基于植物性狀和揮發(fā)性成分的羅勒種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

張亞嬌　于福來　元超　陳曉鷺　謝小麗　王 凱　黃梅　陳振夏　官玲亮　陳松筆

關鍵詞：羅勒；植物學性狀；揮發(fā)性成分；主成分分析；聚類分析

中圖分類號：Q949.95 文獻標志碼：A

羅勒（Ocimum basilicum）為唇形科羅勒屬植物，全世界約有65～150 種[1-2]，廣泛分布于熱帶與亞熱帶地區(qū)。羅勒不僅作為一種天然的香辛料，還可作為傳統(tǒng)藥物具有疏風解表、化濕和中、強心安神、行氣活血、解毒消腫、散瘀止痛等功效[3]，享有“藥草女王”之稱[4]。由于羅勒屬植物易發(fā)生種間雜交和多倍體化，使羅勒屬的分類學極其復雜，常出現(xiàn)同名異物或同物異名的現(xiàn)象，造成羅勒資源無法得到有效利用，使羅勒種質(zhì)和新品種選育較困難。因此，對羅勒種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，將對羅勒種質(zhì)資源的挖掘與創(chuàng)新以及提高育種效率具有重要意義。

目前，關于羅勒屬植物的分類大多數(shù)是基于葉、花及顏色等形態(tài)特征進行分類，而形態(tài)特征的表達往往受植株發(fā)育及環(huán)境條件的影響，PATEL 等[5]對印度南北2 種不同農(nóng)業(yè)氣候條件下的不同羅勒品種的表型性狀和產(chǎn)量進行比較試驗，發(fā)現(xiàn)不同羅勒品種表型性狀以及精油產(chǎn)量差異顯著，證實了羅勒屬具有基因型響應環(huán)境變化而改變性狀表達的能力。為了便于分類，LAWRENCE[6]以及GRAYER 等[7]提出了一種基于揮發(fā)油的標準化描述系統(tǒng)，根據(jù)占主導地位的揮發(fā)性芳香化合物或含量大于20%的組分，對羅勒進行了“化學型”分類。TANGPAO 等[8]采用水蒸氣蒸餾法提取泰國5 種常見羅勒精油，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術（GC-MS）得出其主要成分為芳樟醇、丁香酚和甲基丁香酚，并將其氣味特征分為柑橘類和香料類。TELCI 等[9]同樣采用以上方法和技術對土耳其18 個羅勒品種進行研究，發(fā)現(xiàn)其主要成分為芳樟醇、肉桂酸甲酯、甲基丁香酚、檸檬醛、甲基胡椒酚。宋佳昱等[10]從我國綠羅勒、萵苣羅勒和大葉羅勒的精油中分別鑒定出40、26、36 種成分，其中綠羅勒和大葉羅勒的主要成分為芳樟醇（68.07%、66.93%），萵苣羅勒的主要成分為桉樹腦（56.29%）。以上研究表明羅勒的揮發(fā)性成分在不同基因資源間存在顯著差異，同時也有部分受到環(huán)境影響。目前對于羅勒種質(zhì)資源遺傳多樣性分析大多是針對單一表型性狀或是揮發(fā)性成分進行單獨分析，鮮有將二者結合起來的研究報道，這導致了資源評價及鑒定的不確定性。

本研究在對收集的15 份羅勒種質(zhì)資源進行植物學性狀考察的基礎上，通過GC-MS 技術對其葉片的揮發(fā)性成分進行檢測，同時結合相對氣味活度值（ROAV）分析并確定不同羅勒種質(zhì)的關鍵特征揮發(fā)性物質(zhì)，即“化學型”，以期從外觀性狀和理化特征的層面對羅勒資源的遺傳多樣性進行分析，為羅勒種質(zhì)資源評價體系的建立奠定基礎，也為羅勒屬的分類鑒別及特異種質(zhì)選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試種質(zhì)栽培于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所南藥圃，種質(zhì)信息見表1。

主要儀器及試劑：電子游標卡尺、鋼尺、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫科技有限公司）、HP-5MS 色譜柱、超聲波清洗儀、分析天平、研缽、離心機，無水硫酸鈉、正己烷。

1.2 方法

1.2.1 羅勒植物學性狀調(diào)查 于2022 年6 月晴天上午10：00—12：00 選取同時播種、水肥管理條件一致、無病蟲害的15 份羅勒種質(zhì)，每份種質(zhì)選取3 株，觀測并記錄其地上部主要性狀（包括株高、株幅、分枝數(shù)、葉長、葉寬、莖粗、葉片形狀、葉脈顏色及葉片平整度）。葉片均選擇長勢良好、無病蟲害的成熟葉片進行采集，采后立即放入冰盒中，備用。

1.2.2 樣品預處理 將采集的新鮮葉片用蒸餾水清洗并擦拭干凈，稱取1.00 g 葉片剪碎，冰浴充分研磨，轉入50 mL 離心管中，準確加入25 mL正己烷，超聲30 min（50 ℃， 70 w），并加入適量無水硫酸鈉過夜以除去水分，10 000 r/min 離心5 min，吸取1.5 mL 上清液，過濾轉移至色譜瓶中用于GC-MS 分析。

1.2.3 GC-MS 分析 色譜條件：色譜柱HP-5MS彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為高純氦氣，載氣流速為1.0 mL/min，進樣量為1 μL，進樣口溫度為220 ℃，進樣方式為不分流進樣。升溫程序：以60 ℃為起始溫度，保持5 min，6 ℃/min 升至240 ℃，保持5 min。質(zhì)譜條件：EI 源，溶劑延遲5 min，離子源溫度為230 ℃，掃描范圍45～500 amu。

1.2.4 ROAV 值計算 參照劉登勇等[11]的方法，結合香氣閾值，使用相對氣味活度值（ROVA）確定羅勒的關鍵香氣化合物。ROAV 值計算公式為： ROAVi=[（Ci/C_max）×（T_max/T_i）]×100 。式中，ROAVi 為羅勒各揮發(fā)性化合物的相對氣味活度值；Ci 為羅勒各揮發(fā)性化合物的相對百分含量；C_max 為羅勒整體香氣貢獻最大揮發(fā)性化合物的相對百分含量；T_i 為各揮發(fā)性成分對應的香氣閾值；T_max為羅勒總體香氣貢獻最大對應的香氣閾值。所有化合物的ROAV≤100，其中，1≤ROAV≤100的化合物為關鍵香氣化合物，0.1≤ROAV＜1 為重要修飾關鍵香氣化合物。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0 和Excel 2010 軟件對羅勒植物學性狀進行整理及單因素方差分析（ANOVA）。將得到的質(zhì)譜圖通過NIST 數(shù)據(jù)庫比對確定化合物（匹配度≥80%），按照氣相色譜峰面積歸一化法計算各揮發(fā)性成分的相對含量，采用Origin 21 和SPSS 21.0 軟件進行主成分分析及聚類分析[12-13]。

2 結果與分析

2.1 不同羅勒種質(zhì)植物學性狀分析

形態(tài)學研究是利用物種表型特征作為研究生物遺傳多樣性的方法之一，具有操作簡單、觀測直接等特點[14]。從表2 可以看出，不同羅勒種質(zhì)的株高、株幅、葉長、葉寬及莖粗差異較大，15份羅勒種質(zhì)的株高分布范圍為（30.2±1.79）～（56.2±7.19）cm。其中，肉桂羅勒和大葉羅勒顯著高于九層塔羅勒、檸檬羅勒、托斯卡納羅勒等種質(zhì)。株幅范圍在（11.4±1.34）～（32.2±2.28）cm 之間，紫黑蛋白石羅勒和茴香羅勒顯著大于熱那亞羅勒、甜羅勒、泰國羅勒等種質(zhì)。不同羅勒種質(zhì)葉片的長、寬差異較大，葉長范圍為（2.1±0.26）～（11.7±1.51）cm，葉寬在（1.4±0.23）～（10.2±2.18）cm 之間，其中，托斯卡納羅勒的葉長和葉寬均顯著高于其他種質(zhì)。莖粗范圍在（3.2±0.27）～（6.3±0.25）mm 之間，紫黑蛋白石羅勒的莖粗值最大。不同羅勒種質(zhì)的分枝數(shù)差異較小，僅甜羅勒和紅魯賓羅勒的分枝數(shù)顯著大于冥王星羅勒和檸檬羅勒。

2.2 不同羅勒種質(zhì)葉片的揮發(fā)性成分分析

通過GC-MS 聯(lián)用技術對15 份羅勒種質(zhì)的揮發(fā)性成分進行檢測與分析，結果顯示：15 份羅勒種質(zhì)共檢測出104 種化合物（圖1），采用峰面積歸一化法計算各揮發(fā)性成分的相對含量（表3，表中僅體現(xiàn)含量在2.00%以上的化合物），發(fā)現(xiàn)不同羅勒種質(zhì)葉片的揮發(fā)性成分及含量存在一定差異。就成分數(shù)量而言，大葉羅勒和熱那亞羅勒的化合物數(shù)量最多，分別鑒定出36 種和35 種；而紅魯賓羅勒和紫黑蛋白石羅勒的化合物數(shù)量最少，分別鑒定出13 種和14 種。由此可見不同羅勒種質(zhì)的化合物數(shù)量差異較大。

15 份羅勒種質(zhì)的揮發(fā)性成分中含有烷烴類37 種，萜烯類物質(zhì)32 種，此外還包括酯類8 種，酚類5 種，醇類4 種，醛類3 種，醚類1 種，其他類物質(zhì)14 種，相對含量占總揮發(fā)性成分的79.29%～96.39%。所有材料中共有揮發(fā)性成分有2種，分別為2，4-二叔丁基酚和正十七烷，相對含量分別為0.72%～8.26%、0.44%～5.11%。由圖2可知，15 份羅勒種質(zhì)的不同類型化合物的相對含量存在差異，其中酚類化合物含量比較高的羅勒種質(zhì)有九層塔羅勒、大葉羅勒、熱那亞羅勒和紅魯賓羅勒，相對含量在43.97%～61.16%之間；醚類化合物含量較高的種質(zhì)有甜羅勒、暹羅皇后羅勒、泰國羅勒和茴香羅勒，相對含量在51.55%～87.95%之間。萜烯類化合物含量較高的種質(zhì)是托斯卡納羅勒（39.87%）和紫夜羅勒（33.69%），醛類化合物含量較高的種質(zhì)是檸檬羅勒（59.02%）和丁香羅勒（60.22%），紫黑蛋白石羅勒的醇類化合物含量（37.73%）最高，肉桂羅勒的酯類化合物含量（77.97%）最高，冥王星羅勒的烷烴類化合物含量（33.14%）最高。雖然萜烯類和烷烴類化合物種類數(shù)量多，但在羅勒種質(zhì)中的相對含量不一定最高。

不同羅勒種質(zhì)葉片的主要揮發(fā)性成分也存在一定差異。15 份羅勒種質(zhì)材料中，九層塔羅勒、熱那亞羅勒、紅魯賓羅勒和紫黑蛋白石羅勒的丁香酚含量較高，相對含量分別為58.91%、44.80%、33.68%、28.35%。暹羅皇后羅勒、茴香羅勒、泰國羅勒、甜羅勒和托斯卡納羅勒中的4-烯丙基苯甲醚含量較高，相對含量分別為87.16%、72.87%、71.34%、48.81%、28.24%。檸檬羅勒和丁香羅勒的檸檬醛含量較高，分別為31.05%和29.67%。肉桂羅勒中的肉桂酸甲酯含量最高，為68.19%。大葉羅勒中的2-甲氧基-5-丙-2-烯基苯酚含量最高，為38.11%。紫黑蛋白石羅勒中的芳樟醇含量最高，為30.11%。冥王星羅勒的甲基丁香酚含量最高，為18.15%（表3）。

2.3 不同羅勒種質(zhì)的關鍵香氣化合物分析

為進一步確定不同羅勒種質(zhì)的特征香氣化合物，通過查閱相關文獻參考各香氣化合物閾值，并結合表3 中共有組分的相對含量計算不同羅勒種質(zhì)中的ROAV 值。

由表4 可知，部分羅勒資源表現(xiàn)出相似的氣味，如九層塔羅勒、熱那亞羅勒、甜羅勒以及紫黑蛋白石羅勒的主體香氣物質(zhì)均為丁香酚、芳樟醇和桉葉油醇，賦予其花木香、甜香及樟腦氣味，其中β-石竹烯和4-烯丙基苯甲醚對甜羅勒香氣具有重要修飾作用。此外，紅魯賓羅勒和紫夜羅勒的主體香氣物質(zhì)為丁香酚和芳樟醇，賦予其花木香和甜香等氣味，其中羅勒烯為紫夜羅勒的重要香氣修飾物質(zhì)；順式-檸檬醛作為丁香羅勒和檸檬羅勒的主體香氣物質(zhì)，賦予其檸檬氣味，且檸檬醛對其香氣均有重要修飾作用。

也有一些羅勒種質(zhì)具有特殊的氣味，如芳樟醇和肉桂酸甲酯為肉桂羅勒中的主體香氣物質(zhì)；大葉羅勒的主體香氣物質(zhì)為芳樟醇、桉葉油醇、α-芹子烯和冰片，因此具有花木香、樟腦及丁香氣味，β-石竹烯、2，4-二叔丁基酚等則對其香氣具有重要修飾作用。此外，冥王星羅勒中以丁香酚、甲基丁香酚、萘以及桉葉油醇為主要香氣物質(zhì)，具有花木香、甜香及樟腦等氣味，α-律草烯為主要香氣修飾物質(zhì)；暹羅皇后羅勒中以β-羅勒烯、甲基丁香酚、4-烯丙基苯甲醚等為主體香氣物質(zhì)，具有柑橘香、花木香以及青草香等氣味，樟腦為重要香氣修飾物質(zhì)；順式-檸檬醛、芳樟醇以及α-芹子烯作為茴香羅勒中的主體香氣物質(zhì)，具有檸檬香、花木香及丁香等氣味。

2.4 不同羅勒種質(zhì)揮發(fā)性物質(zhì)主成分分析

利用Origin 2021 軟件對15 份羅勒種質(zhì)揮發(fā)性成分進行主成分分析，PC1、PC2、PC3 的方差貢獻率依次為52.83%、18.61%、13.60%，累計貢獻率達85.04%（表5），說明這3 個主成分可以解釋揮發(fā)性成分的大部分信息，因此可用于鑒別不同羅勒種質(zhì)揮發(fā)性成分的差異性。由圖3 可知，15 份羅勒種質(zhì)被大致劃分為5 類，其中九層塔羅勒、熱那亞羅勒、紫黑蛋白石羅勒、紅魯賓羅勒以及紫夜羅勒劃分為一類，并以丁香酚（B42）及芳樟醇（B34）為主要成分。第二類為甜羅勒、泰國羅勒、茴香羅勒及暹羅皇后羅勒，以4-烯丙基苯甲醚（B53）為主要成分。第三類為冥王星羅勒、大葉羅勒及托斯卡納羅勒，以3，7，11-三甲基-1，3，6，10-十二碳-四烯（B23）、2-甲氧基-5-丙-2-烯基苯酚（B41）為主要成分。第四類為丁香羅勒及檸檬羅勒，以檸檬醛（B38）和順式-檸檬醛（B37）為主要成分。第五類為肉桂羅勒，主要成分為肉桂酸甲酯（B45）。結果表明，不同羅勒種質(zhì)的揮發(fā)性物質(zhì)組成差異顯著。

2.5 不同羅勒種質(zhì)揮發(fā)性成分及表型性狀聚類分析

植物學性狀和化學成分的組成一直是研究植物種質(zhì)資源多樣性的主要技術指標。由于羅勒的整體香氣除含量外，還取決于單體成分的香氣閾值，即使含量低的揮發(fā)性物質(zhì)，如果香氣閾值較低，也會對羅勒整體香氣貢獻較大，因此本研究對供試材料檢測到的所有揮發(fā)性成分以及表型性狀進行系統(tǒng)聚類分析（圖4）。其中，基于揮發(fā)性成分的聚類分析表明（圖4A），當歐氏距離為20時，可將15 份種質(zhì)分為3 個大類，第Ⅰ類由泰國羅勒、茴香羅勒、暹羅皇后羅勒及甜羅勒組成，該類以4-烯丙基苯甲醚為主要化合物；肉桂羅勒單獨聚為第Ⅲ類，該種質(zhì)中肉桂酸甲酯含量最高，而其他羅勒種質(zhì)中均不含該化合物；其余羅勒種質(zhì)全部聚為第Ⅱ大類。當距離為10 時，可進一步將第Ⅱ大類分為3 個亞類，其中九層塔羅勒、熱那亞羅勒、紅魯賓羅勒、紫夜羅勒和紫黑蛋白石羅勒聚為Ⅰ亞類，該組種質(zhì)中的芳樟醇和丁香酚含量較高；檸檬羅勒和丁香羅勒聚為Ⅱ亞類該組種質(zhì)中的檸檬醛含量較高；其余3 份種質(zhì)聚為Ⅲ亞類，這組種質(zhì)中的烷烴類含量較高。該結果與主成分分析結果基本一致。

植物學表型性狀聚類分析表明（圖4B），當歐氏距離為10 時，15 份羅勒種質(zhì)可分為3 大類，第Ⅰ類為冥王星羅勒，該種質(zhì)葉片小，植株矮小，顯著小于其他羅勒種質(zhì)；第Ⅱ類為丁香羅勒、茴香羅勒以及紫黑蛋白石羅勒，該組種質(zhì)的株高、株幅及分枝數(shù)較高，但葉長和葉寬較?。黄溆?1份種質(zhì)聚為第Ⅲ類。當距離為5 時，可將第Ⅲ大類進一步分為3 個亞類，泰國羅勒聚為Ⅰ亞類，該種質(zhì)株幅、葉長、葉寬及莖粗均較?。淮笕~羅勒和肉桂羅勒被聚為Ⅱ亞類，該組種質(zhì)的株高顯著高于其他種質(zhì)；其余8 份種質(zhì)被聚為Ⅲ亞類，該組種質(zhì)的植物學性狀整體介于泰國羅勒、大葉羅勒以及肉桂羅勒之間。結果表明，不同羅勒資源間存在豐富的遺傳多樣性，可以通過植物學性狀和活性成分將其進行區(qū)分。但由于分類的角度不同，聚類的結果有所差異，外觀性狀相似的品種，其活性成分也可能會存在較大差異。因此，通過外觀性狀作為指標較難篩選特殊活性成分的羅勒種質(zhì)。

3 討論

羅勒分布范圍廣，應用歷史悠久，經(jīng)過幾個世紀的人工栽培，由于種間雜交和多倍體育種等引起了遺傳結構的改變，并且隨著特定地區(qū)物候因子的變化，使羅勒在顏色、葉片形狀和大小等表型性狀上的多樣性愈加明顯[16]。本研究通過調(diào)查15 份羅勒種質(zhì)的主要植物學性狀，發(fā)現(xiàn)不同羅勒種質(zhì)的株高、株幅、葉長、葉寬及莖粗存在顯著差異，這與ERUM 等[17]和PATEL 等[5]的研究結果一致。本研究中供試材料的葉片形狀大多為卵狀披針形或卵形，顏色有綠色和翠綠色。紅魯賓羅勒、紫黑蛋白石羅勒和紫夜羅勒的葉脈顏色為紫色，極具觀賞價值。此外，托斯卡納羅勒的葉片表現(xiàn)出明顯的褶皺。由此可以看出，供試羅勒種質(zhì)的植物學性狀存在明顯的遺傳多樣性，可以通過自交或雜交手段獲得一批藥、食、觀賞為一體的羅勒品系。

羅勒活性物質(zhì)的組成受基因型和環(huán)境共同作用。RODRIGUES 等[18]檢測出巴西甜羅勒的揮發(fā)性成分主要為4-烯丙基苯甲醚（60.96%）和芳樟醇（27.27%），與本研究結果基本一致，但引種后其含量略有減少，分別為48.81%和11.59%。BEATOVIC 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在塞爾維亞種植的暹羅皇后羅勒的主要揮發(fā)性成分為4-烯丙基苯甲醚（83.60%），引種后其主要成分種類未發(fā)生改變，而含量有所增加，達87.16%，說明甜羅勒和暹羅皇后羅勒的揮發(fā)性活性物質(zhì)的種類和含量主要受基因型控制，環(huán)境對其含量略有影響。同時，研究中也發(fā)現(xiàn)少量羅勒品種的關鍵成分受環(huán)境影響較大，如丁香羅勒在肯尼亞東部地區(qū)檢測到的主要揮發(fā)性物質(zhì)為丁香酚（68.81%）和甲基丁香酚（13.21%）[20]，而本研究中丁香羅勒的主要揮發(fā)性化合物為檸檬醛（29.67%） 和順式-檸檬醛（24.40%）。除此之外，本研究中的暹羅皇后羅勒、茴香羅勒、泰國羅勒中含有的4-烯丙基苯甲醚以及肉桂羅勒含有的肉桂酸甲酯的相對含量均在70%以上，因此可以對這些特異種質(zhì)進行差異化育種，為后續(xù)羅勒的特殊應用與開發(fā)，以及關鍵單體活性物質(zhì)的提取提供參考。

為體現(xiàn)和描述芳香植物的香氣類型，里奧·范海默特[15]研究發(fā)現(xiàn)，香氣成分的含量和閾值是影響人類感知植物香氣的2 個主要影響因素。目前，通過計算相對氣味活度值（ROAV）來描述植物的具體香氣表現(xiàn)已在玫瑰[21]、茶葉[22-23]、刺槐[24]等植物中得以較好的應用。羅勒被譽為“香草皇后”，但目前尚無香氣類型分析的研究報道。本研究通過ROAV 分析發(fā)現(xiàn)，大部分羅勒種質(zhì)的主體香氣物質(zhì)均含有芳樟醇，具有一定的花木香及甜香氣味。此外，15 份羅勒種質(zhì)的揮發(fā)性成分含量較高的化合物其閾值也較低，對羅勒的香氣貢獻較大，總體鑒定出8 種香氣類型，如丁香酚/芳樟醇型、丁香酚/芳樟醇/桉葉油醇型以及順式-檸檬醛型，為羅勒特異種質(zhì)在化妝品、食品以及醫(yī)藥等領域的應用提供參考。

基于植物性狀和揮發(fā)性成分進行聚類分析表明，2 種方式的聚類結果有差異。通過植物學性狀聚類把丁香羅勒、茴香羅勒以及紫黑蛋白石羅勒聚為一類，這些種質(zhì)具有相似的外觀性狀，如株高、株幅以及分枝數(shù)較大，葉長、葉寬較??；而通過揮發(fā)性成分的聚類卻將外觀性狀相似的羅勒種質(zhì)分別聚在3 個不同的大類，3 種羅勒的主要揮發(fā)性成分分別為檸檬醛和順式檸檬醛、4-烯丙基苯甲醚、芳樟醇和丁香酚。究其原因，主要是由于羅勒屬植物易于種間或種內(nèi)雜交，外觀性狀與活性成分連鎖不緊密，因此相似的外觀性狀可能存在較大的活性成分差異。但總體來看，不管是基于哪種方法，都可以把15 份種質(zhì)進行完全區(qū)分。結果表明供試羅勒種質(zhì)的遺傳差異較大，存在豐富的遺傳多樣性，可為后期羅勒的雜交育種或聚合育種提供基礎材料與理論依據(jù)。