超聲輔助酶解制備草魚鱗膠原肽的特征風(fēng)味解析

謝俊鴻 趙鈺 胡楊

摘要：該研究以超聲輔助單酶酶解組/分步酶解組的膠原肽為研究對(duì)象，傳統(tǒng)的單酶酶解組和分步酶解組為對(duì)照，通過電子鼻、頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、超高效液相色譜儀、氨基酸分析儀和電子舌對(duì)4組膠原肽的氣味特征和滋味特征進(jìn)行了分析鑒定；同時(shí)，對(duì)4組樣品分別進(jìn)行了感官評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，超聲組揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量和種類均有所提升，其中超聲輔助單酶酶解組種類由20種提高至24種，含量由5 966.70 μg/kg提高至6 422.62 μg/kg，超聲輔助分步酶解組種類由22種提高至24種，含量由6 202.30 μg/kg提高至7 480.43 μg/kg，同時(shí)，超聲組呈味物質(zhì)的含量也有所上升，呈鮮味的肌苷酸和鳥嘌呤核苷酸含量均有所提高，苦味氨基酸和鮮味氨基酸含量也有所提高，即超聲會(huì)影響揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和滋味物質(zhì)核苷酸和游離氨基酸的種類和含量，在一定程度上可以改善膠原肽的氣味特征和滋味品質(zhì)。此外，感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明，超聲組整體風(fēng)味輪廓較好，鮮味有所提升，腥味/異味有所降低，為超聲輔助酶解工藝制備膠原肽的風(fēng)味研究提供了支持。

關(guān)鍵詞：草魚鱗膠原肽；超聲；氣味特征；滋味特征；風(fēng)味品質(zhì)

中圖分類號(hào)：TS201.2 ?????文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ????文章編號(hào)：1000-9973（2024）04-0001-10

Analysis of Characteristic Flavor of Grass Carp Scale Collagen Peptides

Prepared by Ultrasound-Assisted Enzymatic Hydrolysis

XIE Jun-hong， ZHAO Yu， HU Yang*

（College of Food Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract： In this study， with collagen peptides of ultrasound-assisted single enzyme enzymatic hydrolysis group/stepwise enzymatic hydrolysis group as the research object， and traditional single enzyme enzymatic hydrolysis group and stepwise enzymatic hydrolysis group as the control， odor and taste characteristics of the four groups of collagen peptides are analyzed and identified by electronic nose， headspace solid-phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry， ultra-high performance liquid chromatography， amino acid analyzer and electronic tongue. At the same time， sensory evaluation is carried out on the four groups of samples respectively. The results show that the content and types of volatile flavor substances in the ultrasound groups both increase， among which， the types of the ultrasound-assisted single enzyme enzymatic hydrolysis group increase from 20 to 24， the content increases from 5 966.70 μg/kg to 6 422.62 μg/kg， and the types of the ultrasound-assisted stepwise enzymatic hydrolysis group increase from 22 to 24， the content increases from 6 202.30 μg/kg to 7 480.43 μg/kg. Meanwhile， the content of flavor substances in the ultrasound groups also increases， with an increase in the content of inosinic acid and guanine nucleotides， as well as a certain degree of increase in the content of bitter amino acids and umami amino acids， which indicates that ultrasound can affect the types and content of nucleotides and free amino acids of volatile flavor substances and taste substances， and can improve the odor characteristics and taste quality of collagen peptides to a certain extent. In addition， the results of sensory evaluation show that the overall flavor profile of the ultrasound groups is better， the umami is improved， and the fishy/unpleasant odor is reduced. This study has provided support for the study

膠原肽是膠原水解得到的一種介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的物質(zhì)，魚鱗膠原肽分子量主要分布在500～1 000 u[1]，具有抗氧化、抗衰老、降血糖等多種生理功能，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域[2]。酶解法具有反應(yīng)條件溫和、對(duì)環(huán)境污染小、水解程度相對(duì)較高等優(yōu)點(diǎn)，是制備膠原肽的常用方法[3]。然而，在酶解法制備過程中會(huì)產(chǎn)生疏水性氨基酸，使多肽產(chǎn)生苦味，并且脯氨酸殘基可以輔助多肽形成回轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)而加重苦味；此外，分子量不同的膠原肽呈味特性不同，表現(xiàn)為不同的滋味感受[4]。

近年來，不少學(xué)者將超聲應(yīng)用于蛋白/肽的分離提取，發(fā)現(xiàn)超聲輔助酶解能一定程度上影響終產(chǎn)物的風(fēng)味品質(zhì)[5]。Li等[6]采用超聲預(yù)處理對(duì)蛤蜊肉進(jìn)行酶解，發(fā)現(xiàn)超聲預(yù)處理提高了包括游離氨基酸、5′-核苷酸和琥珀酸在內(nèi)的滋味物質(zhì)含量，促進(jìn)了令人愉快的揮發(fā)性化合物的形成并降低了令人不愉快的揮發(fā)性化合物含量。步營等[7]采用超聲輔助法提取藍(lán)蛤中呈味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)超聲處理后藍(lán)蛤提取液中氨基態(tài)氮含量顯著提高，同時(shí)從超聲處理后的藍(lán)蛤提取液中鑒定出28種揮發(fā)性化合物。目前有關(guān)超聲輔助酶解制備膠原肽風(fēng)味方面的報(bào)道較少，且大都局限于酶解液風(fēng)味的研究，鮮有對(duì)超聲作用于酶解過程制備的膠原肽產(chǎn)品風(fēng)味的系統(tǒng)評(píng)價(jià)。

因此，本研究以優(yōu)選的超聲輔助單酶酶解/分步酶解工藝制備的膠原肽為對(duì)象，傳統(tǒng)單酶酶解/分步酶解工藝制備的膠原肽為對(duì)照，通過電子鼻、電子舌比較超聲對(duì)膠原肽氣味和滋味特性的影響，通過頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（SPME-GC-MS）比較超聲對(duì)膠原肽揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，通過考察核苷酸和游離氨基酸含量變化比較超聲對(duì)膠原肽滋味物質(zhì)的影響，為后續(xù)膠原肽風(fēng)味品質(zhì)的改良提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料

草魚鱗：購于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菜市場。

1.1.2 主要化學(xué)試劑

堿性蛋白酶（200 U/mg）、風(fēng)味酶（20 U/mg）、次黃嘌呤（Hx）、次黃嘌呤核苷（HxR）、5′-次黃嘌呤核苷酸（IMP）、5′-一磷酸腺苷（AMP）、5′-二磷酸腺苷（ADP）、5′-三磷酸腺苷（ATP）、5′-一磷酸鳥苷（GMP）標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；環(huán)己酮標(biāo)準(zhǔn)品：阿拉丁試劑（上海）有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

A300型氨基酸分析儀 德國曼默博爾公司；FOX4000型電子鼻、Astree電子舌 法國阿爾法莫斯儀器公司；7000D型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 新加坡安捷倫儀器公司；Acquity UPLC I-Class超高效液相色譜儀 美國沃特世公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的制備

稱取一定質(zhì)量草魚鱗，用蒸餾水調(diào)節(jié)底物濃度，在不同超聲條件下處理，凍干備用。以實(shí)驗(yàn)室前期趙鈺等[1]優(yōu)選的超聲輔助單酶酶解/分步酶解的最佳工藝為基礎(chǔ)，傳統(tǒng)的單酶酶解和分步酶解為對(duì)照，考察超聲對(duì)酶解膠原肽滋味特征的影響。超聲輔助單酶酶解的試驗(yàn)條件：堿性蛋白酶用量為420 U/g，酶解溫度為60 ℃，初始 pH 值為8.0～8.5，酶解時(shí)間為4 h，在酶解過程中分別進(jìn)行20 min不同功率（0～600 W）的超聲處理，超聲輔助分步酶解的試驗(yàn)條件：第一步酶解的堿性蛋白酶用量為 420 U/g，酶解溫度為60 ℃，初始 pH值為8.0～8.5，酶解時(shí)間為3 h，在酶解過程中進(jìn)行10 min、300 W的超聲處理；第二步酶解的風(fēng)味酶用量為420 U/g，酶解溫度為60 ℃，酶解時(shí)間為2 h，在酶解過程中進(jìn)行10 min、300 W的超聲處理。

1.3.2 電子鼻和電子舌測定

電子鼻測定參照蔡禮彬等[8]的方法并略作修改。測試條件：取不同方法制備的膠原肽0.4 g于20 mL頂空瓶中，電子鼻載氣為空氣，流速為150 mL/min。頂空產(chǎn)生條件：頂空產(chǎn)生溫度50 ℃，攪拌速度500 r/min，注射體積2.5 mL，注射針溫度60 ℃，獲取時(shí)間120 s，延滯時(shí)間300 s。

電子舌測定：取1 g樣品溶于100 mL超純水中，過濾，放置在樣品杯中，傳感器每秒采集一個(gè)數(shù)據(jù)，采集時(shí)間共 120 s，選取每根傳感器第 120 s 的響應(yīng)值進(jìn)行分析。

1.3.3 氣味物質(zhì)的定性與半定量

揮發(fā)性風(fēng)味成分的測定參考楊姣等[9]的方法并略作修改。氣相條件：萃取頭45 ℃ 萃取 60 min，GC進(jìn)樣口溫度250 ℃，解吸附時(shí)間8 min，使用HP-5MS色譜柱進(jìn)行分離。升溫程序：40 ℃ 保溫4 min，以4 ℃/min升溫至230 ℃，保持5 min。載氣為氦氣，流速為2 mL/min。電子沖擊（EI）能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，全掃描模式。樣品在動(dòng)態(tài)頂空吸附前加入1 μL環(huán)己酮（2 mg/mL）作內(nèi)標(biāo)，根據(jù)峰面積比計(jì)算揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量，計(jì)算公式如下：

Cx=Co×Vo×SxCo×m。（1）

式中：Cx為未知揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量，μg/kg；Co為內(nèi)標(biāo)化合物質(zhì)量濃度，μg/mL；Vo為內(nèi)標(biāo)化合物進(jìn)樣體積，μL；Sx為未知風(fēng)味化合物峰面積，AU·min；So為內(nèi)標(biāo)化合物峰面積，AU·min；m為試樣的質(zhì)量，kg。

1.3.4 氣味活性值的測定

嗅感物質(zhì)的絕對(duì)濃度與其感覺氣味閾值的比值被稱為氣味活度值（odor activity value，OAV）。當(dāng)OAV>1時(shí)，則該物質(zhì)濃度的高低會(huì)影響整體氣味特征；當(dāng)OAV<1時(shí)，則該物質(zhì)不是決定總體氣味特征的主要組分。計(jì)算公式如下：

OAV=CT。（2）

式中：C為風(fēng)味物質(zhì)的含量，μg/kg；T為該風(fēng)味物質(zhì)在水中的感覺閾值，μg/kg。

1.3.5 游離氨基酸分析

稱取0.25 g樣品，用10 mL 10%磺基水楊酸溶解，于4 ℃靜置?2 h。以8 000 r/min離心10 min，取100 μL上清液加入 900 μL 0.02 mol/L鹽酸溶液，再加入1 mL正己烷，渦旋混勻后以12 000 r/min離心3 min，取下層溶液，用0.22 μm濾膜過濾下層溶液，用氨基酸自動(dòng)分析儀測定。

1.3.6 核苷酸分析

參考劉敬科[10]的方法并略作修改。稱取0.4 g樣品，加入30 mL 5%冷高氯酸，超聲振蕩5 min，在4 ℃下以8 000 r/min 離心20 min 取上清液。使用冷高氯酸洗滌沉淀物2次，使用NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.5，使用超純水定容至100 mL，過0.22 μm濾膜，將濾液置于液相進(jìn)樣瓶中待測。

將核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品（Hx、HxR、AMP、IMP、GMP、ADP、ATP）分別配制成5，100，125，250，500 pmol/μL的濃度梯度，測定條件相同，標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1。

1.3.7 滋味活度值（taste activity value，TAV）測定

滋味物質(zhì)濃度與其滋味閾值的比值可以表示呈味核苷酸和呈味氨基酸的滋味活度值。當(dāng)TAV≥1 時(shí)，呈味物質(zhì)對(duì)食品的滋味有貢獻(xiàn)，其值越大貢獻(xiàn)越大；當(dāng) TAV＜1 時(shí)，呈味物質(zhì)對(duì)食品的滋味無貢獻(xiàn)[11]。

TAV=CT。（3）

式中：C為滋味物質(zhì)的含量，mol/L；T為該滋味物質(zhì)在水中的滋味閾值，mol/L。

1.3.8 味精當(dāng)量值（equivalent umami concentration， EUC）測定

味精當(dāng)量值指鮮味氨基酸與呈味核苷酸協(xié)同作用產(chǎn)生的鮮味強(qiáng)度相當(dāng)于多少濃度的谷氨酸鈉所產(chǎn)生的鮮味強(qiáng)度。計(jì)算公式如下：

EUC=∑am+1 218∑ambm（∑anbn）。（4）

式中：EUC為味精當(dāng)量，g MSG/100 g；1 218為協(xié)同作用常數(shù)；am為鮮味氨基酸濃度，g/100 g；bm為鮮味氨基酸相對(duì)于谷氨酸鈉（MSG）的鮮度系數(shù)，天冬氨酸的鮮度系數(shù)為0.077，谷氨酸的鮮度系數(shù)為1；an為呈味核苷酸濃度，g/100 g；bn為呈味核苷酸相對(duì)于肌苷酸的鮮度系數(shù)為1。

1.3.9 感官評(píng)價(jià)

取1 g膠原肽溶于100 mL水中，選擇10位有感官品嘗經(jīng)驗(yàn)的人員組成感官評(píng)定小組，對(duì)傳統(tǒng)酶解法和超聲輔助酶解法制得的膠原肽在溶液色澤、腥味、鮮味、苦味、異味5個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照楊琬琳[12]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析，顯著性分析取 95%置信度（P<0.05），采用Origin 2017軟件作圖。電子鼻和電子舌數(shù)據(jù)通過 Alpha Soft 12.3 軟件初步處理，采用Origin 2017 軟件進(jìn)行主成分分析作圖。采用Qualitative Analysis 10.0 軟件進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲對(duì)膠原肽氣味特性的影響

判別因子分析（DFA）見圖1中A，其DF1和DF2的貢獻(xiàn)率分別為92.134%和7.527%，總貢獻(xiàn)率為99.661%（>95%），幾乎包含了樣品的所有信息，能很好地反映樣品的基本信息和樣品間差異。不同組別膠原肽整體氣味特征分布由不同顏色區(qū)域代表，區(qū)域之間的距離表明樣品之間的差異性，不同組別膠原肽具有差異性，說明超聲對(duì)膠原肽的氣味特征有明顯影響。FB組和J10組區(qū)域距離較近；J0組和J300組區(qū)域距離較近，說明FB組和J10組以及J0組和J300組的氣味特征較相似。

電子鼻氣味特征雷達(dá)圖見圖1中B，各組樣品的風(fēng)味輪廓形狀大致相似，其中FB組和J10組對(duì)T30/1、P10/1、P40/1、PA/2、P30/1、P40/2、P30/2、T40/2、T70/2有較高的響應(yīng)值；J0組和J300組對(duì)PA/2、P40/1、P10/2、P10/1、T70/2有較高的響應(yīng)值。P10/2探頭主要對(duì)應(yīng)烴類物質(zhì)，J10組對(duì)P10/2的響應(yīng)值最大，而J0組對(duì)P10/2的響應(yīng)值最小，說明超聲輔助酶解過程中產(chǎn)生了較多烴類物質(zhì)，與蔡天[13]研究控溫超聲輔助酶解對(duì)蘋果濁汁風(fēng)味影響的結(jié)果相一致。此外，不同方法制備的膠原肽對(duì)T40/2、P30/2、P40/2、P30/1、PA/2、T70/2、T30/1、P10/1型傳感器的響應(yīng)值差異較大。其中PA/2探頭對(duì)應(yīng)的物質(zhì)主要是氨、胺類化合物，是魚腥味的主要來源，由雷達(dá)圖可以看出FB組和J0組對(duì)PA/2的響應(yīng)值高于J300組和J10組，說明超聲可以在一定程度上降低腥味[14]。

2.2 超聲對(duì)膠原肽揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

采用SPME-GC-MS測定了4組膠原肽揮發(fā)性成分含量和種類的變化。由圖2中A可知，酯類和醛類物質(zhì)的含量均較高，占比較大。有學(xué)者研究水產(chǎn)品下腳料酶解前后的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)時(shí)也發(fā)現(xiàn)其主要的揮發(fā)性物質(zhì)為酯類和醛類化合物[15]。由圖2中B可知，膠原肽產(chǎn)品中共鑒定出47種揮發(fā)性物質(zhì)，其中J0組20種，J300組22種，F(xiàn)B組22種，J10組24種，超聲組揮發(fā)性物質(zhì)的種類略有提高。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)名稱、含量和氣味描述見表3。

由表3可知，烯類物質(zhì)是脂肪酸烷氧自由基均裂產(chǎn)生的[16]，烯類物質(zhì)在4組中占比分別為15.41%（J0組）、14.97%（J300組）、14.79%（FB組）、14.17%（J10組）。烯類物質(zhì)的氣味閾值不高，故對(duì)主體風(fēng)味的影響較大，超聲組烯類物質(zhì)的相對(duì)含量較低，分步酶解組烯類物質(zhì)的含量均低于單酶酶解組，可能是因?yàn)橛行┫╊愇镔|(zhì)是合成醛類和醇類的前體物質(zhì)，在超聲或是第二步酶解時(shí)烯類通過一系列降解反應(yīng)生成其他物質(zhì)，如醛類、酮類[17]，這些降解反應(yīng)的發(fā)生可能是因?yàn)樘幱诳栈葜械乃畷?huì)發(fā)生分裂和鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)生氧化性強(qiáng)的自由基，從而促使烴類降解[18]。J10組中檢測出具有黑胡椒味的水芹烯和具有丁香香氣的石竹烯等，可能是蛋白酶分解蛋白質(zhì)生成的[19]。

醛類物質(zhì)的閾值較低，對(duì)產(chǎn)品的總體氣味貢獻(xiàn)較大。蛋白質(zhì)經(jīng)過Strecker降解反應(yīng)可以生成醛類物質(zhì)，同時(shí)蛋白/肽在高溫下發(fā)生脫羧和脫氨基反應(yīng)也可以生成醛類物質(zhì)[20]。4組樣品中醛類物質(zhì)的占比分別為32.82%（J0組）、33.08%（J300組）、34.37%（FB組）、31.96%（J10組）。所有組中具有杏仁味的苯甲醛占醛類含量的比例最高，4組樣品中苯甲醛占比分別為60.26%（J0組）、64.43%（J300組）、59.99%（FB組）、88.82%（J10組），可以看出超聲組苯甲醛的含量均高于未超聲組，可能是超聲處理所產(chǎn)生的極端壓力和溫度條件使氨基酸/肽發(fā)生脫羧和脫氨基反應(yīng)生成苯甲醛[21]。壬醛在濃度較高時(shí)呈現(xiàn)出腥味和腐敗味，而在濃度較低時(shí)呈現(xiàn)出青草味，在4組樣品中壬醛在醛類中的占比分別為22.36%（J0組）、20.54%（J300組）、18.71%（FB組）和未檢出（J10組），超聲組中壬醛含量均下降，說明超聲在一定程度上可以改善風(fēng)味。同時(shí)在超聲組中還檢測到有玫瑰花香味的紫蘇醛，可能是在酶的作用下蛋白質(zhì)水解生成氨基酸，氨基酸進(jìn)一步降解生成的[22]。

醇類物質(zhì)的風(fēng)味閾值相對(duì)較大，故其對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味貢獻(xiàn)不大。醇類主要通過蛋白質(zhì)的Strecker降解和氨基酸的降解產(chǎn)生[20]，同時(shí)羰基化合物還原也可生成醇類物質(zhì)。醇類物質(zhì)一般具有令人愉悅的氣味，2-乙基己醇具有花香味，1-辛炔-3-醇具有丁香味，2，6-二甲基-7-辛烯-2-醇具有蘑菇味，α-松油醇具有水果香氣，可以起到掩蓋不良?xì)馕兜淖饔?。在單酶酶解組中，具有丁香味的1-辛炔-3-醇的含量占比由超聲前的38.46%升至超聲后的51.36%，在分步酶解組中，在超聲組中檢測出具有水果香氣的α-松油醇，推測超聲可以在一定程度上改善氣味特征。蛋白質(zhì)的Strecker降解和氨基酸的降解反應(yīng)均可以生成酯類物質(zhì)，同時(shí)還原糖通過美拉德反應(yīng)也可以生成酯類物質(zhì)，酯類物質(zhì)通常具有令人愉快的氣味，從而對(duì)風(fēng)味產(chǎn)生積極影響。

酮類物質(zhì)可以由氨基酸的降解和還原糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)生。酮類物質(zhì)的閾值一般高于醛類，在膠原肽樣品中只檢測出具有紫羅蘭花香味的α-紫羅蘭酮和具有樟腦味的茨酮，且均在未超聲組中檢測出，這可能是因?yàn)槌曁幚懋a(chǎn)生的熱效應(yīng)使其在高溫過程中被還原或是參與其他反應(yīng)導(dǎo)致其未被檢測出。有學(xué)者研究表明在臘肉制品中酚類物質(zhì)十分常見[23]，會(huì)對(duì)臘肉的整體風(fēng)味產(chǎn)生較大貢獻(xiàn)，酚類物質(zhì)可能來源于氨基酸的降解。在4組中，酚類物質(zhì)的含量占比分別為5.71%（J0組）、15.82%（J300組）、2.30%（FB組）、7.84%（J10組），超聲組中酚類物質(zhì)的含量占比均有提升，這可能是由于超聲作用促進(jìn)了氨基酸的降解。同時(shí)4組樣品中均有少量的含硫、含氮類物質(zhì)。甲硫氨酸熱降解會(huì)產(chǎn)生含硫化合物，蛋白質(zhì)降解會(huì)產(chǎn)生含氮化合物[24]。在4組樣品中，超聲后具有不良?xì)馕兜亩谆蚝拷档?，而具有?jiān)果味的吲哚含量升高，故超聲可在一定程度上改善產(chǎn)品的氣味。

2.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的氣味活度值（OAV）

OAV分析結(jié)合氣味閾值可以更好地判定產(chǎn)品的整體風(fēng)味。為了進(jìn)一步確定在4組樣品中對(duì)產(chǎn)品的整體風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)的物質(zhì)，通過對(duì)OAV進(jìn)行計(jì)算，得到4組膠原肽的氣味活度值，見表4。

在一定范圍內(nèi)某種物質(zhì)對(duì)總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)值與其OAV呈正相關(guān)。由表4可知，水芹烯、石竹烯、苯甲醛、壬醛、β-環(huán)高檸檬醛、1-辛炔-3-醇、α-紫羅蘭酮、4-乙基愈創(chuàng)木酚、二甲基二硫?qū)δz原肽產(chǎn)品的整體風(fēng)味均有貢獻(xiàn)。且具有檸檬味的β-環(huán)高檸檬醛、具有泥土味的壬醛、具有蒜味的二甲基二硫的OAV較大。此外，經(jīng)過超聲處理后一些具有愉快氣味的物質(zhì)例如具有杏仁味的苯甲醛、具有木香的4-乙基愈創(chuàng)木酚的OAV有所增加，同時(shí)具有蒜味的二甲基二硫、具有泥土味的壬醛的OAV有所降低，說明超聲在一定程度上影響了樣品的風(fēng)味特征。

2.4 超聲對(duì)膠原肽滋味特性的影響

由圖4中A可知，膠原肽的PC1和PC2貢獻(xiàn)率分別為98.030%和1.649%，總貢獻(xiàn)率為99.679%（>95%），幾乎包含了樣品的所有信息，可以較好地反映出樣品的基本信息和樣品之間的差異性，不同顏色區(qū)域代表4組樣品的整體滋味特征分布，而不同區(qū)域之間距離表明樣品間的差異性。4組膠原肽樣品的滋味特征差異明顯，說明超聲對(duì)膠原肽產(chǎn)品的滋味品質(zhì)有顯著影響。此外，J10組和FB組滋味特征區(qū)域距離較近，說明其滋味特征相似。由圖4中B可知，4組樣品的風(fēng)味輪廓形狀相似，以鮮味和苦味為主。步營等[7]在研究不同預(yù)處理方式對(duì)藍(lán)蛤提取液滋味特征的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，超聲對(duì)藍(lán)蛤提取液滋味特征的差異主要體現(xiàn)在苦味和鮮味上。分步酶解組苦味和鮮味均低于單酶酶解組，同時(shí)超聲組苦味和鮮味也低于未超聲組，說明超聲和酶解可以降低苦味，改善滋味特征。

2.5 超聲對(duì)膠原肽核苷酸及其降解產(chǎn)物的影響

由表5可知，J0組IMP含量最高，為0.38 mmol/dL，其次是ADP，為0.08 mmol/dL。J300組IMP含量最高，為1.05 mmol/dL，其次是Hx，為0.23 mmol/dL。FB組GMP含量最高，為0.72 mmol/dL，其次是IMP，為0.47 mmol/dL。J10組GMP含量最高，為0.86 mmol/dL，其次是IMP，為0.61 mmol/dL。所有組均未檢測出AMP和ATP，可能是因?yàn)轸~鱗中AMP的含量本就不多，且AMP脫氨酶可以不可逆地水解AMP，使其生成IMP，一般當(dāng)溫度高于60 ℃時(shí)該酶會(huì)失活，可能是水解產(chǎn)物中存在一些金屬離子，導(dǎo)致酶失活，溫度升高，故AMP會(huì)降解生成IMP。

對(duì)比J300組和J0組，發(fā)現(xiàn)超聲后可檢測出的核苷酸及其降解產(chǎn)物IMP、ADP含量均高于未超聲組，可能是超聲處理有利于核苷酸的積累和釋放，同時(shí)超聲組比未超聲組多檢測出Hx和HxR，可能是超聲產(chǎn)生的熱效應(yīng)加速了熱極不穩(wěn)定的IMP的分解進(jìn)而生成Hx和HxR。對(duì)比J10組和FB組，發(fā)現(xiàn)超聲后核苷酸及其降解產(chǎn)物的含量除HxR外均高于未超聲組，說明超聲處理有利于核苷酸的釋放和積累。有研究表明超聲處理提高GMP含量的效果顯著，GMP的釋放與超聲呈正比，可能是超聲產(chǎn)生的熱效應(yīng)會(huì)激活有關(guān)酶，促進(jìn)RNA分解，進(jìn)而產(chǎn)生更多的GMP[25]。水解度的高低與核苷酸及其降解產(chǎn)物的含量相關(guān)，對(duì)比單酶酶解組和分步酶解組，發(fā)現(xiàn)分步酶解組的核苷酸及其降解產(chǎn)物總含量高于單酶酶解組，因?yàn)榉植矫附獾拿附獬潭缺葐蚊该附飧撸渌舛纫哺哂趩蚊该附饨M[4]。超聲后無論是單酶酶解組還是分步酶解組中鮮味核苷酸和苦味核苷酸的含量均有所提高，且主要提高鮮味核苷酸的含量，故超聲會(huì)影響膠原肽的滋味。

2.6 超聲對(duì)膠原肽游離氨基酸的影響

游離氨基酸類物質(zhì)是一類非揮發(fā)性含氮滋味化合物，具有豐富的味感，對(duì)產(chǎn)品的滋味有貢獻(xiàn)，通常具有鮮味、甜味和苦味。不同超聲條件下制備的膠原肽中游離氨基酸含量比較見表6。

由表6可知，4組樣品中共檢測出16種對(duì)滋味有貢獻(xiàn)的氨基酸。J0組未檢測出具有鮮味的天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu），苦味氨基酸甲硫氨酸（Met）、酪氨酸（Tyr）、組氨酸（His）含量較高，含少量的甜味氨基酸；J300組未檢測出谷氨酸（Glu）和苯丙氨酸（Phe），含微量的鮮味氨基酸天冬氨酸（Asp），苦味氨基酸甲硫氨酸（Met）、纈氨酸（Val）、酪氨酸（Tyr）含量較高，甜味氨基酸丙氨酸（Ala）含量較高；FB組檢測出15種對(duì)滋味有貢獻(xiàn)的氨基酸，苦味氨基酸異亮氨酸（Ile）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）含量較高，甜味氨基酸丙氨酸（Ala）含量較高，含少量的鮮味氨基酸；J10組苦味氨基酸異亮氨酸（Ile）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）含量較高，且含鮮味氨基酸天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）。

對(duì)比J0組和J300組，發(fā)現(xiàn)超聲后總氨基酸含量、苦味氨基酸含量、甜味氨基酸含量、鮮味氨基酸含量均顯著提高（P<0.05）；苦味氨基酸除精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）外，其余含量超聲后均提高；鮮味氨基酸經(jīng)超聲后檢測出少量的天冬氨酸（Asp）；甜味氨基酸經(jīng)超聲后脯氨酸（Pro）的含量顯著提高（P<0.05）。對(duì)比FB組和J10組，發(fā)現(xiàn)超聲后總氨基酸含量和苦味氨基酸含量顯著提高（P<0.05），鮮味氨基酸含量上升，甜味氨基酸含量無顯著變化；苦味氨基酸除酪氨酸（Tyr）外，其余含量超聲后均提高，超聲后鮮味氨基酸含量均略有上升，甜味氨基酸除蘇氨酸（Thr）外，其余含量超聲后均略有提高?？傮w來看，超聲組的氨基酸含量均有所提高，可能是超聲波的空化作用加速了游離氨基酸的擴(kuò)散，即超聲處理改變了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，更有利于蛋白質(zhì)水解，進(jìn)而蛋白水解物中會(huì)釋放出更多的肽和氨基酸。同時(shí)超聲后苦味氨基酸含量也有提高，有文獻(xiàn)報(bào)道游離氨基酸的呈味特性與疏水性的大小有關(guān)，當(dāng)疏水性大時(shí)主要呈現(xiàn)苦味[26]，原料蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)在超聲作用下展開，疏水基團(tuán)暴露，可能導(dǎo)致超聲后苦味氨基酸含量增加。通常甜味氨基酸的存在可以降低鮮味氨基酸的閾值，苦味氨基酸的存在對(duì)鮮度的提升、口感的持續(xù)性、復(fù)雜性和濃厚感有重要作用，超聲后甜味氨基酸和苦味氨基酸含量均有所上升，故推測超聲可以改善膠原肽的滋味特征。單酶酶解組的游離氨基酸含量少于分步酶解組，可能是游離氨基酸的含量與水解程度呈正相關(guān)，水解度程度越高，游離氨基酸總量越大。不同呈味氨基酸的總含量與電子舌響應(yīng)值之間存在差異，劉泓等[27]利用電子舌判別不同畜禽骨蛋白肽時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)論，對(duì)于鮮味氨基酸含量和鮮味響應(yīng)值之間的差別，可能是鮮味物質(zhì)的閾值較低。對(duì)于苦味氨基酸含量和苦味響應(yīng)值之間的差別，可能是苦味氨基酸不具有味覺活性，通常被鮮味和甜味掩蓋[28]。同時(shí)食品的滋味并不是由單一種類氨基酸決定的，鮮味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸等不同種類游離氨基酸之間的平衡及相互影響是決定滋味的關(guān)鍵因素[29]，同時(shí)一些單糖和無機(jī)離子也會(huì)影響產(chǎn)品的滋味特征。

2.7 超聲對(duì)膠原肽滋味活度值（TAV）的影響

滋味活度值可以評(píng)價(jià)呈味物質(zhì)對(duì)產(chǎn)品整體滋味的貢獻(xiàn)程度。為了對(duì)4組呈味物質(zhì)的滋味貢獻(xiàn)程度作出評(píng)價(jià)，根據(jù)滋味物質(zhì)在水中的閾值，計(jì)算出樣品中可檢測出的呈味核苷酸和呈味氨基酸的滋味活度值（TAV），見表7。

由表7可知，苦味物質(zhì)的滋味活度值基本大于1，J0組Met的TAV最高，其次是His；J300組Met的TAV最高，其次是Val；FB組Val的TAV最高，其次是His；J10組Val的TAV最高，其次是Met。鮮味物質(zhì)中，J10組和FB組Glu的TAV>1，但超聲后鮮味物質(zhì)的TAV基本大于未超聲組，即超聲可以起到提升鮮味的作用。甜味物質(zhì)中，J0組Gly和Ala的TAV>1，J300組Gly、Pro和Ala的TAV>1；FB組Thr、Ala和Gly的TAV>1，J10組Gly和Ala的TAV>1，4組樣品的呈味物質(zhì)對(duì)產(chǎn)品整體滋味的影響和貢獻(xiàn)程度存在差異，即超聲在一定程度上會(huì)對(duì)產(chǎn)品的滋味產(chǎn)生影響。

味精當(dāng)量值（EUC）表示實(shí)際鮮味的變化，不同超聲條件下制備的膠原肽中味精當(dāng)量值見圖5。

由圖5可知，超聲組味精當(dāng)量值較未超聲組均有所提高，說明超聲可以在一定程度上提高產(chǎn)品的鮮味。同時(shí)味精的閾值為0.03 g/100 g，除J0組外，其余組EUC的TAV均大于1，說明在超聲輔助酶解過程中呈味核苷酸和游離氨基酸協(xié)同作用產(chǎn)生的鮮味對(duì)滋味的貢獻(xiàn)顯著，即超聲可在一定程度上提高膠原肽產(chǎn)品的鮮味。

2.8 感官評(píng)價(jià)

從溶液色澤、腥味、鮮味、苦味和異味5個(gè)方面檢驗(yàn)了不同方法制備的膠原肽的感官品質(zhì)，見圖6。

由圖6可知，對(duì)比J0組和J300組，發(fā)現(xiàn)超聲后溶液色澤的評(píng)分由16.8分降低到14.1分，鮮味、腥味、苦味、異味的評(píng)分分別由9.3分上升到11.3分，由9.3分上升到10.8分，由10分上升到11.3分，由14分上升到15.3分，即J300組的色澤比J0組深但其異味、苦味和腥味均低于J0組；同理，對(duì)比FB組和J10組，發(fā)現(xiàn)超聲后溶液色澤、鮮味、腥味、苦味、異味評(píng)分分別由10.5分上升到12.9分，由10分上升到10.7分，由12.7分上升到13.7分，由13.3分上升到14.7分，由16分上升到17.3分，即J10組的色澤、腥味、異味、苦味均低于FB組，而鮮味有所提升，說明超聲可在一定程度上降低產(chǎn)品的異味，提高鮮味，改善其感官品質(zhì)，且酶解條件和超聲條件的不同會(huì)對(duì)溶液色澤產(chǎn)生一定影響。同時(shí)，F(xiàn)B組和J10組的異味、苦味、腥味相較于J0組和J300組有所降低，說明分步酶解可以在一定程度上降低產(chǎn)品的不良風(fēng)味。

3 結(jié)論

采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，在4組樣品中共鑒定出47種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。4組樣品中的酯類和醛類物質(zhì)含量均較高，占比均較大。超聲后令人愉悅的苯甲醛和4-乙基愈創(chuàng)木酚含量增加，同時(shí)令人不愉悅的二甲基二硫和壬醛等含量減少，即超聲可以改善產(chǎn)品的氣味特征。通過計(jì)算OAV鑒定出9種對(duì)產(chǎn)品整體風(fēng)味有貢獻(xiàn)的物質(zhì)，具有檸檬味的β-環(huán)高檸檬醛、具有泥土味的壬醛、具有蒜味的二甲基二硫的OAV較大。超聲后具有鮮味的核苷酸的IMP和GMP含量均有所提高，超聲增加了鮮味氨基酸和苦味氨基酸的含量。食品滋味不是由單一種類物質(zhì)決定的，不同滋味物質(zhì)間的相互作用會(huì)影響食品的風(fēng)味，超聲可以提高EUC，從而提高產(chǎn)品的鮮味，即超聲會(huì)對(duì)產(chǎn)品的滋味特征產(chǎn)生影響。因此，超聲可通過改變揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量、種類以及滋味物質(zhì)核苷酸和游離氨基酸的含量，在一定程度上改善產(chǎn)品的風(fēng)味。

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