miR-454-3p 通過(guò)靶向STAT3 調(diào)控CNE-2 人鼻咽癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

胡玉琳，農(nóng)豐靖，林世童，羅麗霞，陳榮彬，劉 津

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院研究生院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，廣西 百色 533000）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma， NPC）是源于鼻咽上皮的鱗狀細(xì)胞癌，種族和地理分布不均，主要發(fā)生于中國(guó)南部及東南亞地區(qū)［1，2］。其特征表現(xiàn)為早期廣泛的局部浸潤(rùn)、高轉(zhuǎn)移率以及高死亡率［3］。目前臨床多采用放化療結(jié)合并輔以分子靶向治療的方法，可以一定程度上減輕患者不良反應(yīng)，但遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)導(dǎo)致患者預(yù)后仍然很差［4，5］。因此探索鼻咽癌更多的發(fā)病機(jī)制，為患者確定可靠的早期診斷生物標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)十分必要［6］。

微小核糖核酸（microRNAs， miRNAs）是一類非編碼單鏈小RNA 分子，全長(zhǎng)約22 個(gè)核苷酸［7］，通過(guò)結(jié)合靶mRNA 的3'-非翻譯區(qū)導(dǎo)致翻譯阻斷和mRNA 降解，在腫瘤進(jìn)展中起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用［8，9］。miR-454-3p 是miR-130-3p/301-3p/454 的miRNA簇的成員。研究發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌中miR-454-3p 呈低表達(dá)，靶向E 盒結(jié)合鋅指蛋白2 有效促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［10］。非小細(xì)胞肺癌中miR-454-3p表達(dá)下調(diào)，靶向轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［11］。而宮頸癌中miR-454-3p 靶向負(fù)調(diào)控含三聯(lián)基元蛋白3，通過(guò)激活p-P38 MAPK 信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡［12］。然而，miR-454-3p 其他靶基因的存在及其在鼻咽癌中的作用尚不清楚。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是一種胞質(zhì)蛋白，在70%左右的腫瘤中呈高表達(dá)［13］。STAT3通常不具有生物學(xué)活性，一旦被激活后可參與調(diào)控腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT），這使得STAT3 可作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)［14］。研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA 同源盒A11反義RNA（HOXA11-AS）通過(guò)螯合miR-454-3p 來(lái)調(diào)節(jié)STAT3，促進(jìn)人類肺腺癌細(xì)胞的順鉑耐藥性［15］。然而關(guān)于miR-454-3p 與STAT3 的靶向關(guān)系及其在鼻咽癌中的作用研究甚少，故本研究以人鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞為研究對(duì)象，探討miR-454-3p 與STAT3 的靶向關(guān)系及其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞EMT 的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2 購(gòu)自上海奧陸生物科技有限公司。1640 培養(yǎng)基、opti-MEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；LipofectamineTM3000 購(gòu)自上海賽默飛世爾科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自內(nèi)蒙古奧普賽生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、彩色預(yù)染蛋白marker、Trizol、基質(zhì)膠購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；miRNA 第一條鏈合成試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自莫納生物科技有限公司；SYBR Green 熒光染料購(gòu)自上海翌圣生物科技股份有限公司；miR-454-3p mimics 及對(duì)照序列（mimics NC）、miR-454-3p inhibitor 及對(duì)照序列（inhibitor NC）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；PCR 引物由南寧捷尼斯生物科技有限公司和上海生工生物工程股份有限公司合成；草酸銨結(jié)晶紫染色液、胰蛋白酶-EDTA 消化液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；STAT3 抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司；N-cadherin、E-cadherin、Vimentin 抗體及HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；GAPDH 抗體、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Affinity 公司。

1.2 組織標(biāo)本

收集2023 年6 月～8 月右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和百色市人民醫(yī)院的鼻咽癌患者共5 例，全部患者均未接受放療和化療，并經(jīng)本院病理科確診為鼻咽未分化型非角化性癌，另外還選取了同期的5 名健康志愿者正常的鼻咽部組織作為對(duì)照組。所有患者在活檢前均簽署了知情同意書。所有組織離體置于液氮中快速冷凍，后存放于-80 ℃冰箱保存。本研究由右江民族醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)進(jìn)行審查，倫理審查編號(hào)為2023052001。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞株接種于T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，使用1640 培養(yǎng)基、10%胎牛血清和1%雙抗，在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液，細(xì)胞生長(zhǎng)至90%以后可以按照1：4 進(jìn)行傳代。

1.4 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染

實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組、miR-454-3p mimics 組、mimics NC 組、miR-454-3p inhibitor 組、inhibitor NC組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：首先將鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞接種于6孔板上，大約24 h 后細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)開(kāi)始轉(zhuǎn)染，分別配制A 液（用Opti-MEM 稀釋LipofectamineTM3000）和B 液（用Opti-MEM 分 別 稀 釋miR-454-3p mimics/mimics negative control/miR-454-3p inhibitor/inhibitor negative control 溶液） ，在室溫下靜置5 min，將A 液與B 液1∶1 混合均勻，在室溫下靜置15～20 min，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組向6 孔板中加入配制好的miR-454-3p mimics/mimics NC/miR-454-3p inhibitor/inhibitor NC 溶液，以未轉(zhuǎn)染的CNE-2 細(xì)胞作為空白對(duì)照組，培養(yǎng)6～8 h 后觀察細(xì)胞狀態(tài)，換液后再繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h 即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)

按照Trizol 試劑說(shuō)明書從組織標(biāo)本和轉(zhuǎn)染24h后的CNE-2 細(xì)胞中抽提總RNA，使用生工公司的miRNA 第一鏈合成試劑盒和莫納生物公司的逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，最后使用翊圣的SYBR Green 對(duì)鼻咽癌和正常鼻咽部組織標(biāo)本、鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2 的miR-454-3p 和STAT3 表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，按照說(shuō)明書設(shè)定反應(yīng)體系。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab 1 Sequences of qRT-PCR primers

1.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

通過(guò)在線生物信息學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站（Targetscan）對(duì)miR-454-3p 與其下游靶基因STAT3之間可能存在的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)并篩選；以STAT3 質(zhì)粒為載體，分別構(gòu)建野生型3′UTR（STAT3 3′UTR-WT）和突變型3′UTR（STAT3 3′UTR-MUT）質(zhì)粒。將兩種質(zhì)粒分別與miR-454-3p 和negative control（NC）充分混勻，通過(guò)LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h 后用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的發(fā)光信號(hào)和海腎熒光信號(hào)。

1.7 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

將CNE-2 細(xì)胞接種于6 孔板中，等到匯合度達(dá)70%～80%時(shí)給予轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后用200 μL 無(wú)菌槍頭垂直于6 孔板板底均勻地劃痕，用PBS 洗滌至無(wú)漂浮的細(xì)胞碎片后在每孔中加入2 mL 無(wú)血清的培養(yǎng)基，在劃痕后0 h 和24 h時(shí)使用顯微鏡觀察劃痕的愈合情況，拍照記錄，計(jì)算劃痕愈合率。

1.8 Transwell 實(shí)驗(yàn)

侵襲實(shí)驗(yàn)：將基質(zhì)膠與RPMI 1640 培養(yǎng)基按比例混勻加入Transwell 上室，37 ℃恒溫箱中凝固3 h。取轉(zhuǎn)染48 h 后的細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，在上室加入200 μL 單細(xì)胞懸液；在下室加入600 μL 含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后棄去上室培養(yǎng)液，PBS 洗滌干凈，將小室先置于組織細(xì)胞固定液中固定20 min，用PBS 洗凈后在甲醇中固定20 min，再用PBS 洗凈后在0.1%結(jié)晶紫溶液中染色20 min，最后將小室洗凈在顯微鏡下觀察透膜細(xì)胞數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)：使用未鋪基質(zhì)膠的Transwell 小室，后續(xù)步驟同上。

1.9 Western blot 實(shí)驗(yàn)

取轉(zhuǎn)染48 h 后的細(xì)胞，用PBS 洗滌后加入細(xì)胞裂解液在冰上裂解20 min，然后用細(xì)胞刮板將細(xì)胞收集于EP 管內(nèi)在冰上繼續(xù)裂解20 min，離心后收集上清液，使用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。首先對(duì)蛋白進(jìn)行電泳分離，上層膠恒壓80 V，下層膠恒壓120 V；濕轉(zhuǎn)法將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，250 mA 恒流，轉(zhuǎn)膜時(shí)長(zhǎng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整，膜在使用前需用甲醇激活；封閉液封閉2 h，在一抗溶液中4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗滌后在二抗溶液中4 ℃孵育2 h，將清洗后的PVDF 膜用顯影液浸潤(rùn)放置在成像儀中曝光顯影。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均使用SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Graphpad Prism 8 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)圖制作。計(jì)量資料以（±s）表示。組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，多組間比較采用單因素方差分析，滿足方差齊性檢驗(yàn)使用LSD 檢驗(yàn)，不滿足方差齊性檢驗(yàn)則使用Welch 檢驗(yàn)和Tamhane's 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌組織標(biāo)本和CNE-2 細(xì)胞株中miR-454-3p 和STAT3 的 表 達(dá)

qRT-PCR 結(jié)果（圖1）顯示，鼻咽部正常組織和鼻咽癌組織中miR-454-3p 的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.06，0.33±0.04（圖1A，t=27.78，P＜0.001），STAT3 的 相 對(duì) 表 達(dá) 量 分 別 為1.00±0.06，1.56±0.21（圖1B，t=-7.65，P＜0.001），與鼻咽部正常組織相比，鼻咽癌組織中miR-454-3p 表達(dá)量降低，而STAT3 表達(dá)量升高。將人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2 進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，qRT-PCR 結(jié)果（表2）顯示，miR-454-3p mimics 組細(xì)胞的miR-454-3p 表達(dá)水平顯著提升（圖2A，P＜0.001），STAT3 的mRNA 表達(dá)水平有所降低（圖2B，P＜0.001）；而miR-454-3p inhibitor 組細(xì)胞的miR-454-3p 表達(dá)水平顯著降低（圖2A，P＜0.001），STAT3 的mRNA 表達(dá)水平有所升高（圖2B，P＜0.01）。

圖1 鼻咽癌組織和正常組織中miR-454-3p 和STAT3 的表達(dá)水平Fig 1 Expression levels of miR-454-3p and STAT3 in nasopharyngeal carcinoma tissues and healthy tissues

圖2 qRT-PCR 檢測(cè)CNE-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-454-3p 和STAT3 的表達(dá)水平Fig 2 Expression levels of miR-454-3p and STAT3 in CNE-2 cells post-transfection assessed by qRTPCR

表2 CNE-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各組miR-454-3p 和STAT3 的相對(duì)表達(dá)量（±s）Tab 2 Relative expression levels of miR-454-3p and STAT3 in each group after transfection of CNE-2 cells（±s）

表2 CNE-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各組miR-454-3p 和STAT3 的相對(duì)表達(dá)量（±s）Tab 2 Relative expression levels of miR-454-3p and STAT3 in each group after transfection of CNE-2 cells（±s）

注：與inhibitor NC、blank group 相比，aP＜0.001；與mimics NC、blank group 相比，bP＜0.001；與inhibitor NC、blank group 相比，cP＜0.01。

STAT3 1.63±0.25c 1.01±0.16 1.00±0.03 1.07±0.15 0.56±0.14b組別miR-454-3p inhibitor 組inhibitor NC 組blank group 組mimics NC 組miR-454-3p mimics 組miR-454-3p 0.03±0.00a 0.95±0.05 1.00±0.02 0.98±0.08 942.65±135.10b

2.2 miR-454-3p 的靶基因分析

根據(jù)Targetscan 軟件預(yù)測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，hsamiR-454-3p 與h-STAT3-3'UTR 之間存在可能結(jié)合的位點(diǎn)。雙熒光素酶結(jié)果（圖4）顯示，與mimics NC組相比，miR-454-3p mimics 組的STAT3-3'UTRWT 質(zhì)粒熒光強(qiáng)度可見(jiàn)明顯下降（t=20.79，P＜0.001），而STAT3-3'UTR-MUT 質(zhì)粒熒光強(qiáng)度沒(méi)有明顯改變（t=-0.16，P=0.89），提示miR-454-3p與STAT3 之間存在靶向結(jié)合關(guān)系。

圖3 hsa-miR-454-3p與h-STAT3-3'UTR結(jié)合位點(diǎn)Fig 3 hsa-miR-454-3p and h-STAT3-3'UTR binding site

圖4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)hsa-miR-454-3p 與h-STAT3-3'UTR 相互作用Fig 4 Interaction between hsa-miR-454-3p and h-STAT3-3'UTR detected by dual-luciferase assay

2.3 miR-454-3p 表達(dá)水平改變對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（表3）顯示，與空白組和NC 組對(duì)比，當(dāng)過(guò)表達(dá)miR-454-3p 時(shí)，CNE-2 細(xì)胞遷移速率有所降低（P＜0.05），空白組和mimics NC 組細(xì)胞遷移速率沒(méi)有很大差異（P＞0.05）；當(dāng)抑制miR-454-3p 時(shí)，CNE-2 細(xì)胞的遷移速率有所提高（P＜0.01），空白組和inhibitor NC 組細(xì)胞遷移速率沒(méi)有很大差異（P＞0.05）（圖5）。

圖5 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CNE-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞體外遷移能力的影響Fig 5 Effect of CNE-2 cell transfection on cell migration ability in vitro detected by Wound healing assay

表3 CNE-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各組的劃痕愈合率對(duì)比（±s）Tab 3 Comparison of scratch healing rate in each group after transfection of CNE-2 cells（±s）

表3 CNE-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各組的劃痕愈合率對(duì)比（±s）Tab 3 Comparison of scratch healing rate in each group after transfection of CNE-2 cells（±s）

注：與inhibitor NC、Blank group 相比，aP＜0.01；與mimics NC、blank group 相比，bP＜0.05。

劃痕愈合率0.47±0.04a 0.32±0.02 0.34±0.05 0.33±0.04 0.24±0.03b組別miR-454-3p inhibitor 組inhibitor NC 組blank group 組mimics NC 組miR-454-3p mimics 組

Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)（表4）顯示，同空白組和NC 組比 較，當(dāng)過(guò)表達(dá)miR-454-3p 后CNE-2 細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)減少（P＜0.001），而空白組和mimics NC 組之間的穿膜細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差異（P＞0.05）；當(dāng)抑制miR-454-3p 后CNE-2 細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)量可見(jiàn)有所增加（P＜0.001），而空白組和inhibitor NC 組之間的穿膜細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差異（P＞0.05）（圖6）。

圖6 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CNE-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色）Fig 6 Effect of CNE-2 cell transfection on cell migratory and invasive abilities detected by transwell assay（crystal violet staining）

表4 CNE-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各組的遷移/侵襲率對(duì)比（±s）Tab 4 Comparison of migration / invasion rates in each group after transfection of CNE-2 cells（±s）

表4 CNE-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各組的遷移/侵襲率對(duì)比（±s）Tab 4 Comparison of migration / invasion rates in each group after transfection of CNE-2 cells（±s）

注：與inhibitor NC、blank group 相比，aP＜0.001；與mimics NC、blank group 相比，bP＜0.001。

侵襲1.42±0.06a 1.06±0.05 1.00±0.07 0.99±0.04 0.72±0.06b組別miR-454-3p inhibitor 組inhibitor NC 組blank group 組mimics NC 組miR-454-3p mimics 組遷移1.32±0.02a 1.04±0.01 1.00±0.02 1.00±0.02 0.71±0.04b

2.4 miR-454-3p 表達(dá)水平改變對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)（表4）顯示，同空白組和NC 組比較，當(dāng)過(guò)表達(dá)miR-454-3p 時(shí)細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)量可見(jiàn)減少（P＜0.001），空白組和mimics NC 組之間的穿膜細(xì)胞數(shù)幾乎沒(méi)有變化（P＞0.05）；當(dāng)抑制miR-454-3p 時(shí)細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)量可見(jiàn)增加（P＜0.001），空白組和inhibitor NC 組之間的穿膜細(xì)胞數(shù)幾乎沒(méi)有變化（P＞0.05）（圖6）。

2.5 Western blot 檢 測(cè)STAT3、EMT 相 關(guān) 蛋 白 的表達(dá)

Western blot結(jié)果（表5）顯示，鼻咽癌細(xì)胞CNE-2轉(zhuǎn)染之后，miR-454-3p mimics 組細(xì)胞的N-cadherin、STAT3和Vimentin的蛋白表達(dá)量減少，而E-cadherin蛋白表達(dá)量卻增多（均＜0.01）；空白組和mimics NC組之間各蛋白的表達(dá)變化差異不大（P＞0.05）（圖7）。miR-454-3p inhibitor組細(xì)胞的N-cadherin、STAT3和Vimentin 的蛋白表達(dá)量升高，而E-cadherin 蛋白表達(dá)量降低（均P＜0.05）；inhibitor NC 組和空白組之間各蛋白的表達(dá)變化差異不大（P＞0.05）（圖7）。

圖7 CNE-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后對(duì)STAT3 以及EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig 7 Impact of CNE-2 cell transfection on the expression of STAT3 as well as EMT-related proteins

表5 CNE-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各組的STAT3 以及EMT 相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s）Tab 5 Relative expression levels of STAT3 and EMT-related proteins of each group after transfection of CNE-2 cells（±s）

表5 CNE-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各組的STAT3 以及EMT 相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s）Tab 5 Relative expression levels of STAT3 and EMT-related proteins of each group after transfection of CNE-2 cells（±s）

注：與inhibitor NC、blank group 相比，aP＜0.01；與mimics NC、blank group 相比，bP＜0.01；與inhibitor NC、blank group 相比，cP＜0.05；與mimics NC、Blank group 相比，dP＜0.001。

Vimentin組別N-cadherin E-cadherin STAT3 1.29±0.02a 1.07±0.06 1.00±0.07 0.96±0.11 0.61±0.04d miR-454-3p inhibitor 組inhibitor NC 組blank group 組mimics NC 組miR-454-3p mimics 組1.40±0.02a 1.04±0.07 1.00±0.05 0.95±0.12 0.62±0.17b 0.69±0.20c 0.89±0.10 1.00±0.04 1.03±0.01 1.35±0.11b 1.38±0.10a 1.04±0.06 1.00±0.06 0.91±0.10 0.59±0.15b

3 討論

miR-454-3p 在不同腫瘤中發(fā)揮特定作用參與調(diào)控腫瘤的生長(zhǎng)與增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移、凋亡與自噬、藥物敏感性等［16-23］，在結(jié)直腸癌［16］、肝細(xì)胞癌［17］、乳腺癌［18］中作為致癌因子促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，而在膠質(zhì)母 細(xì) 胞 瘤［19］、食 管 癌［20］、膀 胱 癌［21］、急 性 髓 系 白 血?。?2］中則作為抑癌因子抑制腫瘤進(jìn)展。miR-454-3p在腫瘤中的不同作用可能與其不同靶點(diǎn)的功能有關(guān)，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中miR-454-3p 作為抑癌基因，通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控神經(jīng)分化因子1 促進(jìn)腫瘤侵襲遷移，并且可以逆轉(zhuǎn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA， lncRNA）00839 敲低時(shí)對(duì)腫瘤的抑制作用［24］。在非小細(xì)胞肺癌中，沙利度胺可以通過(guò)抑制含5 個(gè)PH 結(jié)構(gòu)域的反義RNA 1 促進(jìn)miR-454-3p 表達(dá)，miR-454-3p 再通過(guò)靶向E 盒結(jié)合鋅指蛋白1 抑制血管生成和免疫逃逸［25］。在喉癌中l(wèi)ncRNA HOTAIR 可以作為miR-454-3p 的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA，miR-454-3p 的減少靶向促進(jìn)人E2F 轉(zhuǎn)錄因子2 表達(dá)，從而使腫瘤細(xì)胞凋亡受到抑制且放射敏感性降低［26］。而在鼻咽癌中，miR-454-3p 通過(guò)靶向細(xì)胞間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化因子（cellular-mesenchymal epithelial transition factor ，c-Met）抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT，lncRNA 00839 可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-454-3p 位點(diǎn)，逆轉(zhuǎn)miR-454-3p 的抑制作用［27］。在順鉑耐藥的鼻咽癌細(xì)胞中miR-454-3p 表達(dá)量進(jìn)一步降低，沉默lncRNA HOXA11-AS 可以通過(guò)上調(diào)miR-454-3p 抑制c-Met/Akt/mTOR 通路的活性，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡并增加細(xì)胞的順鉑敏感性［28］。為了驗(yàn)證miR-454-3p 在鼻咽癌組織中的異常表達(dá)，使用PCR 檢測(cè)了鼻咽癌組織和正常組織中miR-454-3p 的表達(dá)差異，miR-454-3p在鼻咽癌患者組織中表達(dá)有所降低，提示miR-454-3p 有可能是鼻咽癌進(jìn)展中的一個(gè)調(diào)控因素。

為明確miR-454-3p 參與鼻咽癌進(jìn)展的具體機(jī)制，本研究運(yùn)用Targetscan 網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-454-3p 潛在的靶基因，發(fā)現(xiàn)STAT3 與miR-454-3p 存在結(jié)合區(qū)域。 STAT 家族是一大類轉(zhuǎn)錄因子，包含STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用［29-31］，其中，STAT1、STAT3 和STAT5 被認(rèn)為是影響腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵因子［32］。STAT1 參與抗腫瘤免疫反應(yīng)，而STAT3 和STAT5 則 促 進(jìn) 腫 瘤 的 發(fā) 生 發(fā) 展［33］。STAT3 在正常生理?xiàng)l件下受到嚴(yán)格調(diào)控，而在多種腫瘤中可被激活，不僅參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，還可通過(guò)表觀遺傳修飾影響基因的表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、調(diào)節(jié)微環(huán)境等促進(jìn)腫瘤發(fā)展進(jìn)程［34］。本研究著重討論miR-454-3p 與STAT3 的靶向關(guān)系及其對(duì)腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，EMT是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，當(dāng)細(xì)胞失去其上皮細(xì)胞身份并獲得間充質(zhì)細(xì)胞的特征時(shí)，不僅對(duì)發(fā)育和傷口愈合至關(guān)重要，而且代表了原發(fā)性腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移［35］。EMT 誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)生最明顯的分子變化是E-鈣粘蛋白（E-cadherin）下調(diào)，以及N-鈣粘蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）上調(diào)，這一過(guò)程中上皮標(biāo)志物水平顯著降低，迫使細(xì)胞獲得間充質(zhì)標(biāo)志物，促進(jìn)其運(yùn)動(dòng)［36］。研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中SIX 同源盒蛋白4（Sine oculis homeobox homolog 4，SIX4）表達(dá)顯著增加，誘導(dǎo)STAT3 信號(hào)觸發(fā)EMT，明顯促進(jìn)了乳腺癌癥細(xì)胞的遷移和侵襲，SIX4/STAT3 軸還可增強(qiáng)Snail1 的 表 達(dá)，以 刺 激 癌 癥 體 外EMT［37］。STAT3 是神經(jīng)膠質(zhì)瘤的致癌因子，應(yīng)用短發(fā)夾RNA 下調(diào)STAT3 的表達(dá)可以阻止EMT 機(jī)制，并顯著減少神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲［38］。在非小細(xì)胞肺癌中，泛素樣小蛋白4 抑制后能通過(guò)JAK2/STAT3 信號(hào)傳導(dǎo)抑制腫瘤的侵襲和遷移［39］。而在鼻咽癌組織中STAT3 表達(dá)升高，并且其升高程度與腫瘤的臨床分期、轉(zhuǎn)移能力以及預(yù)后密切相關(guān)［40，41］。

目前已發(fā)現(xiàn)miR-454-3p 可影響鼻咽癌EMT 進(jìn)程，STAT3 也與鼻咽癌的侵襲遷移密切相關(guān)，但是miR-454-3p 是否通過(guò)靶向STAT3 影響鼻咽癌EMT 仍未見(jiàn)報(bào)道。在軟骨肉瘤中曾證實(shí)過(guò)miR-454-3p 與STAT3 的直接靶向關(guān)系，lncRNA HOTAIR 敲低后miR-454-3p 表達(dá)上調(diào)并通過(guò)靶向STAT3 和自噬相關(guān)基因12 來(lái)抑制軟骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［42］。但是在鼻咽癌相關(guān)研究中只證明了miR-454-3p 與STAT3 二者之間存在間接調(diào)控關(guān)系，miR-454-3p 靶向調(diào)控D 型蛋白酪氨酸磷酸酶受體（protein tyrosine phosphatase receptor type D，PTPRD），PTPRD 過(guò)表達(dá)又可直接靶向STAT3 調(diào)節(jié)自噬相關(guān)細(xì)胞死亡，使NPC 細(xì)胞對(duì)放療敏感［43］。為明確miR-454-3p 與STAT3 的直接靶向關(guān)系及對(duì)鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的影響，本研究通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)STAT3 是miR-454-3p 的直接靶基因，miR-454-3p 能夠有效地抑制STAT3 的表達(dá)，人鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞的miR-454-3p 受到抑制后可以上調(diào)STAT3、N-cadherin 和Vimentin 蛋白表達(dá)，下調(diào)E-cadherin 蛋白表達(dá)，并且增強(qiáng)細(xì)胞侵襲和遷移的能力，而miR-454-3p 過(guò)表達(dá)時(shí)則完全相反，提示miR-454-3p 可能通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控STAT3 影響CNE-2 細(xì)胞的侵襲遷移能力及EMT 過(guò)程。本研究探討了miR-454-3p 調(diào)控鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，可為鼻咽癌靶向治療提供靶點(diǎn)及參考，但是還缺乏部分回復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-454-3p 對(duì)鼻咽癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響是否是通過(guò)靶向調(diào)控STAT3 實(shí)現(xiàn)的，后續(xù)還需繼續(xù)完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在多種lncRNA 可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-454-3p 位點(diǎn)來(lái)影響下游靶基因的表達(dá)，而miR-454-3p 也能通過(guò)調(diào)控多種靶基因影響腫瘤進(jìn)展，但是癌基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)錯(cuò)綜復(fù)雜，miR-454-3p及其相關(guān)的lncRNA、下游靶基因在鼻咽癌進(jìn)展中的作用仍值得進(jìn)一步深入探索。

綜上，miR-454-3p 在鼻咽癌組織中呈低表達(dá)，miR-454-3p 可能通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控STAT3 抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE-2 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。miR-454-3p 有望成為鼻咽癌靶向治療新的靶點(diǎn)，成為放化療的有效輔助治療，提高患者生存率。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

胡玉琳：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)操作，數(shù)據(jù)整理及分析，論文撰寫；農(nóng)豐靖：收集臨床標(biāo)本；林世童、羅麗霞：輔助實(shí)驗(yàn)操作；陳榮彬：收集部分臨床標(biāo)本；劉津：指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，修改手稿，提供經(jīng)費(fèi)支持。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。