基于網(wǎng)絡藥理學和動物實驗探究逍遙丸治療骨質疏松癥作用機制

曠珊珊，張耀文，趙 娜，楊藝欣，解繼勝

（右江民族醫(yī)學院，廣西 百色 533000）

絕經(jīng)后骨質疏松癥（PMOP）是一種常見但慢性的全身性代謝性疾病，嚴重影響女性的生活質量。隨著全球預期壽命的延長，PMOP 已成為主要的公共衛(wèi)生問題［1］。女性絕經(jīng)期有其特殊的生理特點，例如，中醫(yī)中的“天癸竭”癥狀與更年期女性雌激素合成和分泌逐步減少等所導致的機體變化相似，而更年期雌激素合成和分泌減少是導致 PMOP 的主要原因［2］，這一時期的婦女容易出現(xiàn)腎功能障礙和肝郁?！案斡簟笔墙^經(jīng)后骨質疏松癥發(fā)生的特殊機制。［3］，故 疏 肝 理 氣 是PMOP 治 療 中 必 須 重 視 的 環(huán)節(jié)。肝虛不藏血，筋弱不激骨，肝主筋司運動，骨痹的發(fā)病與肝臟關系密切。逍遙丸具有疏肝解郁療效，然而逍遙丸治療骨質疏松（osteoporosis，OP）的具體作用機制尚不明確。因此，在本研究中，為了給闡明OP 治療的作用機制提供參考，利用網(wǎng)絡藥理學預測了OP 治療的潛在靶點通路，根據(jù)預測結果著手于AGEs/RAGE 信號通路關鍵蛋白 rage、IL-6 的表達，以及成骨細胞早期特異性標志物堿性磷酸酶（ALP）和骨細胞外基質的主要成分COL-1觀察 OP 對小鼠骨組織的治療效果，并通過動物實驗驗證了預測結果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性C57BL /6 小鼠，年齡10～12 周、SPF 級、體重（22±2） g ，購自廣東省維通利華有限公司（SCXK（粵）2022-0063），飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學院SPF 級動物實驗中心（許可證號：SYXK 桂2022-0004），實驗動物的生長溫度保持在24 ℃～26 ℃，相對濕度保持在55%～60%。實驗過程嚴格遵守動物實驗中心以及使用指南進行，研究方案獲得了右江民族醫(yī)學院實驗動物倫理委員會的批準（批號：2022101502）。

1.2 實驗試劑

75%酒精、戊巴比妥鈉、生理鹽水、逍遙丸（購自右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院）、4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司，批號：P1110）；RAGE 抗體（稀釋比例1∶300 Rabbit： bs-4999R）、IL6 抗體（稀釋比例1∶300 Rabbit： bs-0782R）、COL-1 抗體（稀釋比例1∶200 Rabbit： bs-10423R）、ALP 抗體（稀釋比例1∶200 Rabbit： A0514）、免疫顯色試劑（MaxVision-HRP 鼠/兔）（ KIT-5030 福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）、Ultra DAB 顯色試劑盒（ DAB-4033 福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）、蘇木精-伊紅（ HE）染色試劑盒（G1120，索萊寶）；熒光倒置顯微鏡（2015236500，Leica DMI3000B）。

1.3 網(wǎng)絡藥理學

通過參考近幾年的文獻資料，選擇利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫［4］對“逍遙丸”藥物成分及相關靶點進行了搜集與分析，篩選出口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18［4］的有效成分，搜集其相關靶標，而后，使用關鍵詞“osteoporosis”在Gene-Cards 等數(shù)據(jù)庫［5］中收集了“骨質疏松癥”的疾病靶點，并通過刪除重復靶點在 Unitprot 數(shù)據(jù)庫中進行了歸一化處理。然后，使用在線制圖工具 Venny 2.1.0 生成韋恩圖，以獲得藥物-疾病交叉靶點，使用生物信息學分析軟件 Cytoscape 3.6.1［6］繪制活性成分、成分相關靶點和疾病相關靶點，構建活性成分-靶點網(wǎng)絡，其中，“節(jié)點”分別代表成分、靶點，“邊”代表節(jié)點之間的相互關系。最后利用DAVID數(shù)據(jù)庫對藥物-疾病交叉靶點進行了GO 及KEGG富集分析［6］，即基于不同的分類思想而儲存的基因相關功能。而后，利用 imageGP 在線繪圖軟件繪制了氣泡圖，對前 20 個 GO 生物功能和前 30 個KEGG 信號通路富集結果進行可視化分析，并將富集結果按P值從低到高進行排序。

1.4 動物模型的建立

實驗小鼠經(jīng)7 d 適應性飼養(yǎng)后，隨機分為4 組，分別為假手術組（Sham）、模型組（Ovx）、逍遙丸高濃度組及低濃度組。實驗小鼠以3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，采用75%乙醇進行局部消毒，通過雙側卵巢摘除法給模型組與藥物組小鼠造模，假手術組切除卵巢附近少量脂肪組織作為對照。術后對小鼠給予大慶霉素消毒3 d 預防感染。

1.5 給藥方法

根據(jù)徐叔云主編《藥理實驗方法學》，進行人與動物劑量換算，逍遙丸以成人9 g 為1 劑的量，則小鼠中劑量為9 g/60 kg×9.1=1.365 g/kg，低劑量為0.683 g/kg，高劑 量為2.73 g/kg，每組8 只，每日1次，連續(xù)喂藥12 周。假手術組和模型組每天接受一次生理鹽水，生理鹽水量根據(jù)動物體重而定，每日1次，持續(xù)12 周。

1.6 HE 染色

根據(jù)說明書操作，將卵巢樣本進行染色并拍照觀察；小鼠股骨經(jīng)EDTA 脫鈣脫鈣液處理1 月后，對小鼠股骨進行 HE 染色。

1.7 Micro CT

將不同組別小鼠的股骨標本周圍的肌肉和韌帶剔除，并在4%多聚甲醛中固定24 h，骨組織晾干后送右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院 Micro-CT 室進行骨組織掃描，以獲得三維顯微 CT 數(shù)據(jù)。

1.8 免疫組化

將保存的小鼠蠟塊進行6 μm 厚連續(xù)性切片，以70 ℃～72 ℃烤片30～60 min 為宜，脫蠟8 min/3 缸，梯度乙醇3 min/每缸，流水沖洗1 min，蒸餾水中浸泡待用，而后高壓修復，蒸餾水清洗后3%過氧化氫室溫孵育，蒸餾水清洗干凈，PAP 筆畫圈，PBS 清洗3 min/3 次，一抗過夜，PBS 緩沖液沖洗，滴加二抗室溫孵育15 min，PBS 緩沖液洗3 min/3 次，DAB 現(xiàn)配現(xiàn)用，孵育3～5 min，自來水終止，再HE 復染，鹽酸酒精液分化，氨水返藍，流水沖洗3 min，梯度乙醇脫水，每缸3 min，透明3 min，中性樹膠固封。

1.9 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均采用 Prism 9 軟件進行分析，以均數(shù)±標準差（±s） 表示，多組間比較使用方差分析（ANOVA）。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 逍遙丸活性成分及作用靶點

根據(jù)OB≥30% 且DL≥0.18 的標準 ，用TCMSP 數(shù)據(jù)庫進行篩選，得到逍遙丸活性成分122個。其 中 薄 荷9 個，當 歸2 個，白 芍6 個，白 術4 個，柴胡11 個，茯苓6 個，甘草82 個，生姜2 個，見表1。

表1 部分中藥成分Tab 1 Some components of traditional Chinese medicine

2.2 “中藥-活性成分-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡分析

在 GeneCards 數(shù)據(jù)庫中，獲得了OP 靶點1 225個，將有效成分靶點與疾病靶點的交叉點繪制成韋恩圖，如圖所示1。根據(jù)OP 靶點與逍遙丸活性成分的相互作用，采用 Cytoscape 軟 件構建 “中藥-活性成分-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡，結果如圖2 所示。結果顯示逍遙丸中甘草、薄荷、生姜等多種活性成分可調(diào) 節(jié) 多 個 靶 點，如CAMKMT、GSK3B、PTGS1、ESR1 等，體現(xiàn)了逍遙丸其多靶點、多成分協(xié)同調(diào)控OP 的作用。

2.3 GO 功能及 KEGG 通路富集分析

在GO 富集分析中，可視化結果如圖3 所示，共得到條目 1 358 個，其中包括 25 個CC 條目、85 個MF 條目、1 248 個 BP 條目。根據(jù)GO 功能分析結果預測，重點靶點主要與外部刺激的反映、對細胞外刺激的反映、對營養(yǎng)水平的反映等有關。 如圖4所示為KEGG 富集分析結果，可富集得到 114 個信號通路，主要包括AGES/RAGE 信號通路、IL-17 信號通路、TNF 信號通路和MAPK 信號通路等，提示逍遙丸可通過多條信號通路對絕經(jīng)后骨質疏松癥發(fā)揮治療作用。

2.4 去卵巢小鼠模型建立及評價

2.4.1 摘除卵巢組織 在小鼠背部兩側的雙側縱切口處摘取粉紅色卵巢進行HE 染色，如果在顯微鏡下能清楚地看到初級卵泡、次級卵泡等，則表明卵巢已順利摘除。結果見圖5。

2.4.2 卵巢組織摘除前后 Micro-CT 對比 與Sham 組小鼠相比，Ovx 組小鼠的股骨骨小梁網(wǎng)狀結構不完整，骨髓腔部分空虛，骨皮質變薄。Sham組小鼠的股骨骨小梁數(shù)量豐富、連續(xù)性好、骨髓腔縮小。結果見圖6。

2.4.3 卵巢組織摘除前后骨組織結構變化 HE 染色結果顯示，在Sham 組小鼠的股骨組織中，骨小梁排列緊密、連續(xù)性好、各骨小梁之間縫隙較小、罕見斷裂、骨髓腔大小正常。與 Sham 組相比，Ovx 組小鼠的股骨排列稀疏，骨小梁斷裂嚴重，連續(xù)性被破壞，骨髓腔明顯增大，呈典型骨質疏松改變。結果見圖7。

2.5 逍遙丸干預后結果

2.5.1 逍遙丸對小鼠行為學影響 本次試驗期間，除OVX 組外，其余小鼠生活習性正常，毛發(fā)顏色正常，活動能力強，健康狀況良好；每只小鼠的尿液和糞便在模型實驗后一周內(nèi)恢復正常，未出現(xiàn)小鼠咬傷，創(chuàng)口感染，胃腸道梗阻，縫合線脫落，切口皮膚壞死或小鼠死亡；灌胃試驗中沒有出現(xiàn)腹部水腫和喉穿孔；整個試驗期間小鼠的飲食，生活，精神狀態(tài)均較好。模型組（Ovx 組）易脫毛，毛的顏色變暗，活動度降低，反射變長，排泄增加，進食飲水減少。

2.5.2 藥物干預后小鼠影像學指標檢測 與Sham組相比，OVX 組小鼠股骨的骨小梁稀疏、斷裂、骨皮質變薄。與OVX 組相比，高劑量逍遙丸組小鼠骨小梁少許斷裂，網(wǎng)狀結構恢復，骨髓腔部分縮小程度明顯，而低劑量逍遙丸組雖然有骨小梁增多，骨髓腔縮小，但仍有骨小梁斷裂現(xiàn)象；假手術組骨小梁結構更具連續(xù)性和完整性。結果見圖8。

2.5.3 藥物干預后小鼠病理切片HE 染色 Sham組股骨組織結構致密、為網(wǎng)狀結構且排列規(guī)則、骨髓腔大小正常且連續(xù)性強，鄰近骨小梁間的間距相對較小。與Sham 組相比，OVX 組股骨皮質和骨松質均出現(xiàn)缺損，骨小梁減少，間隙變大，連續(xù)性中斷，結構變稀疏，骨髓腔增寬，骨皮質變薄。逍遙丸（高，低）組組小鼠股骨中骨小梁的結構較模型組基本完好、間距縮小、連接增加，骨髓腔縮小、結構更致密。結果見圖9。

2.5.4 藥物干預后各組的免疫組化結果 免疫組化的結果顯示，ALP，COL-1，IL-6 以及 RAGE 蛋白的表達陽性反應為骨組織上呈棕黃色或者黃色顆粒。在藥物干預下，藥物組的ALP，COL-1 陽性顆粒表達增多，IL-6，RAGE 陽性顆粒減少。藥物組的 ALP 的平均光密度值均高于模型組，逍遙丸（高，低）組有顯著性差異（P＜0.05）。藥物組的COL-1 的平均光密度值高于模型組，逍遙丸（高，低）組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。藥物組的IL-6 的平均光密度值均低于模型組，逍遙丸（高，低）組的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。藥物組的RAGE 平均光密度均低于模型組，其中，逍遙丸（高，低）組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。免疫組織化學法檢測結果見圖10。

圖1 逍遙丸-骨質疏松癥交集靶點及韋恩圖Fig 1 Xiaoyao pill-osteoporosis intersection targets and wayne diagram

圖2 逍遙丸治療骨質疏松癥“有效成分 - 作用靶點”網(wǎng)絡圖Fig 2 Network diagram of "active ingredient-target" of Xiaoyao pill in the treatment of osteoporosis

圖3 逍遙丸治療骨質疏松癥作用靶點的 GO 分析Fig 3 GO analysis of the target of Xiaoyao pill in the treatment of osteoporosis

圖4 逍遙丸治療骨質疏松癥作用靶點的 KEGG 富集分析Fig 4 KEGG enrichment analysis of Xiaoyao pill in the treatment of osteoporosis

圖5 卵巢樣本 HE 染色（20×）Fig 5 HE staining of ovarian samples （20×）

圖6 Sham 組和Ovx 組小鼠股骨 Micro-CT 掃描結果Fig 6 Micro-CT scan results of femur in Sham and Ovx mice

圖7 兩組小鼠骨骺端骨組織形態(tài)對比（10×）Fig 7 Comparison of epiphyseal bone tissue morphology between two groups of mice （10×）

圖8 逍遙丸治療后各組小鼠股骨顯微CT 比較Fig 8 Comparison of femoral micro-CT of mice in each group after Xiaoyao pill treatment

圖9 逍遙丸治療后各組小鼠股骨切片HE 染色結果（10×）Fig 9 HE staining results of femoral sections of mice in each group after Xiaoyao pill treatment （10×）

圖10 免疫組織化學法檢測逍遙丸對骨質疏松小鼠 AGES/RAGE 信號通路及成骨標記基因蛋白表達的影響（40×）Fig 10 Immunohistochemistry to detect the effect of Xiaoyao pill on the protein expression of AGES/RAGE signaling pathway and osteogenic marker gene in osteoporosis mice （40×）

3 討論

PMOP 的主要病因為絕經(jīng)后婦女卵巢功能減退，雌激素減少分泌，骨礦物質密度降低，從而引發(fā)了進行性骨流失，這是骨質流失的主要原因，主要發(fā)生于中老年女性［7］。 因此，重要的是尋找可以改變或控制的因素以預防骨質疏松癥［8］。

中醫(yī)對本病的病因病機及其治療研究日漸增多。骨痹的發(fā)生與肝有很大的聯(lián)系［9］。中醫(yī)理論認為，疏肝理氣，舒筋活絡，與四肢、肌肉和骨骼的強健密切相關，隨著年齡的增長，肝的藏血功能減退，精血生成不足，其次，中老年女性由于癸水耗損，容易出現(xiàn)肝氣郁結、陰火損傷，最終導致精血不足，或精血功能低下，骨絡失于濡養(yǎng)進而發(fā)生PMOP”［10］。提示在 PMOP 發(fā)病中，肝臟功能起著非常重要的作用。

傳統(tǒng)經(jīng)典婦科良藥逍遙丸以甘草、當歸、茯苓、芍藥、白術、柴胡等為主要原料，具有疏肝解郁、養(yǎng)血健脾的功效，該方最早收錄于宋代《太平惠民和劑局方》。近年有報道稱其在體內(nèi)外均能刺激成骨細胞生成，而成骨細胞是骨的基石，人類骨骼系統(tǒng)生長發(fā)育與其活性及數(shù)量息息相關，成骨細胞隨年齡增加代謝逐漸降低，不敵骨吸收而終形成骨質疏松癥。雷霞等［11］發(fā)現(xiàn)逍遙丸含藥血清對鼠成骨細胞株的增殖有明顯促進作用，成骨細胞作為骨形成的最重要的功能單元，其增殖和分化是預防和治療骨質疏松的重要手段，但其防治PMOP 具體作用機制尚不清楚。ALP 主要表達在骨鈣化區(qū)域，聯(lián)合水解酶作用磷酸酯釋放鈣以沉淀方式附著于膠原骨架上，有利于成骨［12］。骨代謝的微環(huán)境是骨基質，其有機成分的90%為Ⅰ型膠原蛋白［13］。本文研究發(fā)現(xiàn)，藥物組小鼠免疫組化中ALP 及COL-1 蛋白表達水平均高于模型組，說明逍遙丸在改善骨質疏松作用中可通過增加成骨基因指標來實現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)，逍遙丸含藥血清體外可調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖與分化，且成骨細胞的增殖與雌激素受體密不可分［14］。雌激素可通過與雌激素受體結合直接作用于骨組織細胞，推動成骨細胞增殖和分化，促使破骨細胞凋亡并且抑制其活性，從而維持骨吸收與骨形成之間的平衡，保護骨組織［15］。本文研究中，Micro-CT 及HE 染色結果顯示去卵巢小鼠在逍遙丸干預后其骨質程度相比于模型組明顯得到改善（骨小梁增多、斷裂減少、骨髓腔縮小明顯），因此推測逍遙丸可能是通過發(fā)揮雌激素樣骨保護作用增加成骨細胞活性，提高骨質量從而增加ALP、COL-1 等成骨基因表達。

在關于逍遙丸靶向基因與骨質疏松癥之間的網(wǎng)絡藥理學研究中，共發(fā)現(xiàn)有114 條 KEGG 通路。在前 30 條KEGG 通路中，按P值遞增最高的為AGES/RAGE 信號通路。晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）是一組通過非酶促反應形成的分子。這些化合物與多種與年齡相關的疾病有關，其中包含骨質疏松癥［16］。越來越多的證據(jù)表明，AGEs 及其受體 （RAGE） 系統(tǒng)會引發(fā)氧化應激，隨后在血管壁細胞、成骨細胞和破骨細胞中引起炎癥反應，此外，AGEs 在有機骨基質中的交聯(lián)可能對骨的抗斷裂性產(chǎn)生不利影響，說明AGEs 對肌肉骨骼疾病也具有有害作用［17］。據(jù)報道，AGEs 會降低破骨細胞和成骨細胞的分化和功能，并抑制膠原的交聯(lián)活性，導致骨脆性增強［18］，晚期糖基化終產(chǎn)物受體 （RAGE）是免疫球蛋白家族中的一種跨膜蛋白，具有多個配體，并參與許多慢性疾病，例如糖尿病和 OP。 越來越多的證據(jù)表明，RAGE 信號的激活會對骨重塑產(chǎn)生負面影響。其配體，如晚期糖基化終產(chǎn)物 （AGEs）、S100、β-淀粉樣蛋白 （Aβ） 和高遷移率組盒 1（HMGB1），已被充分證明它們可能負向調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖和分化，并正向刺激破骨細胞生成通過激 活 RAGE 的 表 達［19］。鑒 于 AGES/RAGE 信 號通路在骨重建和成骨細胞分化中的重要作用及網(wǎng)絡藥理學kegg 富集分析結果，選擇AGES/RAGE信號通路在動物實驗中進行蛋白檢測，揭示防治OP 藥物的作用機制，以期為骨質疏松的治療提供新思路。本文采用免疫組化法檢測小鼠股骨切片中AGEs-RAGE 通路中RAGE 蛋白及下游因子IL6 的表達，結果顯示藥物組小鼠中RAGE 及 IL6蛋白表達水平均低于模型組，說明逍遙丸可通過抑制AGEs-RAGE 通路，阻止其惡性循環(huán)，從而促進成骨細胞增殖而預防 OP 發(fā)生發(fā)展。

通過背部去勢法為小鼠摘除雙側卵巢［20］，成功建立絕經(jīng)后骨質疏松癥模型，并且，在逍遙丸的干預下，小鼠骨小梁數(shù)量、連接密度均見提高，提示逍遙丸對骨質疏松癥有較好的療效作用。綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學與動物實驗證實，絕經(jīng)后骨質疏松小鼠采用逍遙丸干預后可顯著改善骨代謝，增加骨礦含量與骨度，機制可能與抑制 AGEs-RAGE 通路以及增加成骨因子ALP、COL-1 活性相關。本研究為逍遙丸在治療OP 相關疾病方面的臨床應用奠定理論基礎和實驗依據(jù)。

作者貢獻度聲明：

曠珊珊、趙娜、楊藝欣：對研究的思路或設計有關鍵貢獻并且參與了研究數(shù)據(jù)的獲取分析解釋過程，張耀文、解繼勝：起草或修改文章關鍵內(nèi)容。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。