NLRP3基因敲減對(duì)高脂高糖飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的影響

黃倩 王卓媛 安梓銘 辛鑫 孫沁梅 茍小軍 胡義揚(yáng) 馮琴

摘要： 目的 探討NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3 （NLRP3） 基因敲減對(duì)高脂高糖誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎 （NASH） 小鼠模型的影響。方法 將44只小鼠隨機(jī)分為正常飲食組 （CON） 20只， 高脂高糖造模組 （HFHC） 24只。造模14周末， 隨機(jī)選取4只HFHC組小鼠進(jìn)行腺相關(guān)病毒9 （AAV9） 尾靜脈注射預(yù)實(shí)驗(yàn)， 4周后驗(yàn)證NLRP3敲減模型是否成功。18周末確認(rèn)敲減成功后， 對(duì)剩余40只小鼠進(jìn)行AAV9一次性尾靜脈注射， 分為CON+NLRP3敲減陰性對(duì)照組 （CON+NLRP3-NC）、 CON+NLRP3敲減組 （CON+NLRP3-KD）、 HFHC+NLRP3-NC及HHFHC+NLRP3-KD組， 每組10只， 繼續(xù)造模6周。24周末取材觀察炎癥小體活化效應(yīng)， 檢測小鼠體質(zhì)量、 肝質(zhì)量、 肝指數(shù)及糖代謝 （空腹血糖、 空腹胰島素及HOMA-IR指數(shù)） 指標(biāo)； 檢測小鼠肝脂質(zhì)含量 （肝組織TG及油紅O染色）、 肝臟炎癥 （血清ALT活性、 HE染色及炎癥相關(guān)基因） 及肝纖維化 （天狼星紅染色及纖維化相關(guān)基因） 指標(biāo)。計(jì)量資料多組間比較使用單因素方差分析， 進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。結(jié)果 與CON+NLRP3-NC組相比， Western Blot結(jié)果提示， HFHC+NLRP3-NC組的NLRP3、 pro-Caspase1、 Caspase1、 ASC及IL-1β蛋白水平均升高， HFHC+NLRP3-KD組均降低 （P值均<0. 05）； HFHC+NLRP3-NC組小鼠體質(zhì)量、 肝質(zhì)量、 肝指數(shù)及糖代謝指標(biāo)均有不同程度升高， HFHC+NLRP3-KD組均顯著改善 （P值均<0. 05）； 在肝脂肪沉積方面， 與CON+NLRP3-NC組相比， HFHC+NLRP3-NC組肝臟TG明顯增高， 油紅O染色顯示大量紅色脂滴， HFHC+NLRP3-KD組肝臟TG及肝脂滴數(shù)量顯著減少 （P值均<0. 01）； 在肝臟炎癥方面， HFHC+NLRP3-NC組血清ALT， 非酒精性脂肪性肝病活動(dòng)度 （NAS） 評(píng)分及炎癥相關(guān)基因均較CON+NLRP3-NC組明顯升高， HFHC+NLRP3-KD組均明顯降低 （P值均<0. 01）； 在肝纖維化方面， HFHC+NLRP3-NC組肝膠原纖維面積以及纖維化相關(guān)基因均較CON+NLRP3-NC組明顯升高， HFHC+NLRP3-KD組纖維化相關(guān)基因均明顯降低 （P值均<0. 05）， 膠原纖維面積雖有降低趨勢但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0. 05）。結(jié)論 NLRP3基因敲減可顯著改善高脂高糖飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠模型肝脂肪沉積及炎癥。

關(guān)鍵詞： ?非酒精性脂肪性肝??； ?NLR家族， ?熱蛋白結(jié)構(gòu)域包含蛋白3； ?膳食， ?高脂； ?炎癥； ?小鼠， ?近交C57BL

基金項(xiàng)目： ?國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 （82174040）； ?上海中醫(yī)藥大學(xué)關(guān)鍵領(lǐng)域優(yōu)秀博士培育項(xiàng)目 （2-089）； ?上海市寶山區(qū)

科學(xué)技術(shù)委員會(huì)醫(yī)學(xué)衛(wèi)生項(xiàng)目 （21-E-63）

Effect of NOD?like receptor family pyrin domain containing ?3 knockdown on a mouse model of nonalcoholic

steatohepatitis induced by high-fat high-carbohydrate diet

HUANG Qian1a， 1b， 2， 3， WANG Zhuoyuan1a， 1b， 2， 3， AN Ziming1a， 1b， 2， 3， XIN Xin1a， 2， 3， SUN Qinmei1a， 2， 3， GOU Xiaojun4， HU Yiyang1a， 2， 3， FENG Qin1a， 1b， 2， 3. （1. a. Institute of Liver Diseases， b. Experimental Center for Science and Technology， Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China；2. Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine， Shanghai 201203， China；3. Key Laboratory of Liver and Kidney Diseases， Ministry of Education， Shanghai 201203， China；4. Baoshan District Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Shanghai 201900， China）

Corresponding author： ?FENG Qin， ?fengqin@shutcm.edu.cn ?（ORCID： 0000-0002-4641-1636）

Abstract： Objective To investigate the effect of NOD-like receptor family pyrin domain containing 3 （NLRP3） knockdown on amouse model of nonalcoholic steatohepatitis （NASH） induced by high-fat high-carbohydrate （HFHC） diet. Methods A total of 44mice were randomly divided into normal diet group （CON group） with 20 mice and HFHC group with 24 mice. At the end of week14 of modeling， 4 mice were randomly selected from the HFHC group for the pre-experiment of adeno-associated virus （AAV） bytail vein injection， and NLRP3 knockdown was verified after 4 weeks. After NLRP3 knockdown was verified at the end of week 18，the remaining 40 mice were given a single tail vein injection of AAV， and then they were divided into CON+NLRP3 knockdownnegative control group （CON+NLRP3-NC group）， CON+NLRP3 knockdown group （CON+NLRP3-KD group）， HFHC+NLRP3-NC group， and HFHC+NLRP3-KD group， with 10 mice in each group. At the end of week 24， the activation of NLRP3inflammasome was observed； related indicators were measured， including body weight， liver weight， liver index， and glucose metabolism （fasting blood glucose， fasting insulin， and Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance ［HOMA-IR］ index）the indicators of liver lipid content （liver triglyceride ［TG］ and oil red O staining）， liver inflammation （serum alanine aminotransferase ［ALT］ activity， HE staining， and inflammation-related genes）， and liver fibrosis （Sirius Red staining and fibrosis-related genes） were measured. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiplegroups， and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups. Results Compared with theCON+NLRP3-NC group based on the results of Western Blot， the HFHC+NLRP3-NC group had significant increases in the proteinexpression levels of NLRP3， pro-Caspase1， Caspase1， ASC， and IL-1β， while the HFHC+NLRP3-KD group had significant reductions in these levels （all P<0.05） . The HFHC+NLRP3-NC group showed varying degrees of increase in body weight， liver weight， liver index， and glucose metabolism indicators， while the HFHC+NLRP3-KD group showed significant improvements in these indicators （all P<0.05） . As for hepatic fat deposition， compared with the CON+NLRP3-NC group， the HFHC+NLRP3-NCgroup had a significant increase in liver TG， with a large number of red lipid droplets shown by oil red O staining， and the HFHC+NLRP3-KD group had significant reductions in liver TG and the number of lipid droplets in the liver （all P<0.01） . In terms of liverinflammation， compared with the CON+NLRP3-NC group， the HFHC+NLRP3-NC group had significant increases in serum ALT，NAFLD activity score， and inflammation-related genes， while the HFHC+NLRP3-KD group had significant reductions in these indicators （all P<0.01） . As for liver fibrosis， compared with the CON+NLRP3-NC group， the HFHC+NLRP3-NC group had significant increases in collagen fiber area and fibrosis-related genes， and the HFHC+NLRP3-KD group had significant reductionsin fibrosis-related genes （all P<0.05） and a tendency of reduction in collagen fiber area （P>0.05） . ConclusionNLRP3knockdown can significantly improve hepatic fat deposition and inflammation in a mouse model of HFHC-induced NASH.

Key words： Non-alcoholic Fatty Liver Disease； NLR Family， Pyrin Domain-Containing 3 Protein； Diet， High-Fat； Inflammation；Mice， Inbred C57BLResearch funding： National Natural Science Foundation of China （82174040） ； The Excellent Doctoral Projects in

Key Fields ofShanghai University of Traditional Chinese Medicine （2-089）； District level Medical and Health Key Project of Shanghai BaoshanDistrict Science 21 E 63

非酒精性脂肪性肝病 （NAFLD） 是一種與胰島素抵抗 （IR） 和遺傳易感密切相關(guān)的慢性代謝應(yīng)激性肝病其在全球成年人中的患病率約為25%， 是肝硬化和肝細(xì)胞癌發(fā)生的主要原因之一［1-2］ 。NAFLD包括脂肪變性伴或不伴輕度炎癥的非酒精性脂肪肝 （NAFL） 和非酒精性脂肪性肝炎 （NASH）， 而NASH伴有更快的纖維化進(jìn)展可能。NASH的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確?！岸未驌簟?學(xué)說作為經(jīng)典發(fā)病機(jī)制目前被廣泛認(rèn)同［3］ 。

NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白 3（NOD-likreceptor thermal protein domain associated protein 3， NLRP3）參與NASH的發(fā)展， NLRP3炎癥小體充當(dāng)多個(gè)危險(xiǎn)信號(hào)的傳感器， 其包括內(nèi)源性或外源性病原體信號(hào)的損傷相關(guān)分子模式誘導(dǎo)的無菌性炎癥［4］ ， 在NASH的發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［5-7］ 。NLRP3主要表達(dá)于樹突狀細(xì)胞、 單核細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞、 嗜中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞［8］ 。目前有多項(xiàng)研究表明NLRP3在NASH患者和小鼠模型中顯著上調(diào)［9-11］ ， 其上調(diào)可以促進(jìn)NLRP3/凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白半胱氨酸蛋白酶突變體/效應(yīng)分子前半胱氨酸天冬氨酸特異蛋白酶-1 （NLRP3/ASC/pro-Caspase-1） 炎癥小體的組裝、 激活， 進(jìn)一步將pro-Caspase-1自剪切產(chǎn)生活化的Caspase-1， 活化的Caspase-1將IL-1β前體 （pro-interleukin-1β， pro-IL-1β） 剪切形成成熟的IL-1β并釋放到胞外［12］ ，IL-1β加重肝臟炎癥反應(yīng)， 并促進(jìn)肝細(xì)胞的脂質(zhì)累積， 甚至可以刺激肝星狀細(xì)胞的活化推動(dòng)肝炎向肝纖維化甚至肝硬化發(fā)展［13］ 。

鑒于NLRP3在NASH發(fā)病中的作用， 需進(jìn)一步明確敲減/敲除NLRP3基因?qū)ASH相關(guān)表型的影響。有研究者［10， 14］ 運(yùn)用ob/ob小鼠或蛋氨酸膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)NASH模型進(jìn)行了相關(guān)探索。本研究運(yùn)用更接近人類疾病特征的高脂高糖誘導(dǎo)的NASH小鼠模型［15］ ， 同時(shí)運(yùn)用可靶向肝臟的腺相關(guān)病毒 （adeno-associated virus， AAV） 9對(duì)NLRP3基因進(jìn)行敲減， 觀察NLRP3基因敲減后NASH小鼠相關(guān)表型的改變， 以探究NLRP3在NASH發(fā)展中的潛在作用。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57/BL6J雄性小鼠44只， 體質(zhì)量22～24 g， SPF級(jí)， 購于上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心二樓飼養(yǎng)室， 自由進(jìn)食和飲水， 飼養(yǎng)溫度為26 ℃， 相對(duì)濕度為60%±10%， 光照時(shí)間為晝夜明暗交替。動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)： SCXK （滬） 2017-0012，動(dòng)物使用許可證編號(hào)： SYXK （滬） 2020-0009。

1. 2 主要試劑和儀器

1. 2. 1 主要試劑 NLRP3抗體（英國abcam公司， 貨號(hào)： ab263899）； Caspase1抗體 （美國CST公司， 24232）；ASC抗體 （美國CST公司， 67824）； IL-1β抗體 （英國abcam公司， 貨號(hào)： ab9722）； GAPDH （美國CST公司， 貨號(hào)： 5174）；BCA蛋白定量試劑盒 （美國賽默飛世爾科技公司， 貨號(hào)：NCI3225CH）； 高脂飼料 （美國Research diets， 貨號(hào)： D12492i）；對(duì)照飼料 （美國Research diets， 貨號(hào)： D12450B）； 果糖 （南通特洛菲飼料科技有限公司， 貨號(hào)： F0001）； 蔗糖 （南通特洛菲飼料科技有限公司， 貨號(hào)： S0001）； ALT試劑盒 （南京建成生物科技有限公司， 貨號(hào)： C009-2）； 甘油三酯 （TG）試劑盒 （浙江東歐生物工程有限公司， 貨號(hào)： A0-10017）；蘇木精-伊紅 （HE） 染色試劑盒 （南京建成生物科技有限公司， 貨號(hào)： D006-1-4）； 油紅O試劑盒 （南京建成生物科技有限公司， 貨號(hào)： D027-1-4）； AAV9 （上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司， 貨號(hào)： 105338-1； CON305）。

1. 2. 2 主要儀器 恒溫氣浴搖床 （上海一恒儀器有限公司， 型號(hào)： THZ-103B）； 石蠟包埋機(jī) （德國LEICA公司，型號(hào)： EG1160）； 熒光酶標(biāo)儀 （瑞士TECAN公司， 型號(hào)：F200 PR0）； 脫水機(jī) （德國LEICA公司， 型號(hào)： ASP300）； 超聲波清洗機(jī) （寧波新芝生物科技公司， 型號(hào)： DTS）。

1. 3 實(shí)驗(yàn)方法

1. 3. 1 動(dòng)物模型的建立和分組 44只C57/BL6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常飲食組 （CON） 20只， 高脂高糖造模組 （HFHC） 24只 （其中4只用于NLRP3敲減預(yù)實(shí)驗(yàn)）。CON組給予正常飼料并飲用雙蒸水， HFHC組小鼠采用高脂飼料聯(lián)合高糖飲水 （濃度42 g/L， 糖水配比為55%果糖和45%蔗糖）。造模14周末， 進(jìn)行小鼠AAV9尾靜脈注射預(yù)實(shí)驗(yàn)， 給予1只HFHC組小鼠約1. 575×1011 v. g. 的NLRP3基因敲減陰性對(duì)照 （NLRP3-NC） 病毒， 剩余3只注射等量NLRP3基因敲減（NLRP3-KD）病毒。注射后第4周處死小鼠， 采用Western Blot驗(yàn)證敲減模型是否成功。18周末確認(rèn)造模成功后， 對(duì)剩余40只小鼠進(jìn)行AAV9一次性尾靜脈注射， 分組如下： CON+NLRP3-NC、 CON+NLRP3-KD、 HFHC+NLRP3-NC和HFHC+NLRP3-KD， 每組10只， HFHC組繼續(xù)給予高脂高糖飲食6周， 直至24周末。動(dòng)物造模及干預(yù)流程見圖1。

1. 3. 2 NLRP3基因敲減病毒的構(gòu)建 基于AAV血清型的組織親和性， 選用AAV9血清型對(duì)小鼠肝臟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。AAV9包裝步驟： 第一步， 將外源基因克隆進(jìn)合適的病毒載體。第二步， 重組表達(dá)質(zhì)粒同pHelper （攜帶腺病毒來源的基因） 和pAAV-RC （攜帶AAV復(fù)制和衣殼基因） 共轉(zhuǎn)染進(jìn)AAV-293細(xì)胞 （提供AAV復(fù)制和包裝所需的反式作用因子）。轉(zhuǎn)染2～3天后重組AAV9在包裝細(xì)胞中組裝完成。第三步， 從被感染AAV-293細(xì)胞中收集AAV9病毒顆粒。第四步， 濃縮并純化第三步的病毒上清液。第五步， 用定量PCR法測定所得到病毒的滴度。病毒的儲(chǔ)存： 收到病毒液后儲(chǔ)存于?80 ℃冰箱備用。NLRP3敲減靶向序列： 5′ -CCAGGATCCTCTTCCTCAT-3′ 。

1. 3. 3 血清和肝組織生化指標(biāo)檢測

1. 3. 3. 1 肝組織TG含量檢測 于肝組織中加入無水乙醇、 丙酮以及小磁珠進(jìn)行充分勻漿， 后置于4 °C的冰箱靜置過夜。將靜置過夜后的肝組織樣本離心， 吸取部分上清液與檢測試劑充分混勻后加入96孔板， 充分反應(yīng)后檢測各孔的吸光度值。肝組織TG （mg/g） = （測量孔的值－空白孔的值） /標(biāo)準(zhǔn)孔×200×3/20。

1. 3. 3. 2 血清ALT活性的檢測 按試劑盒說明書依次加入不同液體， 酶標(biāo)儀檢測各孔OD值， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將測定值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中， 得到檢測的ALT值。

1. 3. 3. 3 空腹血糖 （FBG）、 空腹胰島素 （FIN） 及IR的穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估檢測 FBG在小鼠取材當(dāng)天使用血糖儀進(jìn)行檢測。FIN使用ELISA試劑盒根據(jù)說明書步驟進(jìn)行檢測。胰島素抵抗的穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估 （HOMA-IR） = （FBG×FIN） /22. 5。

1. 3. 4 肝組織病理染色

1. 3. 4. 1 肝組織油紅O染色 將冷凍切片機(jī)提前預(yù)冷，切片機(jī)厚度設(shè)置為10 ?m。切好后的組織樣本于4 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆?。提前配置好?chǔ)備溶液。染色前樣本需提前置于室溫下復(fù)溫15 min， 之后將樣本放入儲(chǔ)備溶液中， 后水洗； 復(fù)染， 水洗。水性固封劑封片， 采用熒光顯微分析儀進(jìn)行拍片。

1. 3. 4. 2 肝組織HE和天狼星紅染色 對(duì)肝組織進(jìn)行固定， 脫水， 包埋， 切片。使用二甲苯和梯度酒精進(jìn)行脫蠟處理， 蘇木精染液染核， 經(jīng)鹽酸酒精分化后水洗至核變藍(lán)， 放入伊紅染液中染色， 梯度酒精及二甲苯中后封片。次日收取病理切片， 顯微鏡下觀察。肝組織病理使用NAFLD活動(dòng)評(píng)分 （NAS） 進(jìn)行評(píng)價(jià)， NAS<3分可排除NASH， NAS>4分則可診斷為NASH， 介于兩者之間為有NASH可能［16］ 。為了觀察肝纖維化的組織學(xué)改變， 肝組織經(jīng)石蠟包埋后， 使用天狼星紅染色法評(píng)估肝臟膠原沉積。

1. 3. 5 Western Blot檢測 樣本制備： 在肝組織中加入混合裂解液， 充分勻漿沉淀取上清， BCA法蛋白定量。電泳： 提前配好分離膠和濃縮膠， 加入樣品和Marker開始電泳。轉(zhuǎn)膜： 使用半干轉(zhuǎn)法， 從下向上依次為濾紙-膜-凝膠- PVDF膜， 放好后即可開始轉(zhuǎn)膜?？贵w結(jié)合： 一抗NLRP3（1 ∶1 000）、 pro-Caspase1（1 ∶1 000）、 Caspase1（1 ∶1 000）、ASC （1 ∶1 000）、 IL-1β （1 ∶1 000） 及GAPDG （1 ∶5 000） 4 ℃孵育過夜， 次日二抗室溫孵育1 h， 加ECL顯影液進(jìn)行顯影。

1. 3. 6 qPCR檢測 樣品RNA的提取： 此部分按照純化柱法進(jìn)行提取。樣品逆轉(zhuǎn)錄： 逆轉(zhuǎn)錄之前， 先用分光光度計(jì)測總RNA濃度， 校正樣品RNA濃度。逆轉(zhuǎn)錄根據(jù)試劑盒說明書完成， 結(jié)束后將逆轉(zhuǎn)錄完成的cDNA放入?20 °C備用。RT-PCR： 將配好的混合溶液加入到384孔板， 此步在冰盒上操作。PCR儀上按照試劑說明書上的反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行設(shè)置， 完成檢測。具體引物序列信息見表1。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用 SPSS 26. 0、 Graphpad prism 及Image J軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析或可視化處理。計(jì)量資料采用x ˉ±s表示， 多組間比較使用單因素方差分析， 進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)， P<0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 NLRP3基因敲減預(yù)實(shí)驗(yàn)鑒定 18周末預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束， 通過 Western Blot 實(shí)驗(yàn)檢測 AAV9 轉(zhuǎn)染后肝臟中NLRP3的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示3只NLRP3-KD小鼠肝臟的NLRP3蛋白表達(dá)量均較NLRP3-NC小鼠降低， 提示NLRP3敲減模型構(gòu)建成功 （圖2）。

2. 2 NLRP3基因敲減對(duì)肝組織NLRP3炎癥小體活化的影響

2. 2. 1 NLRP3基因敲減對(duì)NLRP3轉(zhuǎn)錄及蛋白水平的影響 與CON+NLRP3-NC組相比， HFHC+NLRP3-NC組小鼠肝臟NLRP3轉(zhuǎn)錄和蛋白水平顯著上調(diào) （P值均<0. 01）。與HFHC+NLRP3-NC組相比， HFHC+NLRP3-KD組肝臟NLRP3蛋白及轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低 （P值均<0. 01）（圖3）。

2. 2. 2 NLRP3基因敲減對(duì)炎癥小體及下游IL-1β蛋白的影響 與CON+NLRP3-NC組相比， HFHC+NLRP3-NC組小鼠肝組織pro-Caspase1、 Caspase1、 ASC及IL-1β蛋白顯著上調(diào) （P值均<0. 01）。與HFHC+NLRP3-NC組相比，HFHC+NLRP3-KD組上述蛋白水平顯著降低 （P值均<0. 01）。表明在HFHC誘導(dǎo)的NASH小鼠模型中， 肝臟NLRP3炎癥小體明顯被激活， 同時(shí)IL-1β的分泌增加。NLRP3敲低后可明顯抑制NASH小鼠肝臟炎癥小體及IL-1β蛋白的表達(dá) （圖4）。

2. 3 NLRP3基因敲減對(duì)NASH小鼠肝質(zhì)量、 體質(zhì)量、 肝體比及糖代謝的影響

2. 3. 1 NLRP3基因敲減對(duì)小鼠肝質(zhì)量、 體質(zhì)量及肝體比的影響 與CON+NLRP3-NC組相比， HFHC+NLRP3-NC組小鼠肝質(zhì)量、 體質(zhì)量及肝體比顯著上升 （P值均<0. 01）。NLRP3敲減后， HFHC+NLRP3-KD組小鼠較HFHC+NLRP3-NC組小鼠肝質(zhì)量、 體質(zhì)量及肝體比顯著下降 （P值均<0. 01） （圖5， 表2）。

2. 3. 2 NLRP3基因敲減對(duì)血糖相關(guān)指標(biāo)的影響 HFHC+ NLRP3-NC組較CON+NLRP3-NC組的FBG、 FIN及HOMA-IR顯著上升 （P值均<0. 01）。NLRP3敲減后， HFHC+NLRP3- KD組肝組織FIN和HOMA-IR相較于HFHC+NLRP3-NC組顯著下降 （P值均<0. 05）， FBG雖有降低趨勢但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P>0. 05）（表2）。

2. 4 NLRP3基因敲減對(duì)NASH小鼠肝臟脂肪沉積的影響 與CON+NLRP3-NC組相比， HFHC+NLRP3-NC組的肝組織TG明顯升高 （P<0. 01）； 肝臟形態(tài)明顯更大， 顏色變?yōu)闇\黃色， 質(zhì)地較硬； 油紅O染色顯示肝細(xì)胞腫脹， 脂滴較多， 染色較深， 提示HFHC飲食可明顯加重肝臟脂肪沉積。HFHC+NLRP3-KD 組較 HFHC+NLRP3-NC 組的肝臟形態(tài)減小， 肝臟TG及脂滴明顯減少（P值均<0. 01）（圖6， 表3）。

2. 5 NLRP3基因敲減對(duì)NASH小鼠肝臟炎癥的影響

2. 5. 1 NLRP3基因敲減對(duì)ALT活性的影響 與CON+NLRP3-NC組相比， HFHC+NLRP3-NC組血清ALT水平顯著上升 （P<0. 01）， NLRP3敲低后NASH小鼠的ALT活性顯著降低 （P<0. 05）（表4）。

2. 5. 2 NLRP3基因敲減對(duì)肝組織病理的影響 HE染色結(jié)果顯示， 與CON+NLRP3-NC組相比， HFHC+NLRP3-NC組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)大量的大泡性和小泡性脂質(zhì)空泡， 小葉內(nèi)炎癥浸潤和氣球樣變肝細(xì)胞增大， 細(xì)胞質(zhì)水腫稀疏， 中央靜脈周圍肝細(xì)胞腫脹。臟脂肪變性、 小葉炎癥和氣球樣變及NAS總評(píng)分明顯增加， NLRP3基因敲減可以明顯改善NASH小鼠的上述病理變化 （P值均<0. 01）（圖7， 表4）。

2. 5. 3 NLRP3基因敲減對(duì)小鼠肝臟炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響 與CON+NLRP3-NC組相比， HFHC+NLRP3-NC組炎癥相關(guān)指標(biāo)IL-1β、 IL-6、 CXCL10及CCL2的mRNA水平均明顯升高（P 值均<0. 01）， HFHC+NLRP3-KD 組較HFHC+NLRP3-NC組均顯著下降 （P值均<0. 01）（表5）。

2. 6 NLRP3基因敲減對(duì)NASH小鼠肝纖維化的影響

2. 6. 1 NLRP3基因敲減對(duì)肝纖維化的影響 天狼星紅染色結(jié)果顯示HFHC+NLRP3-NC組較CON+NLRP3-NC組膠原纖維明顯增加 （P<0. 01）， NLRP3敲減后NASH小鼠肝臟膠原纖維有減少趨勢， 但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （圖8， 表6）。

2. 6. 2 NLRP3基因敲減對(duì)肝纖維化相關(guān)指標(biāo)轉(zhuǎn)錄水平的影響 與CON+NLRP3-NC組相比， HFHC+NLRP3-NC組纖維化相關(guān)指標(biāo)α-SMA、 COL3α1及COL1α1的mRNA水平明顯升高 （P值均<0. 05）， HFHC+NLRP3-KD組均較HFHC+NLRP3-NC組顯著下降 （P值均<0. 01）（表6）。

3 討論

NLRP3炎癥小體參與NASH的發(fā)生和發(fā)展， 如能有效抑制NLRP3， 就有可能阻止或逆轉(zhuǎn)NASH。本研究借助AAV9載體進(jìn)行尾靜脈注射， 使其結(jié)合CAG肝臟特異性啟動(dòng)子， 實(shí)現(xiàn)對(duì)肝組織NLRP3的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。AAV作為一種常用的基因轉(zhuǎn)染工具， 具有多種血清型、 免疫原性低、 長期穩(wěn)定表達(dá)基因、 宿主范圍廣等優(yōu)勢， 在基因功能研究和基因治療遞送載體中占據(jù)主導(dǎo)地位。AAV每種血清型的靶器官親和性不同， 與其他病毒載體相比更有器官選擇性， 其中AAV9載體具有明顯肝嗜性。但缺點(diǎn)在于AAV載體容量小， 目前最多只能容納4. 7 kb外源DNA片段。

在本研究中， 首先證明了高脂高糖飲食喂養(yǎng)的NASH小鼠可以誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的激活， 在采用AAV9載體實(shí)現(xiàn)肝臟NLRP3基因敲減后， NASH小鼠的肝臟炎癥小體活化明顯減弱， 肝臟脂肪沉積改善。同時(shí)， 觀察了肝臟炎癥和纖維化， 結(jié)果顯示NLRP3敲減可以抑制NASH小鼠的肝臟炎癥， 肝臟膠原纖維增生減少但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。先前的研究［17］ 表明， 與野生型小鼠相比， 高脂飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠模型中， 肝臟病理顯示NLRP3基因敲除導(dǎo)致肝臟脂肪變性減少。在Alms1突變 （foz/foz） 和蛋氨酸及膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠中， 肝臟NLRP3、Caspase-1及IL-1β蛋白表達(dá)明顯增加， 給予NLRP3抑制劑MCC950 （直接靶向NLRP3的NATCH結(jié)構(gòu)域） 后， 肝臟炎癥小體活性明顯減弱［8， 10］ 。另一研究［18］ 發(fā)現(xiàn)抑制巨噬細(xì)胞NLRP3炎性小體的激活可進(jìn)一步抑制炎性小體激活引起的肝細(xì)胞脂質(zhì)積累， 有助于改善NASH。這些研究和本研究結(jié)果類似， 提示敲減或抑制肝臟NLRP3的表達(dá)可改善NASH。

本研究采用高脂高糖飲食來構(gòu)建NASH動(dòng)物模型，并評(píng)價(jià)了NLRP3敲減對(duì)NASH小鼠肝脂肪沉積、 炎癥、纖維化的改善作用。在肝臟中， NLRP3高表達(dá)于巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞， 而肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞表達(dá)NLRP3的水平較低［19-20］ ， 本研究的局限性在于未使用細(xì)胞特異性基因敲除小鼠模型， 研究發(fā)現(xiàn)基因敲除模型通常能夠取得更明顯的表型， 對(duì)于探究基因作用、 疾病機(jī)制、 藥物靶點(diǎn)等方面具有更高的研究效度。

總之， 本研究發(fā)現(xiàn)高脂高糖飲食喂養(yǎng)的小鼠可以出現(xiàn)NASH表型和肝臟NLRP3炎癥小體， 通過敲低NLRP3的表達(dá)可以抑制肝臟炎癥小體活化， 抑制肝脂肪沉積、炎癥。本研究探討了NLRP3在NASH小鼠模型中的作用， 這些結(jié)果表明NLRP3在NASH的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用， 可能是治療NASH的關(guān)鍵靶點(diǎn)。倫理學(xué)聲明： 本研究方案于2021年9月3日經(jīng)由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批， 批號(hào)： PZSHUTCM210903007，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明： 本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明： 黃倩負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)論文框架， 起草論文； 黃倩、 王卓媛負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作， 研究過程的實(shí)施； 黃倩、 安梓銘負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集， 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 繪制圖表； 馮琴、 辛鑫、 孫沁梅負(fù)責(zé)論文修改； 馮琴、 胡義揚(yáng)、 茍小軍負(fù)責(zé)擬定寫作思路； 馮琴指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：2023-08-15； 錄用日期：2023-08-31

本文編輯：朱晶