玉米種子純度快速分子檢測(cè)技術(shù)及試驗(yàn)研究

王培珍 魏璇 藺芳瑞 蔡俊琴 李潔

在保證種子質(zhì)量的問(wèn)題上，玉米種子是一個(gè)重要的代表。保證玉米種子的純度和真實(shí)性是控制玉米種子質(zhì)量的關(guān)鍵。同時(shí)，借助現(xiàn)代化新農(nóng)業(yè)技術(shù)和基因鑒定技術(shù)鑒定玉米種子純度也成了解決問(wèn)題的核心。通過(guò)基因鑒定技術(shù)，可以快速準(zhǔn)確地鑒定出玉米種子是否經(jīng)過(guò)雜交，從而保證玉米種子的質(zhì)量和產(chǎn)量。為了解決種子質(zhì)量和耕地問(wèn)題，需要加大監(jiān)督和管理力度，同時(shí)加強(qiáng)技術(shù)研發(fā)和創(chuàng)新，推廣現(xiàn)代化新農(nóng)業(yè)技術(shù)和基因鑒定技術(shù)，提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率和糧食安全保障能力。

種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的基礎(chǔ)，種子的質(zhì)量直接影響到作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。優(yōu)化種子檢測(cè)技術(shù)是推動(dòng)農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展的重要措施之一。種子的檢查標(biāo)準(zhǔn)包括凈度、發(fā)芽率、水分等，這些指標(biāo)直接關(guān)系到種子的品質(zhì)和生長(zhǎng)能力，因此必須嚴(yán)格控制。同時(shí)，做好安全隔離、選取優(yōu)質(zhì)種子、規(guī)范制種流程、病蟲(chóng)害防治、父本管理和割除等工作也是提高種子的純度、發(fā)芽率的重要手段。玉米種子是廣泛應(yīng)用的種子之一，控制玉米收獲時(shí)間，做好晾曬、脫粒和運(yùn)輸工作，控制種子水分，標(biāo)注種子名稱等是保證玉米種子質(zhì)量的重要步驟。在晾曬和脫粒過(guò)程中，要注意控制溫度、濕度和通風(fēng)，避免種子受到過(guò)度損傷。

一、影響玉米種子質(zhì)量的因素

1、玉米種子的發(fā)芽率

玉米種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要作物之一，其種子的質(zhì)量直接影響到作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。而種子的發(fā)芽率是衡量其質(zhì)量的關(guān)鍵因素。根據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，單粒播種子發(fā)芽率要求不低于92%。這也就意味著，如果玉米種子的發(fā)芽率低于這一標(biāo)準(zhǔn)，就會(huì)影響到種植后的播種效果。

2、玉米種子的品種純度

首先，去雜不干凈是種子純度較差的主要原因之一。種子在收獲后需要經(jīng)過(guò)去雜處理，以保證種子的純度。但是，如果去雜不干凈，就會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)殘留在種子中，從而影響種子的品質(zhì)。其次，隔離不安全也是導(dǎo)致種子純度下降的原因之一。如果不同品種的玉米種植在相鄰的地塊上，就會(huì)發(fā)生雜交現(xiàn)象，這會(huì)影響玉米種子的純度和品質(zhì)。此外，種植方法不夠規(guī)范也會(huì)影響種子的純度。如果種植時(shí)不按照規(guī)范進(jìn)行，比如種植密度過(guò)大或者過(guò)小，就會(huì)導(dǎo)致植株之間的競(jìng)爭(zhēng)過(guò)度，從而影響種子的品質(zhì)。去雄不及時(shí)也會(huì)直接影響玉米種子的純度。

二、玉米種子純度快速分子檢測(cè)技術(shù)

1、機(jī)械視覺(jué)技術(shù)

機(jī)械視覺(jué)技術(shù)是一種包含了人工智能、神經(jīng)生物學(xué)、自然科學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、圖片信息處理、模型認(rèn)知等眾多方面的高新技術(shù)。該技術(shù)主要利用計(jì)算機(jī)模仿人類視覺(jué)功能，從客觀的圖像中抓取視覺(jué)感覺(jué)信號(hào)，經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行信息處理、分析，用于試驗(yàn)測(cè)試、試驗(yàn)控制。機(jī)械視覺(jué)技術(shù)的發(fā)展取代了人工觀察測(cè)量方式，改善了投放于市場(chǎng)的產(chǎn)品質(zhì)量，同時(shí)獲取大量信息，并對(duì)信息進(jìn)行自動(dòng)化處理，可用于設(shè)計(jì)信息、信息集成、信息加工等。因此，在自動(dòng)化制造流程中，機(jī)械視覺(jué)技術(shù)可被廣泛應(yīng)用于工況監(jiān)測(cè)、成品檢測(cè)、品質(zhì)管理等環(huán)節(jié)。

2、分子標(biāo)記技術(shù)

深入理解分子標(biāo)記技術(shù)的核心概念，首先需要明確分子標(biāo)記的定義。在廣義上，分子標(biāo)記指的是可以遺傳且能夠被檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)。而狹義上，分子標(biāo)記特指那些能夠反映出生物個(gè)體或群體基因組中特定差異的DNA片段。這些差異為我們提供了一種獨(dú)特的方法，即通過(guò)檢測(cè)和分析這些DNA序列或蛋白質(zhì)，來(lái)了解生物體中單個(gè)DNA組的變異情況。分子標(biāo)記技術(shù)便是基于這一原理而發(fā)展的，其主要目的是檢測(cè)和分析DNA序列或蛋白質(zhì)，進(jìn)而揭示生物體中DNA組的變異。當(dāng)前，這一領(lǐng)域主要包括兩大技術(shù)路線：隨機(jī)引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)標(biāo)記技術(shù)和特異引物聚合酶鏈?zhǔn)綐?biāo)記技術(shù)。

隨機(jī)引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)標(biāo)記技術(shù)涉及隨機(jī)選擇單核苷酸序列作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。盡管該技術(shù)中檢測(cè)脫氧核糖核酸的范圍不夠明確，但它能夠在擴(kuò)增的DNA范圍內(nèi)形成多態(tài)性分子變化。這些變化主要源自模板DNA的擴(kuò)增范圍差異，進(jìn)而在實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顯性和隱性差異中，反映出不同實(shí)驗(yàn)基因組所在區(qū)域之間的擴(kuò)增結(jié)果差異。與此同時(shí)，特異引物PCR標(biāo)記技術(shù)則基于已知的DNA片段序列。它能夠在常規(guī)的PCR重復(fù)溫度下進(jìn)行有效的擴(kuò)增，并對(duì)特定DNA片段進(jìn)行多態(tài)性研究。這種方法為我們提供了更為精確和可靠的方式來(lái)揭示生物體中DNA組的變異。

3、快速DNA提取方法

在傳統(tǒng)的脫氧核糖核酸（DNA）提取方法中，種子芽或葉片常被用作實(shí)驗(yàn)材料。然而，這種方法存在許多不足，如技術(shù)復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)，且容易引發(fā)交叉感染，進(jìn)而污染實(shí)驗(yàn)環(huán)境，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不良影響。為了克服這些局限性，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)對(duì)多種快速DNA提取方法的收集和比較，最終選擇應(yīng)用多重PCR技術(shù)。多重PCR，也稱為多重引物PCR，其核心是在標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系中同時(shí)加入多對(duì)引物，用以擴(kuò)增不同的DNA片段。從反應(yīng)機(jī)理、試劑使用到操作過(guò)程，多重PCR都與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相似。不過(guò)，與傳統(tǒng)的DNA快速提取方法相比，多重PCR技術(shù)展現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì)，其操作更為簡(jiǎn)便、高效，因而在脫氧核糖核酸檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

三、種子檢測(cè)技術(shù)分析

1、田間檢測(cè)

（1）分析玉米種子的特征

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，玉米是一種重要的糧食作物，其生產(chǎn)過(guò)程中種子的質(zhì)量至關(guān)重要。而玉米種子純度的檢測(cè)是保障種子質(zhì)量不可或缺的一部分。在進(jìn)行玉米種子純度檢測(cè)前，技術(shù)人員需要明確被檢測(cè)玉米種子的特征，包括其品種、生長(zhǎng)習(xí)性、生育特征等，并對(duì)相關(guān)資料進(jìn)行全面收集、分析與整理。觀察圖片是一種重要的檢測(cè)手段，通過(guò)研究種子的親本來(lái)源，了解其種植位置、前作的生長(zhǎng)情況等，可以更好地了解種子的品質(zhì)和特征。這些信息的獲取對(duì)于后期的田間管理具有重要意義，可以為玉米種植效果的保證奠定基礎(chǔ)。

（2）采用正確的檢測(cè)方法

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，種子是農(nóng)作物生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。而為了保證種子的質(zhì)量，就必須進(jìn)行科學(xué)有效地檢測(cè)。然而，檢測(cè)方法的選擇直接影響著檢測(cè)效果，因此必須謹(jǐn)慎選擇。為了保證種子的質(zhì)量，選擇科學(xué)有效的檢測(cè)方法非常重要。不同的檢測(cè)方法擁有不同的要求和標(biāo)準(zhǔn)，因此需要根據(jù)具體情況進(jìn)行選擇。在田間檢測(cè)中，需要?jiǎng)澏▏?yán)格的檢測(cè)區(qū)來(lái)保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性。這樣可以避免外來(lái)因素的干擾，保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。為了保證檢測(cè)區(qū)內(nèi)的一致性，需要種植同一品種的作物，并保證種子來(lái)源一致。這樣可以避免品種的差異對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要選擇相同的地塊，并采用相同的耕作制度、管理模式、栽培方法，控制影響玉米發(fā)育成長(zhǎng)的因素。在對(duì)父本和母本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，需要運(yùn)用科學(xué)的取點(diǎn)方法，如對(duì)角線式、階梯式等，這樣可以避免取樣不均衡對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。

（3）明確不同的檢測(cè)時(shí)期

玉米是我國(guó)重要的農(nóng)作物之一，其種子質(zhì)量直接影響到作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，在種子生產(chǎn)和質(zhì)量檢測(cè)過(guò)程中，對(duì)玉米種子的檢測(cè)至關(guān)重要。而要做好玉米種子的檢測(cè)工作，必須掌握最佳的檢測(cè)時(shí)期，結(jié)合玉米的生長(zhǎng)發(fā)育階段，提高檢測(cè)方法的科學(xué)性。玉米的生長(zhǎng)發(fā)育階段可以分為苗期、花期和成熟期，這幾個(gè)時(shí)期的玉米種子表現(xiàn)最為突出，是種子檢測(cè)的關(guān)鍵階段。在不同的階段，檢測(cè)人員需要采取不同的檢測(cè)方法和技術(shù)手段。在花期階段，檢測(cè)人員需要對(duì)玉米種子的母本和父本進(jìn)行檢測(cè)，以得出準(zhǔn)確的母本雜株率、父本雜株率和母本散粉率。此外，還需要觀察玉米的花色和主軸長(zhǎng)度，對(duì)玉米植株的外在形態(tài)進(jìn)行深入研究和綜合判斷，可以在花期加大檢測(cè)頻率，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率和可靠性。

2、種子純度檢測(cè)

玉米種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不可或缺的一部分，種子的純度是影響作物產(chǎn)量的重要因素。室內(nèi)檢測(cè)是檢測(cè)玉米種子純度的常用方法，不需要完成周期性的種植活動(dòng)，使檢測(cè)更加方便高效。在實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)中，鹽溶性蛋白凝膠電泳、形態(tài)檢測(cè)和SSR分子標(biāo)記檢測(cè)是檢測(cè)種子純度的常用方法。其中，鹽溶性蛋白質(zhì)凝膠電泳檢測(cè)方法需要根據(jù)回歸方程進(jìn)行操作，采用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算方法確定種子純度合格率。形態(tài)檢測(cè)方法需要對(duì)玉米種子的籽粒、幼苗和植株形態(tài)進(jìn)行觀察和檢測(cè)，而SSR分子標(biāo)記檢測(cè)方法需要從玉米植株中提取脫氧核糖核酸，通過(guò)分離、擴(kuò)增等方法進(jìn)行排列，以比較植株之間的差異。隨著現(xiàn)代生物鑒定技術(shù)的發(fā)展，各種新的種子純度檢測(cè)技術(shù)不斷涌現(xiàn)。對(duì)于檢測(cè)人員來(lái)說(shuō)，選擇科學(xué)有效的檢測(cè)方法將更有利于提高作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。

四、玉米種子純度快速分子檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用

1、試驗(yàn)材料

玉米種子：100粒。緩沖液：0.5mol/LNaCl、100mol/LTris-HCL（pH值8.0）、50mol/LMEDTA、5%SDS、1%PVP（pH值8.0）、1×TE緩沖液（Tris-EDTA）、1×TBE（Tris-硼酸）緩沖液、5×TBE（Tris-硼酸）緩沖液、TEMED（四甲基乙二胺）、Acr-Bis（丙烯酰胺+甲叉丙烯酰胺復(fù)合液）、溴化乙錠（EB）。SDS法提取液：酚氯仿異戊醇溶液、氯仿異戊醇溶液、異丙醇溶液、乙醇溶液等。電泳試劑：1.2%瓊脂糖、9%PAGE（聚丙烯酰胺凝膠）。

2、試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)玉米種子純度檢測(cè)要求與快速分子檢測(cè)技術(shù)功能對(duì)試驗(yàn)作出相應(yīng)設(shè)計(jì)。此次試驗(yàn)主要使用DNA快速提取法、通用多重PCR技術(shù)。其中DNA快速提取法分為以下2種：一是參照CTAB法、SDS法提取試驗(yàn)樣本；二是使用快速法提取試驗(yàn)樣本DNA。完成DNA快速提取法后得出DNA濃度和完整性檢測(cè)結(jié)果，使用通用多重PCR技術(shù)鑒定DNA因子并得出試驗(yàn)結(jié)果。

3、試驗(yàn)方法

（1）DNA快速提取法

①SDS法提取DNA。將樣本磨碎后稱取0.1g放入1.5mL的離心管中，加入1mL65℃DNA提取緩沖液后充分混合（緩沖液成分：0.5molNaCl、100molTris-HClpH值8.0、50molMEDTA、5%SDS、1%PVP）；室溫下（26℃），1000g離心10min，取上清1.5mL溶液加入等體積酚氯仿異戊醇后充分混合；室溫下（26℃），1000g離心10min，取上清1.5mL溶液加入等體積氯仿異戊醇后充分混合；室溫下（26℃），1000g離心10min，取上清1.5mL溶液加入等體積異丙醇后充分混合；室溫下（26℃），1000g離心10min，取上清1.5mL溶液加入15μL70%乙醇清洗沉淀，清洗2次；晾干沉淀；加50μL1×TE緩沖液，溶解DNA后置于冷凍室保存，冷凍室溫度為-20℃。

②CTAB法提取DNA，包括DNA完整性電泳檢測(cè)與DNA質(zhì)量PCR擴(kuò)增檢測(cè)。一是DNA完整性電泳檢測(cè)。根據(jù)試驗(yàn)樣本質(zhì)量確定膠量，取1.2%瓊脂糖，1×TBE作為溶劑，將溶液放置于微波爐中使其溶解后取出放涼。待溶液溫度在60℃以下后加入適量EB，將膠倒至膠盒之中，待凝固后取出放入電泳槽；參照上述步驟進(jìn)行濃度加樣；用移液器將膠體加到樣孔之中；接通電源，觀察試驗(yàn)現(xiàn)象。二是DNA質(zhì)量PCR擴(kuò)增檢測(cè)。從樣本中篩選出多態(tài)性高、特異性好的樣本，選取phi0.6用于檢測(cè)。隨后PCR擴(kuò)增檢測(cè)采用20μL擴(kuò)增體系，其中上下游引物各0.5μL；用9%聚丙烯酰胺凝膠溶液檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

（2）PAGE檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

完成DNA質(zhì)量PCR擴(kuò)增檢測(cè)試驗(yàn)操作后需要使用PAGE檢測(cè)樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，具體試驗(yàn)步驟如下：溶液配制（9%聚丙烯酰胺凝膠溶液），使用50mL蒸餾水、20mLTBE、30mL30%Acr-Bis、750μL10%過(guò)硫酸銨、75μL四甲基乙二胺；將配制完成的溶液灌入玻璃制膠板并觀察是否有氣泡產(chǎn)生，待溶液凝固后取出梳架，取出樣孔內(nèi)殘留液體，待樣孔干燥后放置于電泳槽上并注入1×TBE電極緩沖液；吸取2μL擴(kuò)增產(chǎn)物于樣孔內(nèi)；用150V電泳穩(wěn)壓至凝膠底部；電泳結(jié)束后取出凝膠，放置于去離子水中清洗，清洗完成后加入AgNO3溶液并進(jìn)行3min染色，染色完成后加入去離子水清洗，清洗完成后加入顯影液，輕輕搖晃至條帶清晰后即可進(jìn)行清洗；完成清洗后進(jìn)行讀帶，進(jìn)而分析目標(biāo)帶情況。

4、試驗(yàn)結(jié)果

（1）提取液濃度及體積對(duì)DNA提取質(zhì)量的影響

①對(duì)DNA完整性的影響。取10μL試驗(yàn)樣本用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣本DNA的完整性，得出提取液濃度及體積對(duì)玉米種子DNA提取質(zhì)量的影響結(jié)果。從體積梯度分析，200μL體積和400μL體積的試驗(yàn)樣本均呈現(xiàn)出明顯、清晰的主帶效果，但是400μL的主帶效果圖弱于200μL主帶效果。相比之前，600μL的樣品主帶效果更弱，但是仍能觀察到部分成像。800、1000μL的樣品主帶效果幾乎不明顯。從濃度梯度分析，12個(gè)濃度梯度呈現(xiàn)“不明顯—明顯—不明顯”的趨勢(shì)，其中0.01mol/L濃度梯度的成像效果幾乎不明顯，0.2mol/L濃度梯度后的成像逐漸明顯，0.05、0.06、0.07mol/L濃度梯度的成像效果最為明顯。綜合提取液濃度和體積的成像結(jié)果，0.05～0.07mol/L濃度梯度、200～600μL體積梯度為最佳提取液參數(shù)。

②對(duì)PCR產(chǎn)物的影響。取試驗(yàn)樣本2μL行PCR擴(kuò)增，用9%PAGE檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，驗(yàn)證提取液濃度和體積對(duì)玉米種子PCR產(chǎn)物的影響，得出試驗(yàn)結(jié)果效果。從濃度梯度分析，0.01、0.02mol/L的樣品有較弱的目標(biāo)帶成像，0.03、0.04、0.05mol/L的樣品有稍明顯的目標(biāo)帶成像，0.06～0.20mol/L有明顯的目標(biāo)帶成像。從體積梯度分析，200～1000μL溶液均有明顯、清晰的目標(biāo)帶成像。因此，綜合濃度梯度成像結(jié)果以及體積梯度成像結(jié)果得出，0.03～0.20mol/L的濃度梯度、200～1000μL體積梯度的溶液均滿足PCR擴(kuò)增要求。

（2）提取時(shí)間對(duì)DNA提取質(zhì)量的影響

根據(jù)提取液濃度和體積對(duì)玉米種子DNA完整性和PCR產(chǎn)物的影響結(jié)果，采用最佳提取液濃度梯度和最佳體積梯度試驗(yàn)，使用0.05mol/L濃度梯度、500μL積梯度進(jìn)行試驗(yàn)，在40、60、720、1440、2160、2880、4320min觀察后混合提取液，得出試驗(yàn)結(jié)果成像。

①對(duì)DNA完整性的影響。取10μL試驗(yàn)樣品用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得出提取時(shí)間對(duì)DNA完整性有影響，得出提取時(shí)間對(duì)玉米種子DNA完整性的影響試驗(yàn)結(jié)果。1～20min的樣品成像較弱且差異變化不明顯；40min后亮度逐漸增加，各個(gè)梯度之間差異變化逐漸明顯；60min后樣品有明顯、清晰的成像帶；60～2880min樣品差異變化不明顯；4320min的樣品成像呈發(fā)亮狀態(tài)。因此，綜合成像結(jié)果，為了確保玉米種子DNA完整性，將提取時(shí)間控制在1～2880min為佳。

②對(duì)PCR產(chǎn)物的影響。取2μL試驗(yàn)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物試驗(yàn)驗(yàn)證，用9%PAGE檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，研究提取時(shí)間對(duì)PCR產(chǎn)物的影響，得出提取時(shí)間對(duì)玉米種子PCR產(chǎn)物的影響試驗(yàn)結(jié)果。樣品提取時(shí)間在1～2880min成像不明顯，各個(gè)區(qū)間差異變化不顯著；樣品提取時(shí)間在4320min后呈現(xiàn)出的成像帶亮度開(kāi)始減弱，逐漸趨近于無(wú)光亮狀態(tài)。因此，綜合成像結(jié)果，提取時(shí)間在1～2880min的玉米種子樣本均可滿足PCR擴(kuò)增要求。

玉米種子純度快速分子檢測(cè)技術(shù)中機(jī)械視覺(jué)技術(shù)、分子標(biāo)記技術(shù)、DNA快速提取法分別能夠應(yīng)用于玉米種子外觀觀察、DNA序列標(biāo)記、DNA檢測(cè)，是快速檢測(cè)玉米種子純度的重要技術(shù)。此次試驗(yàn)主要綜合DNA快速提取法和PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)玉米種子純度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為2種技術(shù)能夠快速、有效驗(yàn)證玉米種子純度。將2種技術(shù)綜合應(yīng)用于玉米種子純度檢測(cè)，能夠有效提高玉米種子純度鑒定效率，保障玉米種子真實(shí)性和純度，助力農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、種業(yè)市場(chǎng)規(guī)范化、可持續(xù)發(fā)展。

（作者單位：1.015000 內(nèi)蒙古巴彥淖爾市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心；2.015000內(nèi)蒙古巴彥淖爾市現(xiàn)代農(nóng)牧事業(yè)發(fā)展中心）