tRF-1:30對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響

基金項(xiàng)目：江蘇省醫(yī)學(xué)會(huì)兒科醫(yī)學(xué)科研專(zhuān)項(xiàng)基金項(xiàng)目（SYH-32034-0073，SYH-32034-0085）；南京市衛(wèi)生科技發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（YKK23209，YKK23288，YKK23289）

作者單位：1南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院兒科（郵編210003）；2南京醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院兒科

作者簡(jiǎn)介：夏雨薇（2000），女，碩士在讀，主要從事小兒腎臟疾病診治及機(jī)制方面研究。E-mail：13218006127@163.com

△通信作者 E-mail：weihuagan@njmu.edu.cn

摘要：目的 探討tRF-1：30（tRF-1：30-Gln-CTG-4）對(duì)高糖（HG）誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞（RTECs）中炎性因子表達(dá)的影響及分子機(jī)制。方法 將小鼠RTECs分為Control組、HG組、HG+tRF-1：30 mimic組、HG+tRF-1：30 NC組、HG+si-IKZF2組（IKAROS家族鋅指2，tRF-1：30抑制劑）、HG+si-NC組。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)tRF-1：30、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和IKZF2 mRNA的水平。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)炎性因子水平，Western blot檢測(cè)IKZF2蛋白表達(dá)水平，雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證tRF-1：30和IKZF2的關(guān)系。結(jié)果 在HG誘導(dǎo)的RTECs中炎性因子的表達(dá)水平顯著升高，而tRF-1：30表達(dá)水平顯著降低。過(guò)表達(dá)tRF-1：30顯著降低HG誘導(dǎo)的RTECs中炎性因子的表達(dá)水平。IKZF2在HG誘導(dǎo)的RTECs中顯著高表達(dá)，進(jìn)一步敲低IKZF2可抑制炎性因子的釋放，而過(guò)表達(dá)tRF-1：30后IKZF2的表達(dá)水平下調(diào)。雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證tRF-1：30與IKZF2可能存在靶向關(guān)系。結(jié)論 過(guò)表達(dá)tRF-1：30可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控IKZF2的表達(dá)進(jìn)而抑制HG誘導(dǎo)的RTECs炎性因子的釋放。

關(guān)鍵詞：糖尿病腎??；端粒重復(fù)序列結(jié)合蛋白質(zhì)1；tRF-1：30-Gln-CTG-4；腎小管上皮細(xì)胞；炎性因子；IKAROS家族鋅指2

中圖分類(lèi)號(hào)：R587.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20240046

Effect of tRF-1：30 on the expression of inflammatory factors in renal tubular epithelial cells induced by high glucose

XIA Yuwei1， QIAO Yunyang1， LIU Xuewei1， SHI Huimin1， QU Gaoting1， ZHANG Aiqing2， GAN Weihua1△

1 Department of Pediatric Nephrology， the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University， Nanjing 210003， China; 2 Department of Pediatric Nephrology， the Fourth Affiliated Hospital of Nanjing Medical University

△Corresponding Author E-mail： weihuagan@njmu.edu.cn

Abstract： Objective To investigate the effect and molecular mechanism of tRF-1：30-Gln-CTG-4 （tRF-1：30） on the expression of inflammatory factors in high glucose （HG）-induced renal tubular epithelial cells （RTECs）. Methods RTECs were divided into the control group， the HG group， the HG+tRF-1：30 mimic group， the HG+tRF-1：30 negative control （NC） group， the HG+si-IKZF2 group and the HG+si-NC group. Real-time quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR） was used to detect the expression levels of tRF-1：30， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-6 （IL-6）， monocyte chemoattractant protein-1 （MCP-1） and IKAROS family zinc finger protein 2 （IKZF2）. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect levels of TNF-α， IL-6 and MCP-1. Protein expression of IKZF2 was detected by Western blot assay. Dual-luciferase reporter assay was used to detect the targeting relationship between tRF-1：30 and IKZF2. Results The expression levels of inflammatory factors were elevated in HG-induced RTECs， and the expression level of tRF-1：30 was decreased （P＜0.05）. Overexpression of tRF-1：30 significantly decreased expression levels of inflammatory factors in HG-induced RTECs （P＜0.05）， and the expression level of IKZF2 was significantly increased （P＜0.05）. Further knockdown of IKZF2 can inhibit the release of inflammatory factors， and the expression level of IKZF2 was down-regulated after overexpression of tRF-1：30. Double luciferase reporting experiment further verified the possible targeting relationship between tRF-1：30 and IKZF2. Conclusion Overexpression of tRF-1：30 inhibits the expression of inflammatory factors in HG-induced RTECs by target binding and negatively regulating the expression of IKZF2.

Key words： diabetic nephropathies; telomeric repeat binding protein 1; tRF-1：30-Gln-CTG-4; renal tubular epithelial cells; inflammatory factors; IKAROS family zinc finger protein 2

糖尿病腎病（DKD）是慢性腎臟病的一種重要類(lèi)型［1］，腎小管上皮細(xì)胞（RTECs）損傷是DKD的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［2］。腎小管間質(zhì)炎癥在DKD的進(jìn)展中起重要作用，RTECs在炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用［3］。因此，研究高糖（HG）條件下RTECs炎性因子的表達(dá)改變對(duì)探索DKD損傷的機(jī)制有重大意義。轉(zhuǎn)運(yùn)RNA的衍生片段（tRFs）是一類(lèi)新興的非編碼RNA。有研究揭示tRF-3022b可能通過(guò)與半乳糖凝集素1和巨噬細(xì)胞遷移抑制因子結(jié)合來(lái)影響結(jié)直腸癌的腫瘤生長(zhǎng)和M2巨噬細(xì)胞極化［4］。這些研究表明tRFs具有重要的臨床意義，可能構(gòu)成調(diào)節(jié)病理過(guò)程的新型分子治療靶點(diǎn)［5］。然而，tRFs在各種腎臟疾病中的作用卻鮮有報(bào)道。本課題組前期采用高通量測(cè)序技術(shù)，通過(guò)HG誘導(dǎo)RTECs，篩選出多條差異表達(dá)的tRFs，在表達(dá)下調(diào)的tRFs中選取tRF-1：30-Gln-CTG-4（tRF-1：30）進(jìn)行了表達(dá)水平驗(yàn)證，同時(shí)證實(shí)其參與了RTECs損傷；并利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)IKAROS家族鋅指2（IKZF2）基因可能是tRF-1：30的作用靶點(diǎn)，推測(cè)tRF-1：30對(duì)RTECs損傷的影響可能與IKZF2有關(guān)［6］。本研究旨在探索tRF-1：30對(duì)HG誘導(dǎo)的RTECs中炎性因子表達(dá)的影響及機(jī)制是否與IKZF2有關(guān)，以便為臨床防治DKD尋求新的線(xiàn)索。

1 材料與方法

1.1 主要材料 本實(shí)驗(yàn)所用小鼠RTECs購(gòu)自北納生物。細(xì)胞培養(yǎng)所使用的F12培養(yǎng)液、胎牛血清、胰酶及磷酸鹽緩沖液均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；tRF-1：30 mimic及相應(yīng)的陰性對(duì)照（NC）、IKZF2 siRNA及相應(yīng)NC、轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）相關(guān)試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；PCR引物由南京銳真生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成并驗(yàn)證；蛋白提取及定量相關(guān)試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；蛋白免疫印跡（Western blot）實(shí)驗(yàn)相關(guān)耗材購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；兔源IKZF2一抗、鼠源GAPDH一抗、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗購(gòu)自中國(guó)Affinity Biosciences LTD公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒和雙螢光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢亞科因生物技術(shù)有限公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；Lightcycler 480Ⅱ型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Roche公司；ELX800型全自動(dòng)吸收光酶標(biāo)儀、CHDMIDOC型凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美Bio-Rad公司；CKX31型倒置顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 使用含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠RTECs并置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每隔1～2 d更換37 ℃預(yù)熱新鮮培養(yǎng)液1次。鏡下觀察細(xì)胞鋪至滿(mǎn)視野時(shí)進(jìn)行傳代鋪板，鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)30%～50%，更換無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h使細(xì)胞同步化。細(xì)胞分組及處理：Control組（正常培養(yǎng)的RTECs）、HG組（35 mmol/L葡萄糖干預(yù)）、HG+tRF-1：30 mimic組（轉(zhuǎn)染tRF-1：30 mimic）、HG+tRF-1：30 NC組（轉(zhuǎn)染tRF-1：30 NC）；HG+si-NC組（轉(zhuǎn)染si-NC）、HG+si-IKZF2組（轉(zhuǎn)染si-IKZF2）。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RTECs接種至6孔板，置于條件為37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)至密度達(dá)30%～50%時(shí)，按轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明書(shū)配制濃度為20 nmol/L轉(zhuǎn)染復(fù)合物，依據(jù)不同實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)方式需要干預(yù)24 h后收集細(xì)胞以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)tRF-1：30及炎性因子mRNA表達(dá)水平 使用TRIzol試劑裂解并提取各組細(xì)胞的總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度和純度，260/280 nm光密度比值保持在1.8～2.0。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用RT-qPCR法檢測(cè)tRF-1：30及炎性因子TNF-α、IL-6、MCP-1、IKZF2 mRNA表達(dá)水平，引物序列見(jiàn)表1。依據(jù)熔解曲線(xiàn)進(jìn)行產(chǎn)物的特異性分析。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)。以U6、β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。[基因

名稱(chēng) 引物序列（5′→3′） 產(chǎn)物

大小/bp TNF-α 上游：CCTTATCTACTCCCAGGTTCTC 109 下游：GAGGCTGACTTTCTCCTGGTATG IL-6 上游：CTGCAAGAGACTTCCATCCAG 131 下游：AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG MCP-1 上游：TAAAAACCTGGATCGGAACCAAA 115 下游：GCATTAGCTTCAGATTTACGGGT IKZF2 上游：AAGGGGAACACGCCAATATGG 135 下游：GCTGCCTGTCACACTCTTCA β-actin 上游：CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC 171 下游：ATGGAGCCACCGATCCACA tRF-1：30 上游：GGTTCCATGGTGTAATGGTGAGCACTCTGG 220 下游：ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC U6 上游：CTCGCTTCGGCAGCACATATACT 93 下游：ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC ][Tab.1 Sequences of RT-qPCR primers

表1 RT-qPCR引物序列]

1.2.4 Western blot檢測(cè)IKZF2蛋白表達(dá)水平 使用加入蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白。細(xì)胞刷刮下細(xì)胞并收集懸液至1.5 mL EP管中，在4 ℃下以12 000×g 離心30 min，取上清液，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度并制備蛋白樣本。制備好的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉于室溫下封閉2 h，清洗后分別加入稀釋好的GAPDH、IKZF2一抗（1∶1 000），在4 ℃孵育過(guò)夜。次日，復(fù)溫并使用TBST充分洗膜后加入稀釋好的二抗（1∶3 000），" "室溫下置于搖床孵育1 h，再次洗膜，加入ECL顯色液并置于凝膠成像儀下曝光條帶。Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 ELISA檢測(cè)炎性因子水平 收集各組細(xì)胞，1 000×g離心20 min后收集上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，以空白組調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)處依序測(cè)量各孔的吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣本TNF-α、IL-6、MCP-1濃度。每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證tRF-1：30與IKZF2間的關(guān)系 通過(guò)TargetScan在線(xiàn)網(wǎng)站（https：//www.targetscan.org/）預(yù)測(cè)tRF-1：30和IKZF2有無(wú)結(jié)合位點(diǎn)。將tRF-1：30 NC、tRF-1：30 mimic分別與野生型（wild type，WT）IKZF2、突變型（mutant，MUT）IKZF2兩兩組合轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，設(shè)為tRF-1：30 NC+WT-IKZF2組、tRF-1：30 NC+MUT-IKZF2組、tRF-1：30 mimic＋WT-IKZF2組、tRF-1：30 mimic+MUT-IKZF2組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，檢測(cè)并計(jì)算各組細(xì)胞螢光素酶相對(duì)活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 9.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差[（[x] ±s）

]表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 tRF-1：30和炎性因子在HG誘導(dǎo)的RTECs中的表達(dá)水平 與Control組相比，HG組TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，tRF-1：30 mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05），見(jiàn)表2。[組別 mRNA TNF-α IL-6 MCP-1 tRF-1：30 Control組 1.01±0.09 1.00±0.14 0.99±0.08 1.02±0.08 HG組 2.47±0.29 2.68±0.35 2.01±0.28 0.27±0.06 t 8.228＊＊ 7.690＊＊ 6.126＊＊ 13.300＊＊ ][組別 蛋白/（ng/L） TNF-α IL-6 MCP-1 Control組 70.33±8.67 42.33±5.20 30.67±5.16 HG組 202.50±26.47 165.50±20.42 65.17±4.73 t 8.224＊＊ 10.120＊＊ 8.538＊＊ ][Tab.2 Expression levels of tRF-1：30 and inflammatory factors in the control group and the HG group

表2 Control組和HG組細(xì)胞tRF-1：30和

炎性因子表達(dá)水平][ ＊＊P＜0.01。][（n=3，[x] ±s）

]

2.2 過(guò)表達(dá)tRF-1：30對(duì)HG誘導(dǎo)的RTECs炎性因子表達(dá)的影響 與HG組、HG+tRF-1：30 NC組相比，HG+tRF-1：30 mimic組tRF-1：30 mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05）。HG+tRF-1：30 NC組tRF-1：30 mRNA表達(dá)水平較HG組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與HG組、HG+tRF-1：30 NC組相比，HG+tRF-1：30 mimic組TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），見(jiàn)表3。

2.3 IKZF2在HG誘導(dǎo)的RTECs中的表達(dá)情況 與Control組相比，HG組細(xì)胞IKZF2 mRNA（1.48±0.22 vs. 1.00±0.05，t=3.593，P＜0.05）和蛋白（1.48±0.05 vs. 1.00±0.05，t=11.780，P＜0.01）表達(dá)水平均升高，見(jiàn)圖1。lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image2_2.pnggt;[Control組][HG組][IKZF2][56 ku][36 ku][GAPDH][Fig.1 Detection of IKZF2 expression in HG-induced RTECS by Western blot assay

圖1 Western blot檢測(cè)IKZF2在HG誘導(dǎo)的RTECS中的表達(dá)情況]

2.4 敲低IKZF2對(duì)HG誘導(dǎo)的RETCs炎性因子表達(dá)的影響 與HG組、HG+si-NC組比較，HG+si-IKZF2組IKZF2及炎性因子TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低，見(jiàn)圖2，表4、5。lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image3_2.pnggt;[A][B][C][D][IKZF2][GAPDH][56 ku][36 ku][A：Control組；B：HG組；C：HG+si-IKZF2組；D：HG+si-NC組。

Fig.2 IKZF2 protein expression level detected by Western blot assay

圖2 Western blot檢測(cè)IKZF2蛋白表達(dá)水平

][組別 IKZF2蛋白 IKZF2 mRNA Control組 1.00±0.05 1.00±0.09 HG組 1.45±0.01a 1.53±0.06a HG+si-NC組 1.41±0.02a 1.53±0.11a HG+si-IKZF2組 0.65±0.11bc 0.19±0.03bc F 376.400＊＊ 191.400＊＊ ][Tab.4 Comparison of the relative expression levels of IKZF2 protein and mRNA between the four groups

表4 各組IKZF2蛋白和mRNA相對(duì)

表達(dá)量比較][ ＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與HG組比較，c與HG+si-NC組比較，P＜0.05。][（n=3，[x] ±s）

][組別 mRNA TNF-α IL-6 MCP-1 Control組 1.00±0.05 1.02±0.12 1.05±0.10 HG組 1.93±0.15a 1.68±0.14a 1.53±0.06a HG+si-NC組 1.90±0.10a 1.70±0.10a 1.56±0.14a HG+si-IKZF2組 0.46±0.06bc 0.63±0.10bc 0.47±0.21bc F 157.000＊＊ 60.760＊＊ 41.500＊＊ ][組別 蛋白/（ng/L） TNF-α IL-6 MCP-1 Control組 70.33±4.04 42.53±6.15 32.30±4.30 HG組 203.70±23.16a 153.90±15.12a 58.86±6.40a HG+si-NC組 197.80±30.48a 148.10±18.40a 66.70±5.59a HG+si-IKZF2組 109.47±26.39bc 70.27±7.76bc 46.33±5.47bc F 24.000＊＊ 57.360＊＊ 12.190＊＊ ][Tab.5 Comparison of mRNA and protein expression levels of inflammatory factors after knockdown of IKZF2 expression between the four groups

表5 敲低IKZF2表達(dá)后各組細(xì)胞炎性因子mRNA及蛋白表達(dá)水平比較][ ＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與HG組比較，c與HG+si-NC組比較，P＜0.05。][（n=3，[x] ±s）

]

2.5 tRF-1：30影響IKZF2并調(diào)控其表達(dá) 與HG組、HG+tRF-1：30 NC組相比，HG+tRF-1：30 mimic組IKZF2的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3、表6。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示，tRF-1：30與IKZF2存在結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖4。在兩個(gè)結(jié)合處進(jìn)行了雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，tRF-1：30與IKZF2-WT載體共轉(zhuǎn)染至RTECs后雙螢光素酶活性降低，而與MUT載體共轉(zhuǎn)染RTECs后雙螢光素酶活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5。lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image4_2.pnggt;[IKZF2][GAPDH][56 ku][36 ku][A][B][C][D][ A：Control組；B：HG組；C：HG+tRF-1：30 mimic組；D：HG+tRF-1：30 NC組。

Fig.3 IKZF2 protein expression level after addition of tRF-1：30 detected by Western blot assay

圖3 Western blot檢測(cè)加入tRF-1：30后IKZF2蛋白表達(dá)水平

][組別 IKZF2 mRNA IKZF2蛋白 Control組 1.02±0.02 0.99±0.04 HG組 2.23±0.29a 1.34±0.12a HG+tRF-1：30 NC組 2.06±0.31 1.53±0.07 HG+tRF-1：30 mimic組 1.54±0.11bc 0.73±0.04bc F 18.910＊＊ 66.600＊＊ ][Tab.6 Effect of tRF-1：30 overexpression on IKZF2 expression induced by high glucose

表6 過(guò)表達(dá)tRF-1：30對(duì)高糖誘導(dǎo)后IKZF2

表達(dá)的影響][ ＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與HG組比較，c與HG+ tRF-1：30 NC組比較，P＜0.05。][（n=3，[x] ±s）

]lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image6_1.pnggt;[tRF-1：30 NC組

tRF-1：30 mimic組][t=3.672

P＜0.05][t=2.283

P＞0.05][1.0][1.5][0.5][0.0][相對(duì)螢光素酶活性][IKZF2-WT][IKZF2-MUT][A]lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image7_1.pnggt;[t=5.032

P＜0.05][t=1.153

P＞0.05][tRF-1：30 NC組

tRF-1：30 mimic組][1.0][1.5][0.5][0.0][相對(duì)螢光素酶活性][IKZF2-WT][IKZF2-MUT][B][ A：結(jié)合位點(diǎn)1相對(duì)螢光素酶活性檢測(cè)；B：結(jié)合位點(diǎn)2相對(duì)螢光素酶活性檢測(cè)。

Fig.5 Results of luciferase reporter gene assay

圖5 螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果]lt;C：＼Users＼Lenovo＼Desktop＼修改備用＼責(zé)編＼2024年-6期＼Image＼image5_1.pnggt;[Fig.4 The nucleic acid base binding sites of IKZF2 and tRF-1：30

圖4 IKZF2和tRF-1：30核酸堿基結(jié)合位點(diǎn)]

3 討論

DKD的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，尚不完全清楚。近年有研究表明，炎癥在DKD的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，多種促炎細(xì)胞因子參與DKD的發(fā)生［7］。腎小管損傷在DKD中起著重要作用，高血糖可以使RTECs釋放多種炎性細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致炎癥的發(fā)生，同時(shí)介導(dǎo)了DKD的發(fā)生和發(fā)展［8-11］。因此，抑制RTECs炎癥的發(fā)生對(duì)治療腎臟相關(guān)疾病具有重要意義。

tRFs以不同方式在癌癥、神經(jīng)退行性疾病、病毒感染等疾病中發(fā)揮重要作用，顯示了它們?cè)诙喾N疾病中都有應(yīng)用的潛力［12］。tRF-36可以通過(guò)調(diào)節(jié)鐵死亡來(lái)促進(jìn)胰腺炎的進(jìn)展［13］；tRF5-AlaCGC可通過(guò)激活p65導(dǎo)致亞砷酸鹽反應(yīng)中IL-8分泌增多［14］，表明tRFs可能與細(xì)胞的炎癥反應(yīng)相關(guān)。有關(guān)tRFs在腎臟疾病方面的研究較少。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，tRF-003634可以通過(guò)降低Toll樣受體家族成員4的mRNA穩(wěn)定性來(lái)減輕足細(xì)胞損傷［15］，也可能作為MAPK通路的下游效應(yīng)分子改善足細(xì)胞凋亡［16］，表明了tRFs在腎臟疾病中有發(fā)揮作用的潛能。然而，tRFs對(duì)RTECs損傷的影響尚不清楚。結(jié)合課題組前期研究成果，本文選擇了tRF-1：30進(jìn)行深入研究，結(jié)果顯示，HG誘導(dǎo)的RTECs中炎性因子TNF-α、IL-6、MCP-1釋放增多，tRF-1：30表達(dá)水平降低，說(shuō)明tRF-1：30可能與腎小管炎性因子的表達(dá)有關(guān)。將tRF-1：30過(guò)表達(dá)后，HG誘導(dǎo)的RTECs中炎性因子TNF-α、IL-6、MCP-1的表達(dá)水平降低；TNF-α是一種Ⅱ型跨膜蛋白，與TNF受體1和受體2結(jié)合參與復(fù)雜的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)；IL-6是促炎細(xì)胞因子，其高表達(dá)可導(dǎo)致RTECs發(fā)生炎癥反應(yīng)；MCP-1是趨化因子家族成員，主要參與單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化、浸潤(rùn)及遷移，促進(jìn)炎癥反應(yīng)［17］。本研究結(jié)果表明tRF-1：30可以抑制HG誘導(dǎo)的RTECs炎癥反應(yīng)。

為進(jìn)一步研究tRF-1：30影響RTECs炎癥損傷的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)tRF-1：30與IKZF2存在結(jié)合位點(diǎn)。有研究表明過(guò)表達(dá)IKZF2可能使細(xì)胞產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子IL-10來(lái)促進(jìn)腫瘤免疫逃逸［18］。另有研究發(fā)現(xiàn)，鋅指蛋白36通過(guò)降低IKZF2的表達(dá)參與炎癥基因的調(diào)控［19］。IKZF2與狼瘡性腎炎亦相關(guān)，可能成為區(qū)分狼瘡性腎炎患者與健康人的生物標(biāo)志物［20］。IKZF2還可調(diào)節(jié)輔助性T細(xì)胞的發(fā)育以介導(dǎo)日本鏈球菌感染的C57BL/6小鼠脾中的免疫反應(yīng)［21］。因此，IKZF2可能參與免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HG誘導(dǎo)的RTECs中IKZF2高表達(dá)，提示IKZF2可能參與了RTECs的損傷過(guò)程；敲低IKZF2可以降低HG誘導(dǎo)的RTECs中炎性因子TNF-α、IL-6、MCP-1的釋放，表明抑制IKZF2的表達(dá)可以緩解HG誘導(dǎo)的RTECs炎癥反應(yīng)。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了IKZF2與tRF-1：30的相互作用靶點(diǎn)，雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)為tRF-1：30與IKZF2之間的靶向調(diào)控關(guān)系提供了證據(jù)，表明tRF-1：30可能通過(guò)調(diào)控IKZF2影響HG誘導(dǎo)的RTECs炎性因子的表達(dá)。

綜上所述，tRF-1：30在HG誘導(dǎo)的RTECs中顯著低表達(dá)，過(guò)表達(dá)tRF-1：30可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控IKZF2表達(dá)水平，進(jìn)而抑制HG誘導(dǎo)的RTECs釋放炎性因子。本研究尚存在不足之處，雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了tRF-1：30與IKZF2之間的結(jié)合，但還無(wú)法驗(yàn)證其是否具有直接的靶向調(diào)控關(guān)系，在tRF-1：30/IKZF2軸中兩者上下游關(guān)系未來(lái)還需進(jìn)一步深入研究加以驗(yàn)證。

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（2024-01-08收稿 2024-02-01修回）

（本文編輯 胡小寧）