絲氨酸蛋白酶抑制劑在腫瘤細(xì)胞遷移中的作用①

魏 玲 程小艷 李寶明 汪 雨 高麗娟 王成彬 倫永志

(北京市理化分析測試中心，北京100089)

絲氨酸蛋白酶是一類以絲氨酸為活性中心的蛋白水解酶，在生物有機(jī)體中起著重要而廣泛的生理作用,它們通過對蛋白酶原的激活或抑制而起調(diào)節(jié)因子作用。在腫瘤細(xì)胞中，絲氨酸蛋白酶通過對基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)進(jìn)行剪切進(jìn)而誘導(dǎo)其活化，活化的MMPs水解細(xì)胞外基質(zhì)。故絲氨酸蛋白酶通過參與胞外基質(zhì)水解過程，進(jìn)而一定程度上控制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。而絲氨酸蛋白酶抑制劑Serpins(Serine protease inhibitors)可通過對絲氨酸蛋白酶活性的抑制間接抑制MMPs活性來影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpins)是一類分子質(zhì)量在40～50 kD 的蛋白酶抑制劑。動(dòng)物、植物、古細(xì)菌、細(xì)菌、病毒的基因組中都有Serpins基因家族存在，Serpins是參與免疫調(diào)節(jié)和其他生物學(xué)通路的重要因子。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)1 500余個(gè)Serpins家族成員，分為抑制型和非抑制型兩大類。人體內(nèi)共含有36個(gè)功能性Serpins。Serpins功能多樣，參與血液凝固、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞遷移、纖維蛋白溶解、補(bǔ)體激活、胞外基質(zhì)重建、激素運(yùn)輸以及細(xì)胞凋亡等生理學(xué)過程的調(diào)控。引入外源有意義的Serpins可作為靶向藥物治療來實(shí)現(xiàn)機(jī)體平衡的恢復(fù)，例如：病毒源的Serpin-1已經(jīng)作為一類新的免疫調(diào)節(jié)劑被開發(fā)出來[1]。在腫瘤研究領(lǐng)域，Serpins通過對MMPs的抑制作用影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，這一理論使其有望成為新型抗腫瘤藥物，但目前尚處于基礎(chǔ)研究階段，距離藥物開發(fā)還有很遠(yuǎn)的路要走。本文對惡性腫瘤相關(guān)的7個(gè)Serpins進(jìn)行綜述[2，3]。

1 Serpins的結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制

Serpins具有約350～400個(gè)氨基酸殘基，其空間結(jié)構(gòu)高度保守：①C-末端具有3個(gè)β片層結(jié)構(gòu)(命名為A、B、C)；②8～9個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)；③以及一個(gè)N-末端的反應(yīng)中心回環(huán)結(jié)構(gòu)(Reactive center loop，RCL)。結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。Serpins是絲氨酸蛋白酶的內(nèi)源性抑制劑，其作用于絲氨酸蛋白酶包含三個(gè)步驟：①絲氨酸蛋白酶(靶酶)特異性識(shí)別Serpins的RCL結(jié)構(gòu)域，與其結(jié)合形成米氏復(fù)合物，②靶酶切開RCL序列的P1-P1′鍵，斷開的P1-P1′鍵與靶酶形成?；?酶中間體，③RCL的氨基末端部分作為額外的反向平行鏈(S4A)插入β-折疊A中，引起Serpins構(gòu)象發(fā)生變化進(jìn)而與蛋白酶形成穩(wěn)定的共價(jià)復(fù)合物使其失活。

腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移(Migration)與侵襲(Invasion)是惡性腫瘤擴(kuò)散的關(guān)鍵步驟，在這一過程中，一種絲氨酸蛋白酶：尿激酶型纖溶酶原激活因子(Urokinase-type plasminogen activator，uPA)能夠?qū)|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)進(jìn)行剪切進(jìn)而誘導(dǎo)其活化?；罨腗MPs能夠水解細(xì)胞外基質(zhì)(Extra-cellular matrix，ECM)實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲作用。uPA是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲的調(diào)控樞紐，發(fā)現(xiàn)和篩選其抑制劑在惡性腫瘤診療，特別是預(yù)防惡性腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)中具有重要意義。因此，Serpins是有希望的抗腫瘤治療藥物。

圖1 Serpins結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Serpins structure diagram

2 惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲相關(guān)Serpins

2.1纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1) 纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1，又稱 SERPINE 1)是組織型纖溶酶激活子(tissue type plasminogen activator，tPA)和尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活子(urokinase-type plasminogen activator，uPA，以下簡稱uPA)的主要抑制劑[4]。目前被證明只有在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中能夠抑制癌細(xì)胞侵襲[5]。報(bào)道稱PAI-1能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435的轉(zhuǎn)移與侵襲作用[6]。乳腺癌、卵巢癌、胃癌、腎癌、肺癌五種癌細(xì)胞基質(zhì)中PAI-1含量升高反而顯示預(yù)后不良[7-11]。鑒于以上矛盾結(jié)果，有學(xué)者認(rèn)為，PAI-1和uPA之間的平衡才是問題的關(guān)鍵。例如在4T1乳腺癌細(xì)胞模型中，當(dāng)調(diào)節(jié)uPA/PAI-1平衡偏向于uPA時(shí)，腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移受到抑制[12]。雖然PAI-1在腫瘤細(xì)胞遷移中的作用機(jī)制已有研究[13-17]，但機(jī)制仍不明確，故仍需進(jìn)一步長期深入研究。

另外，還有研究表明PAI-1可以作為腫瘤預(yù)后標(biāo)志物識(shí)別患侵襲性腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，作為一種生長因子和一些癌癥凋亡的抑制劑，它也可以成為癌癥的治療靶點(diǎn)，開發(fā)PAI-1的抑制劑作為治療試劑[18，19]。

2.2纖溶酶原激活物抑制劑-2(PAI-2) 纖溶酶原激活物抑制劑-2(PAI-2;又稱SERPINB2)屬于Serpins中卵清蛋白亞家族(Ovalbumin subfamily)。在功能和結(jié)構(gòu)上與PAI-1有較大差異。與PAI-1類似，PAI-2也抑制uPA的活性，不過其效率比較慢。與PAI-1不同的是，PAI-2一般不與VN結(jié)合。PAI-2與PAI-1競爭性結(jié)合uPA，PAI-2對 uPA的活性抑制能力更強(qiáng)。因?yàn)镻AI-2只抑制uPA，所以PAI-2可能是uPA“真正”的抑制蛋白。不管在細(xì)胞內(nèi)還是在細(xì)胞表面，在PAI-1的存在下，PAI-2都能夠有效地抑制uPA。另外，PAI-2和PAI-1之間另一個(gè)值得關(guān)注的差異是PAI-2不與LRP結(jié)合，不激發(fā)次級(jí)有絲分裂信號(hào)(Secondary mitogenic signals)。但是，PAI-2與uPA結(jié)合形成的復(fù)合物可以與LRP結(jié)合并被細(xì)胞內(nèi)化[20]。PAI-2具體的參與生理作用的機(jī)制目前還不明確。

PAI-2已經(jīng)被明確證明能夠抑制癌細(xì)胞遷移從而抑制癌癥的發(fā)展。PAI-2高度表達(dá)與患者生存期的延長和乳腺癌細(xì)胞遷移的轉(zhuǎn)弱有關(guān)，PAI-2高表達(dá)預(yù)示良好的預(yù)后；而PAI-2低表達(dá)的患者預(yù)后很差[21]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，PAI-2具有對惡性腫瘤細(xì)胞強(qiáng)烈的抑制作用。但PAI-2在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外所起的確切作用還不十分明確，因此PAI-2發(fā)揮作用的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

2.3蛋白C抑制劑(Serpin protein C inhibitor，PCI) Serpin蛋白C抑制劑(Serpin protein C inhibitor，PCI；又稱PAI-3或SERPINA5)與PAI-1、PAI-2類似，也具有對uPA的抑制活性。PCI具有對多種惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲的強(qiáng)烈抑制作用，包括腎癌(Clear cell renal cell carcinoma)、前列腺癌(Prostate cancer)、卵巢癌(Ovarian cancer)和乳腺癌癌(Breast cancer)[22-26]。例如：在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MD-231中，外源上調(diào)PCI能夠顯著降低癌細(xì)胞遷移和入侵的能力[25]，晚期卵巢癌中PCI表達(dá)的減少與侵襲有關(guān)[26]。

目前PCI作用的分子機(jī)制尚無公認(rèn)模式，目前只有Fortenberry等[27]于2010年研究發(fā)現(xiàn)了PCI可以通過抑制溶酶體蛋白L(cathepsin L)來調(diào)控腫瘤的遷移，即cathepsin L 是PCI潛在靶蛋白。其研究認(rèn)為癌細(xì)胞把cathepsin L分泌到細(xì)胞外，cathepsin L通過內(nèi)吞降解胞內(nèi)和胞外的蛋白質(zhì)，降解胞外基質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞間質(zhì)與組織基底膜(ECM)的破壞，而PCI可以抑制cathepsin L活性功能進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

2.4蛋白酶Nexin-1 蛋白酶Nexin-1又稱NP-1、SERPINE2，其結(jié)構(gòu)與Serpine 1相似，其主要在神經(jīng)系統(tǒng)和血管中表達(dá)，而血漿中的分布較少。但在炎癥反應(yīng)的刺激下，其在血漿中的含量會(huì)上升。血漿中的Nexin-1通常比較少，但是在各種炎癥的刺激下，其含量會(huì)上升。Nexin-1參與凝血酶誘導(dǎo)的途徑，例如神經(jīng)元增殖，神經(jīng)突增生和腦損傷期間的細(xì)胞凋亡。Nexin-1不僅僅抑制凝血酶，同時(shí)也抑制纖溶酶原激活劑和纖溶酶。

Nexin-1具有抑制腫瘤血管生成的能力和抗血管生成的能力[28]，Selbonne等[28]認(rèn)為Nexin-1能夠阻斷VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管形成。另一項(xiàng)研究結(jié)果表明，在C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中下調(diào)Nexin-1的表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲作用，上調(diào)uPA、MMP-9、MMP-2的表達(dá)[29]。在乳腺癌、胰腺癌和鱗狀細(xì)胞癌三種癌細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，PN-1過表達(dá)，且過表達(dá)的PN-1與細(xì)胞侵襲性有關(guān)[30-32]。

2.5神經(jīng)源性絲氨酸蛋白酶抑制劑(Neuroserpin) Neuroserpin (又稱SERPINI1)主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，Neuroserpin也能夠抑制tPA和uPA等的活性，Neuroserpin在神經(jīng)元中可以防止纖溶酶原激活物的細(xì)胞毒性，被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中tPA的主要抑制劑。與PAI-1作用機(jī)制一樣其通過抑制MMP通路來抑制細(xì)胞遷移。

然而，最近研究表明乳腺癌腦轉(zhuǎn)移和肺癌腦轉(zhuǎn)移的腦實(shí)質(zhì)中的Neuroserpin能通過抑制纖溶酶介導(dǎo)的死亡信號(hào)通路促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移作用。具體作用機(jī)理為：血纖維蛋白溶酶切割膠質(zhì)細(xì)胞來源的Fas 配體 (FAS L)蛋白，生成可溶的FAS L蛋白(sFAS L)，并且在腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞中擴(kuò)散，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡。另外，血纖維蛋白溶酶能夠激活L1CAM黏著分子的表達(dá)，從而防止癌細(xì)胞沿著腦毛細(xì)血管擴(kuò)散，這可以有效抑制癌細(xì)胞在腦中的轉(zhuǎn)移。但是神經(jīng)元過表達(dá)的Neuroserpin可以抑制纖溶酶原激活物活性，抑制上述機(jī)制發(fā)生，從而促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。故高度表達(dá)的Neuroserpin促進(jìn)癌細(xì)胞腦部的轉(zhuǎn)移[33]。

2.6乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑(Maspin) Maspin(又稱為SERPINB5)被認(rèn)為是一類非抑制型的Serpins，是一種在上皮細(xì)胞中表達(dá)的Ⅱ型腫瘤抑制因子(Class Ⅱ suppressor)。Maspin能夠抑制細(xì)胞表面uPA的活性，增加細(xì)胞的黏著能力，抑制細(xì)胞從基底膜上脫離，抑制uPA以及腫瘤血管生成[34,35]。

在乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞中，P53能夠誘導(dǎo)Maspin的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移；而敲低Maspin的表達(dá)能夠上調(diào)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲作用[36]。2013年，Abraham等[37]的研究也證實(shí)了這一趨勢：乳腺癌與前列腺癌細(xì)胞中Maspin高表達(dá)的患者預(yù)后較好。但是Teoh 等[38]于2014年研究發(fā)現(xiàn)Maspin不能抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和克隆形成。以前觀察到的結(jié)果實(shí)際上是PHLPP1基因所起的作用，Maspin并不是腫瘤抑制因子。Maspin在癌癥調(diào)控中的作用到底如何，需要更多深入的研究。

2.7色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor，PEDF) 色素上皮衍生因子(Pigment epitheli-um-derived factor，PEDF)又稱SERPINF1，其與Maspin類似，是一種非抑制型的Serpin，具有抗腫瘤血管生成和抗腫瘤發(fā)生的功能。與Maspin不同的是PEDF不與uPA結(jié)合而與uPAR結(jié)合。

研究表明PEDF通過抑制腫瘤血管生成、腫瘤生長和細(xì)胞遷移來抑制癌癥。PEDF能夠抑制胰腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移與遷移作用。另外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明，PEDF的過表達(dá)能夠抑制腫瘤生長和腹膜轉(zhuǎn)移[39]。PEDF作為神經(jīng)類Serpins能夠促進(jìn)乳腺癌來源細(xì)胞在腦中的轉(zhuǎn)移，最新研究顯示PEDF還可以作為細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制因子發(fā)揮功能。如腦轉(zhuǎn)移瘤中PEDF的表達(dá)量下降，異源移植模型和同系小鼠模型實(shí)驗(yàn)中PEDF能抑制乳腺癌細(xì)胞向腦轉(zhuǎn)移，保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞免受癌細(xì)胞的損害[40]。

表1 參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞遷移及腫瘤惡化的Serpins情況列表

Tab.1 List of Serpins that have been shown to regulate tumor cell migration and cancer progression

Serpin名稱通用名底物在腫瘤細(xì)胞遷移中的作用癌癥類型Serpin E1PAI-1uPA、tPA、plasminPAI-1在腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和血管生成中具有刺激作用和抑制作用。PAI-1的過表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)。乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、腎癌Serpin B2PAI-2uPAPAI-2表達(dá)增加與良好的預(yù)后相關(guān),PAI-2表達(dá)的減少促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲。乳腺癌、胃癌、胰腺癌Serpin A5PC1uPA、組織蛋白酶LPCI低表達(dá)與侵入性表型相關(guān)。PCI的增加可提高乳腺癌生存率。腎癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌Serpin E2PN-1uPA、tPAPN-1過表達(dá)具有抗血管生成的特性。前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、血管癌Serpin I1NeuroserpinuPA、tPA、plasminNeuroserpin保護(hù)癌細(xì)胞,使其逃避腦內(nèi)FasL介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。中樞神經(jīng)系統(tǒng)Serpin B5Maspin-Maspin抑制腫瘤細(xì)胞遷移,長期以來被認(rèn)為是腫瘤抑制因子,但最近的研究駁斥了這種說法。乳腺癌Serpin F1PEDF-PEDF是一種強(qiáng)有力的抗血管生成和抗腫瘤藥物腦癌

3 小結(jié)與展望

Serpins在刺激或抑制腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和血管再生中扮演著重要的角色。因?yàn)榭沟鞍姿庾饔貌⒉皇撬鼈兊奈ㄒ还δ?，其功能依賴于與其他蛋白的互作，Serpins在癌癥中的作用非常復(fù)雜。且從綜上所述來看，目前沒有一種Serpins能夠明確的被證明在惡性腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲中具有抑制作用，7種Serpins在不同種類的惡性腫瘤研究結(jié)果中均出現(xiàn)有的抑制、有的促進(jìn)的矛盾現(xiàn)象。同一種惡性腫瘤不同患癌方式，Serpins類蛋白表現(xiàn)的結(jié)果也不一樣。如Huang等[41]在2017年的研究結(jié)果顯示PAI-1是前列腺癌(PAC)的預(yù)后標(biāo)志，但是在局限性前列腺癌沒有預(yù)后價(jià)值 。如此復(fù)雜多樣的作用結(jié)果與Serpins復(fù)雜的作用機(jī)理有關(guān)。7種Serpins在腫瘤中的作用總結(jié)結(jié)果見表1[5-40]。鑒于如此復(fù)雜的作用機(jī)理，對于絲氨酸蛋白酶抑制劑類蛋白在惡性腫瘤中的作用需要科研工作者繼續(xù)深入長期研究。

另外一個(gè)導(dǎo)致Serpins在腫瘤中復(fù)雜多樣的作用結(jié)果的原因是Serpins的底物基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs家族龐大且作用復(fù)雜，除了與上下游靶標(biāo)作用影響腫瘤發(fā)生發(fā)展外，MMPs家族還會(huì)相互影響而促進(jìn)或抑制腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)進(jìn)程，這一點(diǎn)加大了Serpins在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)理研究的復(fù)雜程度和難度。例如：在人類的23種MMPs家族中，黃紅顏等[42]研究發(fā)現(xiàn)MMP-11的表達(dá)抑制會(huì)導(dǎo)致 MMP-14 的表達(dá)抑制，兩者的表達(dá)抑制會(huì)減弱乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。但是Rio等[43]的研究卻顯示MMP-11 作為MMP-14的作用底物被剪切成許多小的片段游離于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，MMP-14 對MMP-11 進(jìn)行負(fù)向調(diào)控而使其喪失活性。

總之，作為人體內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶的抑制劑Serpins能夠阻斷惡性腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移與侵襲過程中uPA對MMPs的剪切與活化作用，直接抑制與阻斷惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲作用這一理論使得Serpins成為有希望的抗腫瘤藥物是毋庸置疑的。且內(nèi)源性物質(zhì)這一特性更增加了Serpins相關(guān)臨床應(yīng)用研發(fā)的可行性。目前討論較多的是可以作為腫瘤預(yù)后標(biāo)志物識(shí)別患侵襲性腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，作為一種生長因子和一些癌癥凋亡的抑制劑，也可以成為癌癥的治療靶點(diǎn)，還可以開發(fā)Serpins類抑制劑作為治療試劑。但Serpins作用機(jī)理非常復(fù)雜，目前研究多為初步研究，將其成功研發(fā)成為臨床腫瘤藥物需要科研工作者進(jìn)一步揭示作用機(jī)理。