(qiáng)筋壯骨，對(duì)因骨質(zhì)疏松而引起的疼痛癥狀改善明顯。盡管骨寶膠囊已取得較好的臨床效果［12］，但其防治GIOP的效果尚未被證實(shí)。為此本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成功造出糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松Wistar大鼠模型，并應(yīng)用骨寶膠囊干預(yù)，同時(shí)與臨床常用藥物鈣爾奇D相比較。

本次實(shí)驗(yàn)生化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥組大鼠血生化指標(biāo)中，血清鈣水平有顯著提高，血清磷、堿性磷酸酶則與空白組、模型組相比差異不明顯。馮佳等［13］通過實(shí)驗(yàn)研究對(duì)比了去勢(shì)、糖皮質(zhì)激素、維甲酸誘導(dǎo)不同造模方式下對(duì)血清生化指數(shù)的影響，結(jié)果顯示糖皮質(zhì)激素造模方式與正常組對(duì)比，血清磷、堿性磷酸酶無顯著差異，與本研究結(jié)果相一致。骨密度是診斷骨質(zhì)疏松癥的金標(biāo)準(zhǔn)，可反映骨骼的礦物質(zhì)水平［14］。GIOP大鼠模型造模成功后，骨密度顯著低于空白組。不同藥物干預(yù)后，各組大鼠骨密度均有提高，證明骨寶膠囊和鈣爾奇D可以有效地改善糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松。

Micro-CT技術(shù)是一種敏感且可靠的定量定性分析技術(shù)，可用于分析骨骼骨礦含量及重塑骨骼微細(xì)結(jié)構(gòu)［15］，本實(shí)驗(yàn)采用Micro-CT技術(shù)對(duì)大鼠股骨進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)與模型組比較，給藥組顯著升高了BV/TV、Tb.N，且Tb.Sp明顯降低，骨小梁數(shù)量增多、排列結(jié)構(gòu)整齊，骨質(zhì)改善效果更佳。說明骨寶膠囊不僅可以提高GIOP大鼠的骨密度，還可以改善其骨微細(xì)結(jié)構(gòu)，有效預(yù)防GIOP的發(fā)生。此外，HE染色中給藥組也有良好表現(xiàn)，給藥組骨小梁數(shù)量增加、密度增大，且具有連續(xù)性，反映出骨密度較高，對(duì)糖皮質(zhì)激素性Wistar大鼠骨質(zhì)疏松狀況改善顯著。

同時(shí)，本研究存在一定不足，各組樣本量較小，對(duì)研究結(jié)果可能存在一定的影響；對(duì)骨密度、骨微結(jié)構(gòu)、骨代謝角度研究較多，缺乏骨寶膠囊治療GIOP靶點(diǎn)通路的深入探究。

綜上，本研究成功建立糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠模型，骨寶膠囊對(duì)其進(jìn)行干預(yù)后，從血清生化指標(biāo)、骨密度相關(guān)參數(shù)、Micro-CT、三維重建和組織病理學(xué)染色多方面評(píng)估骨寶膠囊對(duì)大鼠骨質(zhì)疏松的影響，相較以往臨床試驗(yàn)而言，本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨寶膠囊能明顯改善糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)大鼠的骨質(zhì)疏松，不僅能為GIOP相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提供參考，還為骨寶膠囊在臨床中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐及理論依據(jù)。